堿基A或T;以及
[0030] 僅能夠切開AATT片段與TATT片段之一的限制性內切酶。
[0031] 上述試劑盒中還可以包括其它成分，例如PCR反應Mix(主要包括dNTPs，Mg2+，Taq DNApolymerase,TaqAntibody等）和用于實施測定的說明書等。
[0032] 本領域技術人員可以理解，除非有明顯抵觸，本發(fā)明的第一方面和第二方面的相 關特征可以相互組合。
[0033] 本發(fā)明的測定手段不但快速可靠，而且測定成本大大降低。
【附圖說明】
[0034]圖1描述了根據本發(fā)明的方法獲得的酶切產物電泳紫外照片。其中Marker是：標 準參考位置；泳道I:AA型測試結果；泳道2 :AT混合型測試結果；泳道3 :TT型測試結果。
【具體實施方式】
[0035] 下面對本發(fā)明進行詳細描述。本領域技術人員應當理解，以下詳細描述僅用于說 明而非限定本發(fā)明。
[0036] (1)待測DNA的獲取
[0037] 采集不同人群外周血，提取基因組DNA后進行下面的POTl基因rsl034794位點多 態(tài)性的測定。
[0038] 對于待測DNA的選擇，本發(fā)明并沒有特別的限制。既可以是從人體的體液或者組 織獲得離體樣本，還可以是經過預先降解處理的基因組。為了方便實施，通常優(yōu)選從血液提 取離體樣本。其中所述的組織包括人體中含有全部或至少POTl基因的組織，而與是否表達 該POTl基因無關。從體液和/或組織中提取DNA的方法是本領域技術人員公知的，并且可 以參考常用的分子生物學手冊，例如《分子克隆》第2版進行。
[0039] (2)引物設計與合成
[0040] 查找NCBI網站的Gene數據庫和SNP數據庫，分別獲得POTl基因全序列和 rsl034794多態(tài)位點信息。
[0041]rsl034794多態(tài)位點W前后部分堿基序列（堿基序列以5' 一 3'表示，大小寫意 義相同）如下（SEQIDNO:1):

[0044] 根據基因序列進行上游引物和下游引物設計，其中，下游引物引入錯配堿基。在最 終所得擴增產物上，下游引物的錯配堿基A與多態(tài)位點W的互補堿基之間相隔一個堿基T。
[0045] 在本發(fā)明中，下游引物具有錯配堿基A，且長度為35~60bp。其中一個實施例中， 引物如下，上游引物：5'CTATAAACCA ACCATCTGIT TAACATGCAA GGAIT 3'（SEQ ID N0:2),下 下游引物下劃線堿基為錯配堿基。
[0046] (3)制備PCR擴增產物
[0047] 根據上游引物和下游引物特征及PCR相應試劑制定PCR擴增程序和條件，制備PCR 擴增產物。其中一個實施例中，取基因組DNA(50~80ng)、上下游引物（終濃度為0. 1~ IUM)、2XPCR Mix 7. 5yL(包括4種dNTP混合物、Taq DNA polymerase、Taq Antibody、 Mg'緩沖液，DMSO和硫酸銨）和雙蒸水共同組成15 y L反應體系，調整溶液pH為7. 3左右。 PCR反應條件為：95°C預變性30s，95°C變性30s - 65°C退火30s - 72°C延伸20s共30個 循環(huán)，72°C延伸7min。PCR反應后獲得穩(wěn)定的擴增產物。
[0048] (4)酶切反應
[0049] 本發(fā)明采用MluCI內切酶，與多態(tài)位點附近堿基無錯配情況下可采用的HpyOMV 內切酶相比，其價格非常低廉，如表1所示。
[0050] 表I NEB公司幾種內切酶識別序列及其價格
[0051]
[0052] 其中一個實施例中，取PCR產物10yL，加入5U內切酶MluCI、2yLIOX酶切緩沖 液和7. 5yL雙蒸水組成20yL反應體系，37°C水浴中酶切4~12h，即得酶切產物，酶切產 物經1倍濃縮后電泳觀察。
[0053] (5)電泳測試
[0054] 其中一個實施例中，PCR產物經MluCI酶切后如果不能切開則仍為102bp，如果被 切開則出現58bp和44bp(由于MluCI酶切產生粘性末端使其互補鏈堿基數目不同，因此 切開后片段長度以基因序列上單鏈堿基數目為準來計算），其中44bp片段電泳圖中難以分 辨。
[0055] 將酶切產物在2~4%瓊脂糖凝膠中3~8V/cm條件下，電泳30~80min，于紫外 燈下拍照測定。酶切電泳見圖1，依據l〇2bp和58bp片段的有無判斷來判斷基因型：TT型 為102bp-個片段，AT型有102bp、58bp片段，AA型為58bp-個片段。
[0056] 下面是實施本發(fā)明的若干實施例。
[0057] 實施例1提取人外周血白細胞DNA測定rsl034794多態(tài)性
[0058] 1材料與方法
[0059] I. 1主要試劑及儀器
[0060] 試劑：2XPCRMix(包括 4 種dNTP混合物、TaqDNApolymerase、TaqAntibody、 Mg'緩沖液，DMSO和硫酸銨），限制性內切酶MluCI(NEB公司），瓊脂糖（Biowest公司），引 物由上海Sangon公司合成。
[0061] 儀器：9600 型PCR儀（PE公司），微型電泳槽（PharmaciaBiotech,EPS1000),Gel Doc2000凝膠成像儀（Bio-RAD公司）。
[0062] 1. 2從外周血白細胞中提取DNA作為待測基因組DNA模板
[0063] EDTA-K2抗凝管采集人外周血lmL，參考《實用流式細胞術彩色圖譜》中白細胞的分 離方法進行白細胞分離，參考《分子克隆》中氯化鈉鹽析法提取白細胞基因組DNA，并作為待 測人基因組DNA模板。
[0064] 1. 3序列查找及引物設計
[0065] 在NCBI網站查找POTl基因序列和rsl034794多態(tài)位點信息來設計引物，具體如 下：
[0066] 上游引物：5'CTATAAACCAACCATCTGTTTAACATGCAAGGATT3'（SEQIDN0:2);
[0067] 下游引物：5'AGGTTAAAATGACAACAAAGCAGGACCAITITCTTAAGATAAT3'（SEQID NO:3)；
[0068] 1.4PCR擴增
[0069] 取基因組DNA(50~80ng)、上下游引物（終濃度為0? 1~IyM)、2XPCRMix 7.5 11]^(包括4種(11^1：)混合物、1&9〇嫩。〇15〇116抑86、1&9 4111:;[130(17、]\%2+、緩沖液，〇]\130和 硫酸銨），滅菌雙蒸水補足15y1反應體系，調整溶液pH為7. 3左右。
[0070] PCR反應條件為：95°C預變性30s，95°C變性30s- 65°C退火30s- 72°C延伸20s 共30個循環(huán)，72°C延伸7min。PCR反應后獲得穩(wěn)定的擴增產物。
[0071] 1.5酶切鑒定
[0072] PCR擴增后，取PCR產物IOy1，加入5U內切酶MluCI、2yI10X酶切緩沖液和滅 菌雙蒸水組成20y1反應體系，37 °C水浴中酶切4h，即得酶切產物。
[0073] 上述酶切產物經1倍濃縮后，在3%瓊脂糖凝膠5V/cm條件下，電泳40min，于紫外 燈下拍照鑒定多態(tài)類型。
[0074] 2 結果
[0075] 2.IPCR擴增結果
[0076] 擴增后序列（其位于SEQIDNO: 1堿基序列中443-544處，共102bp)，所獲得的擴 增產物序列如下（SEQIDNO:4):
[0077]
[0078] 擴增后產物序列中下劃線部分分別為上游、下游引物所對應的序列，W代表A/T多 態(tài)即SNP位點rs1034794。
[0079] 2. 2酶切結果
[0080] 經內切酶MluCI酶切后的產物序列分別如下：
[0081] 該多態(tài)位點含有A等位基因時PCR產物酶切后可形成切開片段58bp(該片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加4個堿基）序列（SEQIDNO:5):
[0082] ctataaaccaaccatctgtttaacatgcaaggattatattcaaacttcaggatcatgc58
[0083] 該多態(tài)位點含有A等位基因時PCR產物酶切后可形成切開片段44bp(該片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列減少4個堿基）序列（SEQIDNO:6):
[0084]aattatcttaagaaaatggtcctgctttgttgtcattttaacct44
[0085] 酶切產物電泳后于紫外燈下拍照鑒定，結果示于圖1中。其中，rsl034794位點擴 增后出現l〇2bp片斷。經MluCI酶切后出現102bp、58bp、44bp三種片段（其中44bp在電 泳圖中不易分辨）。
[0086] 酶切后基因型判斷：酶切后基因型判斷：AA型為58bp-個片段，AT型有102bp和 58bp兩種片段，TT型為102bp-個片段。
[0087] 2. 3POTl基因rsl034794位點多態(tài)結果
[0088] 共檢測88例人員，檢測結果發(fā)現rs1034794位點出現TT型20例、AT型46例和 AA型22例。
[0089] 實施例2人外周血全血標本測定rsl034794多態(tài)性
[0090] 主要試劑及儀器同實施例1。參考《分子克隆技術》中酚-氯仿抽提法提取外周血 基因組DNA，并作為待測人基因組DNA模板。
[0091] 序列查找同實施例1，設計引物序列如下：
[0092] 上游引物：5'ATTACCTATAAACCAACCATCTGTTTAACATGCAAGGAT3'（SEQID NO:7)；
[0093]下游引物：5'GGTTAAAATGACAACAAAGCAGGACCATTTTCTTAAGATAAT3'（SEQID NO: 8)
[0094] 取基因組DNA(50~80ng)、上下游引物（終濃度為0? 1~IyM)、2XPCRMix 10UL(包