品用10%Na2CO3溶液洗滌至水層呈無(wú)色， 重結(jié)晶DBP半抗原中間體的步驟。
[0036] 優(yōu)選的，所述步驟A2還包括還原反應(yīng)完全后，用冰水和強(qiáng)堿溶液以終止反應(yīng)，萃 取反應(yīng)液，分離，除雜質(zhì)，干燥，層析柱分離純化DBP半抗原的步驟。
[0037] 第三方面，本發(fā)明還涉及一種鄰苯二甲酸二丁酯的人工免疫原DBP-BSA在用于痕 量塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯檢測(cè)中的用途，所述檢測(cè)采用免疫檢測(cè)法。
[0038] 優(yōu)選的，所述檢測(cè)體系的建立包括：
[0039] 所述人工免疫原通過(guò)生物體免疫反應(yīng)法制備得到抗鄰苯二甲酸二丁酯的特異性 抗體；
[0040] 所述鄰苯二甲酸二丁酯半抗原偶聯(lián)載體蛋白制得人工包被原；檢測(cè)時(shí)，該人工包 被原和鄰苯二甲酸二丁酯與抗鄰苯二甲酸二丁酯特異性抗體免疫球蛋白IgG發(fā)生特異性 識(shí)別的反應(yīng)，形成直接競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯檢測(cè)。
[0041] 本發(fā)明的鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原DBP-BSA的應(yīng)用，通過(guò)免疫動(dòng)物制備抗鄰 苯二甲酸二丁酯特異性抗體，能與鄰苯二甲酸二丁酯發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白 IgG反應(yīng)，用于水體、土壤、大氣等環(huán)境樣品和各類(lèi)食品中痕量塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯的 檢測(cè)。
[0042] 由于鄰苯二甲酸二丁酯是小分子物質(zhì)，只具有反應(yīng)原性而沒(méi)有免疫原性，而且該 分子上沒(méi)有能與蛋白質(zhì)分子直接結(jié)合的氨基、仲氨基等官能團(tuán)，故本發(fā)明通過(guò)選擇4-硝基 鄰苯二甲酸為原料，經(jīng)兩步反應(yīng)制備帶有氨基活性基團(tuán)的DBP半抗原，然后用重氮化法將 這個(gè)含氨基的半抗原與蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)制備人工免疫原，在將制備的免疫原對(duì)新西蘭大白 兔免疫，得到高特異性的抗鄰苯二甲酸二丁酯多克隆抗體，此抗體將用于建立針對(duì)鄰苯二 甲酸二丁酯的親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分析方法。
[0043] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0044] (1)抗原實(shí)用性強(qiáng)：鄰苯二甲酸二丁酯抗原制備和抗體制備具有重要的實(shí)用價(jià) 值和現(xiàn)實(shí)意義。利用本專(zhuān)利中的方法，首次成功制備了鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原DBP-BSA。該人工免疫原保留了鄰苯二甲酸二丁酯的結(jié)構(gòu)，具有針對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯的抗 原決定簇，為制備特異性好、效價(jià)高的抗體和建立親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分析方 法提供了保障。
[0045] (2)抗原穩(wěn)定性好：此法合成的鄰苯二甲酸二丁酯人工抗原具有較好的穩(wěn)定性， 在0~4°C環(huán)境下可保存1年不變性，_20°C環(huán)境下可保存3年。
[0046] (3)抗原制備技術(shù)簡(jiǎn)便可行：抗原的整個(gè)制備過(guò)程無(wú)需特別的儀器設(shè)備，成本低 廉，容易工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0047] 通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0048] 圖1為鄰苯二甲酸二丁酯半抗原和鄰苯二甲酸二丁酯人工免疫原的合成路線(xiàn)圖；
[0049] 圖2為鄰苯二甲酸二丁酯半抗原紅外光譜；
[0050] 圖3為鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的核磁共振譜圖；
[0051] 圖4為鄰苯二甲酸二丁酯半抗原、載體蛋白和人工免疫原紫外吸收光譜圖；
[0052] 圖5為免疫新西蘭大白兔產(chǎn)生的抗DBP抗體效價(jià)的變化；
[0053] 圖6為間接競(jìng)爭(zhēng)親和素-生物素化酶聯(lián)免疫吸附分析方法檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0055] 實(shí)施例1、鄰苯二甲酸二丁醅半抗原的制備與表征
[0056] 鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的合成路線(xiàn)圖如圖1所示：
[0057] (1)鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的制備
[0058] 稱(chēng)取IOg(0. 0474mol) 4-硝基鄰苯二甲酸加入到圓底燒瓶中，隨后緩慢加入 26.lmL(0. 2850mol)正丁醇，邊攪拌邊加入I. 65mL(0. 0304mol) *H2S04催化，逐漸升溫至 120°C回流加熱6. 5小時(shí)，直至薄板層析法（TLC)檢測(cè)原料點(diǎn)消失為止（顯色劑：丙酮溶劑 中溶解少量的高錳酸鉀；展開(kāi)劑，正己烷：乙酸乙酯=5:1);反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸餾除去未反應(yīng)的正丁醇和生成的水，再趁熱將液體倒入冰水中，磁力攪 拌5min后靜置一段時(shí)間分層，將下層黃色油狀液體用10%似20)3溶液洗滌至水層呈無(wú)色 (pH7. 0-8. 0)，再用無(wú)水Na2S0#水干燥，得到黃色油狀液體4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯即 DBP半抗原中間體。
[0059] 稱(chēng)取I. 5g(0. 0046mol)DBP半抗原中間體（4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯）裝入容積 為500mL三口圓底燒瓶底部，隨后向瓶底邊攪拌邊加入230mL(2. 5871mol)苯，待4-硝基鄰 苯二甲酸二丁酯被苯溶解后再加入2. 80g(0. 0428mol)純鋅粉，攪拌均勻后分次加入8. 2mL 濃HCl(0. 0984mol)，室溫?cái)嚢?5min后再次加入2. 80g(0. 0428mol)純鋅粉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) 12h，薄板層析法（TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)直至反應(yīng)完全；反應(yīng)結(jié)束后，將280mL冷水加入反應(yīng)體系， 并用IMNaOH溶液中和至弱堿性（pH7. 0-8.5);靜置Ih后分離并保留苯層，再用苯萃取水 層，合并萃取液，有機(jī)相經(jīng)水洗后用無(wú)水Na2SOJ^水干燥以除去多余的水分；有機(jī)相減壓蒸 餾以除去苯，得到的粗品再用硅膠柱層析（洗脫劑為乙酸和正己烷的混合液（V/V= 1:10)) 后減壓蒸餾，得到淡黃色晶體4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯即DBP半抗原。鄰苯二甲酸二丁酯 半抗原分子式=C16H23NO4;分子量293. 35 ;產(chǎn)率89. 8% ;熔點(diǎn)：68~69°C，純度99%。
[0060] (2)鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的鑒定
[0061] 將制得的半抗原經(jīng)紅外光譜（圖2)、核磁共振光譜（圖3)鑒定，結(jié)果為： IR(KBr)V/cm ^3451. 79, 3362. 77 (-NH2)，1716. 12(C= 0)，1290. 51，1142. 57 (C-O-C)， 2956. 59, 2871. 60 (-CH3)，1458. 28 (d-0CH2-)，1602. 04, 1565. 54, 1476. 69(C=C)， 1682.88,850.77(C-H，Ar)!1HNMR(400MHz，CDCl3) :5 7. 71 (d，lH，ArH)，7.24 (d，lH，ArH)， 6. 96 (d, 1H,ArH)，4. 28 (t，2H，OCH2)，4. 24 (t，2H，OCH2)，4. 22 (b, 2H, -NH2)， I. 69-1. 64 (m, 4H,OCH2CH2)，I. 43-1. 38 (m, 4H,OCH2CH2CH2)，0? 93 (t, 6H,OCH2CH2CH2CH3)ppm。紅 外、核磁表征結(jié)果表明，DBP半抗原具有-NH2、-0-CH2CH2CH2CH3、苯環(huán)等基團(tuán)的特征吸收峰，證 明制備的DBP半抗原分子中含有氨基官能團(tuán)，最終實(shí)驗(yàn)中成功制備了DBP半抗原。
[0062] 從以上分析可知，所合成的產(chǎn)物為目標(biāo)物。
[0063] 實(shí)施例2、鄰苯二甲酸二丁醅半抗原的合成
[0064] 鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的合成路線(xiàn)圖如圖1所示：
[0065] (1)鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的制備
[0066] 稱(chēng)取IOg(0. 0474mol) 4-硝基鄰苯二甲酸加入到圓底燒瓶中，隨后緩慢加入 26. 0mL(0. 2844mol)正丁醇，邊攪拌邊加入I.28mL(0. 0237mol)濃H2SO4催化，逐漸升溫至 130°C回流加熱6小時(shí)，直至薄板層析法（TLC)檢測(cè)原料點(diǎn)消失為止（顯色劑：丙酮溶劑中 溶解少量的高錳酸鉀；展開(kāi)劑，正己烷：乙酸乙酯=5:1);反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀中減壓蒸餾除去未反應(yīng)的正丁醇和生成的水，再趁熱將液體倒入冰水中，磁力攪拌 5min后靜置一段時(shí)間分層，將下層黃色油狀液體用10%似20)3溶液洗滌至水層呈無(wú)色（pH 7. 0-8. 0)，再用無(wú)水Na2SOJ^水干燥，得到黃色油狀液體4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯即DBP 半抗原中間體。
[0067] 稱(chēng)取I. 5g(0. 0046mol)DBP半抗原中間體（4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯）裝入容積 為500mL三口圓底燒瓶底部，隨后向瓶底邊攪拌邊加入229mL(2. 5760mol)苯，待4-硝基鄰 苯二甲酸二丁酯被苯溶解后再加入2. 71g(0. 0414mol)純鋅粉，攪拌均勾后分次加入8.ImL 濃HCl(0. 0966mol)，30°C攪拌15min后再次加入2. 71g(0. 0414mol)純鋅粉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng) l〇h，薄板層析法（TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)直至反應(yīng)完全；反應(yīng)結(jié)束后，將271mL冷水加入反應(yīng)體系， 并用IMNaOH溶液中和至弱堿性（pH7. 0-8.5);靜置Ih后分離并保留苯層，再用苯萃取水 層，合并萃取液，有機(jī)相經(jīng)水洗后用無(wú)水Na2SOJ^水干燥以除去多余的水分；有機(jī)相減壓蒸 餾以除去苯，得到的粗品再用硅膠柱層析（洗脫劑為乙酸和正己烷的混合液（V/V= 1:10)) 后減壓蒸餾，得到淡黃色晶體4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯即DBP半抗原。鄰苯二甲酸二丁酯 半抗原分子式=C16H23NO4;分子量293. 35 ;產(chǎn)率90. 2% ;熔點(diǎn)：68~69°C，純度99%。
[0068](2)鄰苯二甲酸二丁酯半抗原的鑒定
[0069] 將制得的半抗原經(jīng)紅外光譜（圖2)、核磁共振光譜（圖3)鑒定，結(jié)果為： IR(KB