表示、AGGTCA基序用下劃曲線表示。TaASG004-l啟動(dòng)子中有5個(gè)AGAAA基序和12個(gè)GTGA基序，TaASG004-2啟動(dòng)子中有7個(gè)AGAAA基序、11個(gè)GTGA基序和I個(gè)AGGTCA基序，TaASG004_3啟動(dòng)子中有5個(gè)AGAAA基序和8個(gè)GTGA基序。AGAAA基序、GTGA基序和AGGTCA基序是與花粉/花藥特異表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件，TaASG004-l啟動(dòng)子、TaASG004_2啟動(dòng)子和TaASG004-3啟動(dòng)子中多個(gè)AGAAA基序、GTGA基序和AGGTCA基序的存在表明該啟動(dòng)子可能是與花粉/花藥特異表達(dá)有關(guān)的啟動(dòng)子。
[0014]為了進(jìn)一步驗(yàn)證這兩個(gè)啟動(dòng)子的功能，將其中一個(gè)啟動(dòng)子SEQ ID N0:7與報(bào)告基因GUS相連，轉(zhuǎn)化植物，在轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖和葉等營(yíng)養(yǎng)器官中都檢測(cè)不到GUS基因的表達(dá)，在花粉處于減數(shù)分裂期的穗子、單核期花藥、花粉處于單核期、雙核期和三核期的除花藥以外的其它花器官中也檢測(cè)不到⑶S基因的表達(dá)，TaASG004-3啟動(dòng)子只能啟動(dòng)⑶S基因在花粉處于雙核期和三核期的花藥中表達(dá)，說(shuō)明本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子是一個(gè)花粉發(fā)育晚期花藥特異表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0015]本發(fā)明所提供的植物花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子，含有序列表中SEQ ID N0:5、6或7所示的核苷酸序列，或包含與SEQ ID N0:5、6或7所列核苷酸序列具有90%以上相似性的核苷酸序列，或包含來(lái)源于SEQ ID N0:5、6或7序列上的100個(gè)及100以上連續(xù)的核苷酸片段，并且可以驅(qū)動(dòng)與該啟動(dòng)子操作性連接的核苷酸序列在植物花藥中的表達(dá)。含有上述序列的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系以及宿主菌等均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增本發(fā)明所公開(kāi)的SEQ ID N0:5、6或7啟動(dòng)子的任一核苷酸片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0016]本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子核苷酸序列還可用于從小麥以外的其它植物中分離相應(yīng)序列，尤其是從其他單子葉植物中進(jìn)行同源克隆。根據(jù)這些相應(yīng)序列與本文所列啟動(dòng)子序列間的序列同源性，或與本啟動(dòng)子基因的同源性，使用如PCR、雜交等技術(shù)來(lái)鑒別分離這些相應(yīng)序列。因此，根據(jù)它們與本發(fā)明所列的SEQ ID N0:5、6或7啟動(dòng)子序列(或其片段)間的序列相似性而分離的相應(yīng)片段，也包括在實(shí)施方案中。
[0017]本發(fā)明所述的“啟動(dòng)子”是指一種DNA調(diào)控區(qū)域，其通常包含能指導(dǎo)RNA聚合酶II在特定編碼序列的合適轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起始RNA合成的TATA盒。啟動(dòng)子還可包含其它識(shí)別序列，這些識(shí)別序列通常位于TATA盒的上游或5’端，通常被稱為上游啟動(dòng)子元件，起調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，雖然已經(jīng)鑒定了針對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列，但是分離和鑒定處于本發(fā)明鑒定的特定啟動(dòng)子區(qū)域的TATA盒上游區(qū)域的其它調(diào)控元件也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本文公開(kāi)的啟動(dòng)子區(qū)域通常被進(jìn)一步界定為包含上游調(diào)控元件，例如用于調(diào)控編碼序列的組織表達(dá)性和時(shí)間表達(dá)功能的那些元件、增強(qiáng)子等。以相同的方式，可以鑒定、分離出使得能在目標(biāo)組織(例如雄性組織)中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子元件，將其與其它核心啟動(dòng)子一起使用，以驗(yàn)證雄性組織優(yōu)先的表達(dá)。核心啟動(dòng)子指起始轉(zhuǎn)錄所需的最小限度的序列，例如被稱為T(mén)ATA盒的序列，這是編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子通常都具有的。因此，可選地，本發(fā)明所述的SEQ IDN0:5、6或7啟動(dòng)子可與其自身的或來(lái)自其它來(lái)源的核心啟動(dòng)子關(guān)聯(lián)使用。
[0018]核心啟動(dòng)子可以是任何一種已知的核心啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒35S或19S啟動(dòng)子(美國(guó)專利N0.5，352，605)、泛素啟動(dòng)子(美國(guó)專利N0.5，510，474)、IN2核心啟動(dòng)子(美國(guó)專利N0.5，364，780)或玄參花葉病毒啟動(dòng)子。
[0019]所述基因啟動(dòng)子的功能可以通過(guò)以下方法進(jìn)行分析:將啟動(dòng)子序列與報(bào)告基因可操作性連接，形成可轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體，再將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)入植株中，在獲得轉(zhuǎn)基因后代中，通過(guò)觀察報(bào)告基因在植物各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況來(lái)確認(rèn)其表達(dá)特性；或者將上述構(gòu)建體亞克隆進(jìn)用于瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的表達(dá)載體，通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)啟動(dòng)子或其調(diào)控區(qū)的功能
[0020]用來(lái)測(cè)試啟動(dòng)子或調(diào)控區(qū)域功能的適當(dāng)表達(dá)載體的選擇將取決于宿主和將該表達(dá)載體引入宿主的方法，這類方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。對(duì)于真核生物，在載體中的區(qū)域包括控制轉(zhuǎn)錄起始和控制加工的區(qū)域。這些區(qū)域被可操作地連接到報(bào)告基因，所述報(bào)告基因包括YFP、UidA、GUS基因或熒光素酶。包含位于基因組片段中的推定調(diào)控區(qū)的表達(dá)載體可以被引入完整的組織，例如階段性花藥，或引入愈傷組織，以進(jìn)行功能驗(yàn)證。
[0021]啟動(dòng)子的活性和強(qiáng)度可以根據(jù)其驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)量來(lái)測(cè)定。報(bào)告基因(reporter gene)是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)確定目的基因的表達(dá)調(diào)控特性。常用的報(bào)告基因有β -葡萄糖苷酸酶基因GUS，和綠色熒光蛋白基因GFP。
[0022]本發(fā)明通過(guò)⑶S報(bào)告基因來(lái)檢測(cè)啟動(dòng)子的活性和表達(dá)特性。根據(jù)⑶S基因檢測(cè)所用的底物不同，有三種檢測(cè)方法:組織化學(xué)法、分光光度法和熒光法(靈敏度為分光光度檢測(cè)法最尚)，其中最為常用的是組織化學(xué)法。組織化學(xué)法檢測(cè)以5_漠_4_氣_3_H引噪-β -匍萄糖苷酸(X-Gluc)作為反應(yīng)底物。將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡，若組織細(xì)胞轉(zhuǎn)入了⑶S基因，并表達(dá)出了⑶S酶蛋白，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物，這是由其初始產(chǎn)物經(jīng)氧化二聚作用形成的靛藍(lán)染料，它使各組織細(xì)胞中有GUS表達(dá)活性的部位或位點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出GUS活性的強(qiáng)弱。因此利用該方法可觀察到外源基因在特定器官、組織，甚至單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。
[0023]此外，本發(fā)明的啟動(dòng)子可與并非TaASG004-l、TaASG004_2或TaASG004_3基因的核苷酸序列相連，以表達(dá)其它異源核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子核苷酸序列及其片段和變體可與異源核苷酸序列一起組裝在一個(gè)表達(dá)盒中，用于在目的植株中表達(dá)，更具體地，在該植株的雄性器官中表達(dá)。所述表達(dá)盒有合適的限制性酶切位點(diǎn)，用于插入所述啟動(dòng)子和異源核苷酸序列。這些表達(dá)盒可用于對(duì)任何植株進(jìn)行遺傳操作，以獲得想要的相應(yīng)表型。
[0024]本發(fā)明所公開(kāi)的TaASG004_l啟動(dòng)子、TaASG004_2啟動(dòng)子和TaASG004_3啟動(dòng)子，可用于驅(qū)動(dòng)下列異源核苷酸序列的表達(dá)，以使轉(zhuǎn)化的植株獲得雄性不育的表型。所述異源核苷酸序列可編碼促使碳水化合物降解的酶或修飾酶、淀粉酶、脫支酶和果膠酶，更具體的如a淀粉酶基因、生長(zhǎng)素(auxin)，rot B、細(xì)胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、親和素，或者可選自原核調(diào)控系統(tǒng)，還可以是顯性的雄性不育基因。
[0025]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明中所提到的可操作地連接在本發(fā)明啟動(dòng)子下游的核酸，其中所述的“核酸”可以是操作性連接于本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子之上的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA。
[0026]本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子序列可分離自任何植物，包括但不限于蕓苔屬、玉米、小麥、高粱、兩節(jié)薺屬、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、大豆、擬南芥屬、菜豆屬、花生、苜蓿、燕麥、油菜籽、大麥、燕麥、黑麥(Rye)、粟、蜀黍、小黑麥、單粒小麥、斯佩爾特小麥(Spelt)、雙粒小麥、亞麻、格蘭馬草(Gra_a grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麥草、甘鹿、紅莓苔子、番木瓜、香蕉、紅花、油棕、香瓜、蘋(píng)果、黃瓜、石斛、劍蘭、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、蕓苔、甜菜、咖啡、觀賞植物和松類等。優(yōu)選地，植物包括玉米、大豆、紅花、芥菜、小麥、大麥、黑麥、稻、棉花和高粱。
[0027]本發(fā)明還包括含有TaASG004_l啟動(dòng)子、TaASG004_2啟動(dòng)子或TaASG004_3啟動(dòng)子的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括通常所說(shuō)的載體或表達(dá)盒。上述構(gòu)建體中還可包括其它組分，這主要取決于載體構(gòu)建的目的和用途，例如可進(jìn)一步包括選擇標(biāo)記基因、靶向或調(diào)控序列、穩(wěn)定序列或引導(dǎo)序列、內(nèi)含子等。表達(dá)盒還將在目標(biāo)異源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子。終止子可以是本發(fā)明所提供基因的終止子，也可以是來(lái)自外源的終止子。更具體地，上述終止子可以是胭脂氨酸合酶或章魚(yú)堿合酶終止區(qū)域。
[0028]在希望將異源核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物引向特定細(xì)胞器，例如質(zhì)體、造粉體，或者引向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或在細(xì)胞表面或細(xì)胞外分泌的情況下，表達(dá)盒還可包含用于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列。此類轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域所公知的，其包括但不限于Rubisco的小亞基、植物EPSP合酶、玉米Brittle-1葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽等。
[0029]在制備表達(dá)盒的過(guò)程中，可對(duì)多種DNA片段加以操作，以提供處于合適方向，或是處于正確讀碼框中的DNA序列。為達(dá)到此目的，可使用銜接子或接頭，將DNA片段連起來(lái)，或者進(jìn)一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位點(diǎn)等。
[0030]進(jìn)一步地，本發(fā)明所提供的構(gòu)建體中還可包括選擇標(biāo)記基因，用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。所述選擇標(biāo)記基因包括賦予抗生素抗性或?qū)Τ輨┛剐缘幕颉：线m的選擇標(biāo)記基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，鏈霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺類抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁嶙抗性基因。所述選擇標(biāo)記基因還可以是紅色熒光基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、花青甙Pl等基因。
[0031]本發(fā)明所提供的表達(dá)盒或載體可被插入質(zhì)粒、粘粒、酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體或其他適合轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中的任何載體中。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，尤其是用于克隆或儲(chǔ)存多核苷酸、或用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、根瘤土壤桿菌和毛根土壤桿菌。當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時(shí)，