一種用于預(yù)示牦牛肌肉嫩度的pcr-sscp引物對及檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物分子生物學與基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于預(yù)示牦牛肌 肉嫩度的PCR-SSCP引物對及檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛肉嫩度受宰前和宰后的多種因素影響，但遺傳對其也有重要作用。目前對普通 牛肌肉嫩度從分子水平開展了大量研宄，定位了一些與嫩度有關(guān)的QTL或主基因，確定了 一些牛肉嫩度候選基因并闡明了其結(jié)構(gòu)和群體遺傳多態(tài)性，篩選出與牛肉嫩度緊密連鎖的 分子標記，部分分子標記已通過GeneSTAR Tenderness等開展商業(yè)檢測。
[0003] 鈣蛋白酶水解系統(tǒng)是一個普遍存在于人和動物機體內(nèi)的高度復(fù)雜的調(diào)控體系， 主要由鈣蛋白酶（CAPN)及鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST)、骨骼肌特異性鈣蛋白酶（P94)組成。 CAPN降解肌細胞肌原纖維，CAST高效、專一性的抑制CAPN的水解，即CAST廣泛存在于細 胞內(nèi)，可以識別鈣離子激活后引起的鈣蛋白酶構(gòu)象變化，并與之結(jié)合，從而抑制鈣蛋白酶活 性。CAST作為CAPN內(nèi)源性特異抑制因子，屠宰后24h CAST的活性通常能解釋牛肉嫩度約 40%的差異，因此也確定為嫩度候選基因。普通牛CAST基因位于第7號染色體，CAST基因 突變與一些普通牛品種的肌肉嫩度相關(guān)；豬CAST基因?qū)ωi肉的蒸煮損失、系水力、多汁性、 背膘厚、大理石花紋等均有影響；綿羊CAST基因表達量與背最長肌失水率相關(guān)。
[0004] 牦牛是青藏高原及其周邊高寒牧區(qū)的特有牛種，也是重要的生產(chǎn)和生活資源。近 年來，國內(nèi)外從比較基因組學、牦牛起源、演化和分類等方面，對牦牛遺傳特性開展了較多 研宄，也對一些重要經(jīng)濟性狀候選基因進行了探索，但均未見報道相應(yīng)基因?qū)﹃笈＜∪饽?度的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種用于預(yù)示牦牛肌肉嫩度的PCR-SSCP引物對及檢測試劑盒。
[0006] 本發(fā)明以CAST基因作為肌肉嫩度性狀候選基因，研宄其預(yù)示和檢測牦牛肌肉嫩 度性狀的分子標記方法，為牦牛肉質(zhì)改良提供技術(shù)支撐。
[0007] 本發(fā)明提供一種用于預(yù)示牦牛肌肉嫩度的PCR-SSCP引物對，所述引物對為： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr ； CAST-R :5^ -TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3^。
[0008] 本發(fā)明還提供一種用于預(yù)示牦牛肌肉嫩度的PCR-SSCP檢測試劑盒，所述試劑盒 包含以下引物對： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr ； CAST-R :5^ -TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3^。
[0009] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括牦牛CAST*D的DNA標準樣，所述CAST*D的DNA標準樣 的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No. 4。
[0010] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述試劑盒的使用方法，步驟如下： (1) 樣品米集和DNA的提?。?(2) 待測樣本DNA的PCR擴增；所用引物為： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr , CAST-RiSr -TAcAccCTGCTTTGTCCTCCA-Sr ； (3) SSCP電泳：將CAST*D的DNA標準樣和待測樣本DNA同時進行SSRP電泳，電泳結(jié)束 后染色判定基因型，攜帶等位基因 CAST*D的待測樣本肌肉嫩度高。
[0011] 優(yōu)選地，所述PCR擴增時的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，64°C退 火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0012] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種牦牛肌肉嫩度性能的預(yù)示方法，步驟如下： (1) 樣品米集和樣品DNA的提?。?(2) 待測樣本DNA的PCR擴增；所用引物為： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr , CAST-RiSr -TAcAccCTGCTTTGTCCTCCA-Sr ； (3) SSCP電泳：將CAST*D的DNA標準樣和待測樣本DNA同時進行SSRP電泳，電泳結(jié)束 后染色判定基因型，攜帶等位基因 CAST*D的待測樣本肌肉嫩度高。
[0013] 優(yōu)選地，所述PCR擴增時的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，64°C退 火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0014] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種牦牛肌肉嫩度性能的分子選種方法，步驟如下： (1) 樣品米集和DNA的提?。?(2) 待測樣本DNA的PCR擴增；所用引物為： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr , CAST-RiSr -TAcAccCTGCTTTGTCCTCCA-Sr ； (3) SSCP電泳：將CAST*D的DNA標準樣和待測樣本DNA同時進行SSRP電泳，電泳結(jié)束 后染色判定基因型，選擇攜帶CAST*D待測樣本，即為肌肉嫩度高的牦牛個體。
[0015] 優(yōu)選地，所述PCR擴增時的反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min ;94°C變性30s，64°C退 火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0016] 本發(fā)明的第六個目的是提供上述引物對、試劑盒或CAST*D的DNA標準樣在檢測和 預(yù)示牦牛肌肉嫩度性狀以及牦牛肌肉嫩度分子選種中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明根據(jù)牦牛CAST第3內(nèi)含子區(qū)基因序列設(shè)計了一對引物，對牦?；蚪MDNA 進行PCR擴增后進行SSCP分型篩選檢測，通過分析帶型確定牦牛CAST基因型和等位基因， 通過等位基因序列比對確定SNPs突變，并分析CAST基因突變對肌肉嫩度剪切力值的影響。 本發(fā)明的方法采用PCR-SSCP技術(shù)，通過對牦牛CAST基因的不同基因型、等位基因檢測，從 而預(yù)測該牛的肌肉嫩度優(yōu)劣。本發(fā)明的優(yōu)點是反應(yīng)靈敏、特異性強、操作簡單、精確度高，可 進行快速檢測。
【附圖說明】
[0018] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為本發(fā)明的牦牛肌肉嫩度性狀候選基因 CAST的等位基因 SSCP帶型圖。
【具體實施方式】
[0019] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的試驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常 規(guī)生化試劑。下面以甘南牦牛CAST基因分型及肌肉嫩度預(yù)測技術(shù)的建立為例，對本發(fā)明內(nèi) 容進行詳細的說明。
[0020] 實施例1 設(shè)計牦牛肌肉嫩度候選基因 CAST的PCR-SSCP檢測引物，具體為： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr ； CAST-R :5' -TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3'。引物由北京六合華大基因公司合成。
[0021] 實施例2制備牦牛肌肉嫩度候選基因的PCR-SSCP檢測試劑盒 牦牛肌肉嫩度候選基因 CAST的PCR-SSCP檢測試劑盒包括有PCR反應(yīng)液，CAST*D的DNA 標準樣；去離子水，10%過硫酸按，上樣變性緩沖液，TEMED (四甲基乙二胺)，12%非變性聚丙 稀酰胺凝膠Acr: Scr=39:1 ; 其中，上樣變性緩沖液包括98%去離子甲酰胺、0. 025%溴酚藍、0. 025%二甲苯氰、10 mmol/L EDTA，pH8.0 ; PCR反應(yīng)的反應(yīng)液：總體積20 μ L，其中DNA模板0.8 μ L，上、下游引物各0.4 μ L， TaKaRa Premix Taq 聚合酶 11 μ L，滅菌超純水 7· 4 μ L0
[0022] CAST*D 的 DNA標準樣的核苷酸序列為：cgtagtgatgctttctaaggcccacttgacttcac attccaggatatctggctctaggtgagtgatcacaccatcgtgattatcttggtcgtgaagatctctaggtgagata aaaccaaggtaaagagttaaaagtaagtatggttaaaagggacttccaccatgactcatttggtaaagaatctgcct gcaatgcaagagacccagcttccatccctgggtcaggaagatcccctagagaagggaatggcaacttactccagtat tcttgcctggagaattccattgacagagaaaccctgcaggctacagttcatgaggttgcaaagagtcggccacgatt gagtgactaacactactacactgctgtggttaaaaggaggtggaggacaaagcagggtgta 實施例3應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測牦牛肌肉嫩度候選基因的方法 (1) 樣品米集：耗牛頸靜脈米血10ml，A⑶抗凝，_70°C凍存； (2) 基因組DNA的提取：用苯酚-氯仿法從凍存血樣中提取基因組DNA ; (3) 聚合酶鏈式反應(yīng)： PCR反應(yīng)體系：總體積 20 μ L，DNA模板 0· 8 μ L，引物 CAST-F和 CAST-R各0· 4 μ L，TaKaRa Premix Taq聚合酶IlyL，滅菌超純水7. 4yL;反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性2 min;94°C變性30 s，64°C退火30 s，72°C延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72°C延伸10 min; 引物序列為： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr ； CAST-R :5^ -TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3^。
[0023] (4 ) PCR 產(chǎn)物的 SSCP 檢測： 取2 μ L的PCR產(chǎn)物加入8 μ L變性上樣緩沖液（98%去離子甲酰胺、0. 025%溴酚藍、 0. 025%二甲苯氰、10 mmol/L EDTA pH8. 0)，98°C變性5min，迅速冰浴5min后，上樣到 10%非 變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr: Scr=39:1)，300V電壓、電泳室溫度4°C、電泳槽水循環(huán)溫度4°C 電泳18h，銀染法顯色后判定基因型。
[0024] (5)結(jié)果判斷： 通過對牦牛因第三內(nèi)含子的PCR-SSCP檢測，發(fā)現(xiàn)有6個等位基因，對牦牛肌肉 嫩度具有影響的等位基因為CAST*D ;對牦牛肌肉嫩度無影響的等位基因為CAST*A、*B、*C、 *E 和 *F。
[0025] 控制牦牛肌肉嫩度的等位基因為CAST*D的核苷酸序列為： cgtagtgatgctttctaaggcccacttgacttcacattccaggatatctggctctaggtgagtgatcacac catcgtgattatcttggtcgtgaagatctctaggtgagataaaaccaaggtaaagagttaaaagtaagtatggtta aaagggacttccaccatgactcatttggtaaagaatctgcctgcaatgcaagagacccagcttccatccctgggtca ggaagatcccctagagaagggaatggcaacttactccagtattcttgcctggagaattccattgacagagaaaccct gcaggctacagttcatgaggttgcaaagagtcggccacgattgagtgactaacactactacactgctgtggttaaaa ggaggtggaggacaaagcagggtgta 對牦牛肌肉嫩度無影響的等位基因為CASI^A的核苷酸序列為：cgtagtgatgctttctaag gcccacttgacttcacattccaggatatctggctctaggtgagtgatcacaccatcgtgattatcttggtcgtgaag atctctaggtgagataaaaccaaggtaaagagttaaaagtaagtatggttaaaagggacttccaccatgactcattt ggtaaagaatctgcctgcaatgcaagagacccagcttccatccctgggtcaggaagatcccctagagaagggaatgg caacttactccagtattcttgcctggagaattccattgacagagaaacccggcaggctacagttcatgaggttgcaa agagtcggccacgattgagtgactaacactactacactgctgtggttaaaaggaggtggaggacaaagcagggtgta 對牦牛肌肉嫩度無影響