一種常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物 的方法，是一種在常溫等溫條件下，對多個核酸目標物同時進行快速、實時、特異性檢測的 方法，可在體外臨床檢測、食品安全、生物安全以及農(nóng)業(yè)領域具有廣闊的應用前景。
【背景技術】
[0002] 核酸等溫擴增技術是一類分子生物學技術的總稱，它們能在某一特定溫度下保持 恒定，實現(xiàn)特定DNA或RNA片段拷貝數(shù)快速增加的過程。在核酸擴增技術領域里，以聚合酶 鏈式反應（PCR)為代表的核酸非等溫擴增技術，在過去的20年里，已在疾病的臨床診斷方 面，以其快速、靈敏和特異的優(yōu)勢，日益取代了傳統(tǒng)的診斷方法，并也使一些之前無法完成 的診斷成為可能。以微生物病原體的診斷為例，傳統(tǒng)的金標法培養(yǎng)法與后續(xù)發(fā)展的免疫檢 測法，都存在檢測時間過長、操作繁瑣、以及靈敏性與特異性一般等缺點。但是PCR擴增可 將原本需要幾天，甚至半個月才獲得結果的檢測流程簡化至1-2天，給臨床診斷檢測領域 帶來了質(zhì)的飛越。
[0003] 由于PCR是以物理反復式變溫方式不斷產(chǎn)生線性DNA模板進行擴增與復制，因此， 其注定需依賴溫度循環(huán)儀（thermocycler)實現(xiàn)檢測。相比而言，核酸擴增技術的新分支， 核酸等溫擴增技術則具有更大的優(yōu)勢。因為此類擴增反應的全過程均在同一溫度條件下進 行，使對儀器的精密程度要求大大簡化，反應時間也相應明顯縮短。例如可通過金屬浴、水 浴鍋、甚至是孵育箱或室溫即可完成反應，因而它們更能滿足現(xiàn)場、臨床、突發(fā)性或應急性 檢測的需求，進而具有更大、更廣泛的應用價值。
[0004] 正是基于核酸等溫擴增技術的廣闊應用前景，世界各國都在此領域進行積極與廣 泛的研宄。目前技術成熟且研宄較多的核酸等溫擴增技術主要包括以下幾種：環(huán)介導核酸 等溫擴增技術（Loop mediated isothermal amplification, LAMP)，依賴于核酸序列的擴 增技術（NASBA)，滾環(huán)擴增技術（RCA)，單引物等溫擴增技術（SPIA)，依賴于解旋酶的等溫 擴增技術（HDA)，鏈替換擴增技術（SDA)，自主序列復制系統(tǒng)（3SR)與切刻內(nèi)切酶核酸恒溫 擴增技術（NEMA)。但由于工作原理或引物設計原理的不同，其中僅有NASBA曾在同一反應 管中實現(xiàn)過同時檢測兩種RNA的表達水平。此外，SDA法則是通過與微芯片技術相結合后， 才實現(xiàn)了多重擴增。因此在同一檢測管中，類似熒光定量PCR，通過熒光探針法在常溫等溫 的條件下實現(xiàn)核酸的多重檢測的案例，目前尚未見報道。
[0005] 當前，熒光定量PCR或其多重反應，因具備實時檢測、同時檢出多項指標、高靈敏 度和準確性等優(yōu)點，成為體外分子診斷的主要技術之一，被廣泛的應用到許多領域，例如臨 床疾病診斷、病原菌的檢出、出入境動植物的檢驗檢疫等。但是它對精密設備，即熒光定量 PCR儀，的高度依賴性，使其主要集中在中心實驗室內(nèi)使用，未能幫助實驗人員真正在現(xiàn)場 實現(xiàn)核酸的快速檢測。此外，由于熒光定量PCR儀的高精密性，使得整個實驗設置過程相對 復雜，因此不但實驗操作，而且結果的解讀也都需要受過專業(yè)訓練的技術人員才能完成。這 些缺點更讓熒光定量PCR難以在基層檢測實驗室或單位推廣，因而資源匱乏的邊遠地區(qū)則 更不便于使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對以上問題提供一種常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標 物的方法，克服目前熒光PCR對精密儀器的依賴較大，且核酸等溫擴增技術的PCR產(chǎn)物定量 不夠精確、目前尚不能實現(xiàn)同時檢測多個目標物的問題。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術方案來實現(xiàn)：一種常溫等溫熒光快速同時檢測多核酸目標物 的方法，該方法包括以下步驟：
[0008] (1)單鏈結合蛋白將多個模板雙鏈的母鏈局部打開成單鏈；
[0009] (2)重組酶與多對引物結合成復合體，在輔助蛋白的作用下結合到母鏈上，多個熒 光探針也與互補區(qū)域結合，所述的多個熒光探針中部標記有四氫呋喃，四氫呋喃兩側分別 為熒光基團和淬滅基團，熒光基團和淬滅基團之間間距為2-6nt，熒光探針3'末端標記阻 抑聚合酶延伸或擴增的修飾基團；
[0010] (3)DNA聚合酶結合到引物的3'末端，進行子鏈的延生；
[0011] (4)核酸外切酶識別雙鏈狀態(tài)下的多個熒光探針上的四氫呋喃位點，酶切后使熒 光基團和淬滅基團得以分離，釋放熒光；
[0012] (5)多個熒光探針被切斷后，露出了原本被探針3'末端修飾所封閉掉的3'-OH端， DNA聚合酶可以繼續(xù)延伸形成子鏈；
[0013] (6)通過檢測擴增曲線的形狀，和熒光信號的強弱，可對待測樣本進行定性且半定 量檢測。
[0014] 進一步的，所述的熒光探針長度為46_52nt。
[0015] 進一步的，所述的熒光探針3'末端標記阻抑聚合酶延伸或擴增的修飾基團為 C3-spaCer、磷酸基團、生物素、生物素-TEG或胺基中任意一種。
[0016] 進一步的，所述的熒光基團為 的任意一種。
[0017] 進一步的，所述的淬滅基團為BHQl或BHQ2。
[0018] 進一步的，所述的重組酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，輔助蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID No. 2所示，單鏈結合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，DNA聚合酶的氨 基酸序列如SEQ ID No. 4所示，核酸外切酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[0019] 進一步的，所述的恒溫條件為25-42度。
[0020] 更詳細的，本發(fā)明中：
[0021] 多對引物，是針對多個核酸目標物分別設計的多條寡核苷酸，其特征是：每兩條 寡核苷酸組成一對引物，分別特異性識別一個核酸目標物的上下游核苷酸序列；長度在 30-35核苷酸（nt)之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復序列和內(nèi)部二級結構區(qū)；引物 Tm值不作為設計時主要考慮因素；最佳引物對需通過試驗優(yōu)化篩選出，其擴增產(chǎn)物為單一 條帶，無非特異性擴增和明顯的引物二聚體；多對引物之間也不能相互形成結構牢固的寡 核苷酸雙鏈。
[0022] 多個熒光探針（圖1)，是針對多個核酸目標物分別設計的多條寡核苷酸長單鏈， 其特征是：每條寡核苷酸單鏈專一性識別一個核酸目標物序列的中部，不與引物特異識別 位點重疊；長度為46-52nt，序列避免回文序列、連續(xù)單堿基重復和內(nèi)部二級結構；共有4 個修飾位點，中部距離5'端約30nt位置標記一 dSpacer，即四氫呋喃（THF)，作為核酸內(nèi) 切酶識別位點，由于識別位點僅為一個核苷酸，因此設計探針顯得更為簡單，也便于做多重 檢測時的探針設計；THF位點兩側分別標記一個熒光基團與一個淬滅基團，兩基團間距為 2-6nt ;3'末端標記阻抑聚合酶延伸或擴增的修飾基團，例如C3-spacer、磷酸基團、生物 素、生物素-TEG或胺基；探針的Tm值不作為設計的主要考慮因素；熒光基團可從FAM、HEX、 JOE、VIC、Texas Red、Cy3、Cy5或TAMRA中選擇，淬滅基團可選擇BHQl或BHQ2,以最大限度 地降低背景熒光噪音為原則。
[0023] 重組酶、單鏈結合蛋白、DNA聚合酶、輔助蛋白、與核酸外切酶，是經(jīng)基因工程改造 的重組工程酶，包括：1)均來源于天然菌中的有特定功能的活性蛋白，后經(jīng)基因工程改造； 2)在體外經(jīng)化學試劑，例如IPTG，或溫度的誘導后，在發(fā)酵培養(yǎng)的大腸桿菌細胞內(nèi)可獲得 大量表達的目的蛋白；3)細胞破碎后，均經(jīng)過兩次蛋白純化，例如鎳柱純化與肝素柱純化， 從而獲得高純度的單一蛋白；4)純化后，蛋白經(jīng)過酶活性鑒定測試，從而獲得具有高活力 單位的蛋白酶；5)重組酶，負責與引物分別形成起始反應復合物，可從大腸桿菌（E. coli) 重組酶RecA或T4 菌體重組酶uvsX等天然菌中選?。?)單鏈結合蛋白，負責結合DNA單 鏈，并穩(wěn)定解鏈時所形成的氣泡區(qū)，可從E. coli或T4的gp32蛋白等天然菌中選??；7)DNA 聚合酶，同時具備聚合活性與鏈置換活性，可從E. coli的DNA聚合酶I Klenow大片段、Bst 聚合酶、Phi-29聚合酶、或枯草芽胞桿菌PolI(Bsu)等天然菌中選?。?)輔助蛋白，負責協(xié) 助、促進并穩(wěn)定起始反應復合物與DNA鏈間的結合，例如可選擇T4的uvsY蛋白；9)核酸外 切酶，負責識別探針與子鏈形成的帶有切口的DNA雙鏈，作用于切口處酶切探針，釋放熒光 基團的信號以便相應儀器檢測到，例如可選擇E. coli的核酸外切酶exoIII或exoIV。各種 蛋白的序列詳見序列表。
[0024] 其它化學組分，是維持最適反應環(huán)境的多種化學成分的混合物，所含組分包括 2-3%聚乙二醇（PEG)、20-30mMTris 堿、90-110mM 乙酸鉀（KAc)、4-6mM 二硫蘇糖醇（DTT)、 2_3mM 三磷酸腺苷（ATP)、45_55mM 磷酸肌酸二鈉鹽（PCr，Creatine phosphate disodium salt)、90_110ng/ μ I 磷酸肌酶（CK，Creatine kinase)、200_250uM 脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)、5. 5-6. 5%海藻糖（Trehal