一種離子交換和疏水層析結(jié)合分離純化眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種離子交換和疏水層析結(jié)合分離純化眼鏡 蛇毒神經(jīng)毒素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇的毒腺分泌的毒液，其化學(xué)成分復(fù)雜，含有多種蛋白質(zhì)、多 肽、酶類和其他小分子物質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性。自1933年Monaelessert和Taguet 首次報道眼鏡蛇毒對癌組織壓迫神經(jīng)引起疼痛的病例有顯著療效以來，眼鏡蛇毒的鎮(zhèn)痛作 用得到了深入的研宄，其中眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素顯示了獨特的鎮(zhèn)痛作用。眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素 有長鏈和短鏈之分，短鏈含60~62個氨基酸，4個二硫鍵；長鏈含65~72個氨基酸，5個 二硫鍵。眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的鎮(zhèn)痛機理與嗎啡相似，鎮(zhèn)痛效果強于嗎啡，持續(xù)時間長，無成 癮性和耐藥性，起效較嗎啡慢，有助于戒除嗎啡的毒癮，具有獨特的治療作用。
[0003] 有文獻報道，通過眼鏡王蛇毒的粗分離、組分的活性鑒定、S印hadex G-50凝膠柱 層析、CM-Sepharose Fast Flow離子交換層析、Phenyl-Sepharose HP 疏水層析和 Sephasil Peptide C18反相層析等步驟分離純化眼鏡王蛇毒神經(jīng)毒素。但是，該方法由于需要聯(lián)合使 用凝膠柱層析、離子交換層析、疏水層析和反相層析等柱層析方法，不僅操作步驟復(fù)雜，而 且分離純化周期長（僅眼鏡王蛇毒的粗分離這一步就需要576小時），使得其應(yīng)用范圍僅局 限于實驗室中。
[0004] 因此，研宄一種操作步驟簡便、分離純化周期短、適于工業(yè)化生產(chǎn)的眼鏡蛇毒神經(jīng) 毒素的分離純化方法具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種操作步驟簡便、分離純化周期短、適于工業(yè) 化生產(chǎn)的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的分離純化方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明提供一種眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的分離純化方法，包括以下步驟：
[0008] (1)稱取眼鏡蛇毒粗品4-5重量份，加入至(λ 04-0. 05體積份水中或pH5. 0~7. 0 的0. 01Μ-0. 05Μ的磷酸鹽緩沖液中，攪拌溶解，0-8°C離心，將沉淀棄去，將上清液進行過 濾，得供試品溶液A，備用；
[0009] (2)將所述供試品溶液A通過離子交換層析純化，梯度洗脫，HPLC檢測，收集，得供 試品溶液B，備用；
[0010] (3)將所述供試品溶液B通過疏水層析純化，梯度洗脫，HPLC檢測，收集，濃縮，干 燥，即得眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的純品；
[0011] 當(dāng)所述重量份的單位為g時，則對應(yīng)體積份單位為L。
[0012] 本發(fā)明上述分離純化方法，所述離子交換層析的介質(zhì)為CM Sepharose Fast Flow0
[0013] 本發(fā)明上述分離純化方法，所述疏水層析的介質(zhì)為UniPhenyl。
[0014] 本發(fā)明上述分離純化方法，所述步驟（2)中，以pH 5. 0~7. 0的0· 01M-0. 05M的 磷酸鹽緩沖液為流動相A，以包括0. 8-1. 2M Na+的pH 5. 0~7. 0的0. 01M-0. 05M的磷酸鹽 緩沖液為流動相B，所述Na+選自硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉中的至少一種。
[0015] 本發(fā)明上述分離純化方法，以包括IM Na+的pH 5. 0~7. 0的0. 01M-0. 05M的磷 酸鹽緩沖液為流動相B。
[0016] 本發(fā)明上述分離純化方法，所述步驟（3)中，以pH 5. 0~7. 0的0. 01M-0. 05M的 磷酸鹽緩沖液為流動相A，以包括2. 5-3. 5MNH4+的pH 5. 0~7. 0的0. 01M-0. 05M的磷酸鹽 緩沖液為流動相C，所述NH4+選自硫酸銨、醋酸銨中的至少一種。
[0017] 本發(fā)明上述分離純化方法，以包括3M NH4+的pH 5. 0~7. 0的0. 01M-0. 05M的磷 酸鹽緩沖液為流動相C。
[0018] 本發(fā)明上述分離純化方法，所述步驟（2)中梯度洗脫的步驟為：A:B體積比為 100% :0%，A :B 體積比為 90% :10%，A :B 體積比為 85% :15%，A :B 體積比為 80% :20%， A :B體積比為50% :50%。
[0019] 本發(fā)明上述分離純化方法，所述步驟（3)中梯度洗脫的步驟為：A :C體積比為0%: 100%，A :C 體積比為 16. 7% :83· 3%，A :C 體積比為 33. 3% :66· 7%，A :C 體積比為 50% : 50%，A :C 體積比為 66. 7% :33· 3%，A :C 體積比為 83. 3% :16· 7%，A :C 體積比為 100% : 0%〇
[0020] 本發(fā)明上述分離純化方法，所述步驟（2)中，所述梯度洗脫前還包括以下步驟：先 用1-3個柱床體積的流動相B進行活化洗脫，再用2-4個柱床體積的流動相A進行平衡洗 脫；
[0021] 所述步驟（3)中，所述梯度洗脫前還包括以下步驟：先用1-3個柱床體積的流動相 A進行活化洗脫，再用2-4個柱床體積的流動相C進行平衡洗脫；
[0022] 所述步驟（1)中，所述過濾為采用45 μ m PES微孔濾膜進行過濾，所述離心為采用 8000-12000rpm 進行離心。
[0023] 本發(fā)明還提供一種上述分離純化方法得到的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的上述技術(shù)方案具有以下優(yōu)點：
[0025] 本發(fā)明眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的分離純化方法，將眼鏡蛇毒粗品溶液通過離子交換層 析和疏水層析兩步純化，并進一步優(yōu)化選擇離子交換層析的介質(zhì)、離子交換層析的流動相、 離子交換層析的梯度洗脫的步驟、疏水層析的介質(zhì)、疏水層析的流動相和疏水層析的梯度 洗脫的步驟等，簡化了操作步驟，縮短了分離純化的周期（8-10小時即可完成分離純化過 程），收率較高（約50% )，純度較高（為98. 2% )，適于眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0026] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中：
[0027] 圖1為實驗例1中對照品的C18柱HPLC檢測圖；
[0028] 圖2為實驗例1中實施例1制備的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的C18柱HPLC檢測圖；
[0029] 圖3為實驗例3抗炎活性實驗結(jié)果圖，1為生理鹽水對照組，2為實施例1制備的 眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素組。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1
[0031] 本實施例眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的分離純化方法，包括以下步驟：
[0032] (1)稱取眼鏡蛇毒粗品4. 5g，加入至0· 045L水中或pH 6. 0的0· 03M的磷酸鹽緩 沖液中，攪拌溶解，4°C采用1000 Orpm進行離心，將沉淀棄去，將上清液采用45 μ mPES微孔 濾膜進行過濾，過濾，得供試品溶液A，備用；
[0033] (2)將供試品溶液A通過離子交換層析純化，離子交換層析的介質(zhì)為CM Sepharose Fast Flow，以pH 6. 0的0· 03M的磷酸鹽緩沖液為流動相A，以包括IM氯化鈉 的pH 6. 0的0. 03M的磷酸鹽緩沖液為流動相B，先用2個柱床體積的流動相B進行活化， 再用3個柱床體積的流動相A進行平衡洗脫，然后梯度洗脫，梯度洗脫的步驟為：A :B體積 比為100% :0%，A :B體積比為90% :10%，A :B體積比為85% :15%，A :B體積比為80% : 20 %，A :B體積比為50 % : 50 %，HPLC檢測，收集，得供試品溶液B，備用；
[0034] (3)將供試品溶液B通過疏水層析純化，疏水層析的介質(zhì)為UniPhenyl，以pH 6. 0 的0. 03M的磷酸鹽緩沖液為流動相A，以包括3M硫酸銨的pH 6. 0的0. 03M的磷酸鹽緩沖 液為流動相C，先用2個柱床體積的流動相A進行活化洗脫，再用3個柱床體積的流動相C 進行平衡洗脫，然后梯度洗脫，梯度洗脫的步驟為：A :C體積比為0 % : 100 %，A :C體積比為 16. 7 % :83· 3 %，A :C 體積比為 33. 3 % :66· 7 %，A :C 體積比為 50 % :50 %，A :C 體積比為 66. 7% :33. 3%，A :C 體積比為 83. 3% :16. 7%，A :C 體積比為 100% :0%，HPLC 檢測，收集， 濃縮，干燥，即得眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的純品。
[0035] 本實施例整個分離純化過程僅需8-10小時即可完成，收率約為50%，純度為 98. 2%，適于眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0036] 實施例2
[0037] 本實施例眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素的分離純化方法，包括以下步驟：
[0038] (1)稱取眼鏡蛇毒粗品4g，加入至0. 04L水中或pH 5. 0的0.0 lM的磷酸鹽緩沖液 中，攪拌溶解，〇°C采用8000rpm進行離心，將沉淀棄去，將上清液采用45 μ mPES微孔濾膜進 行過濾，過濾，得供試品溶液A，備用；
[0039] (2)將供試品溶液A通過離子交換層析純化，離子交換層析的介質(zhì)為CM Sepharose Fast Flow，以pH 5. 0的0· OlM的磷酸鹽緩沖液為流動相A，以包括(λ 4M硫酸鈉 的pH 5. 0的0.0 lM的磷酸鹽緩沖液為流動相B，先用1個柱床體積的流動相B進行活化， 再用2個柱床體積的流動相A進行平衡洗脫，然后梯度洗脫，梯度洗脫的步驟為：A :B體積 比為100% :0%，A :B體積比為90% :10%，A :B體積比為85% :15%，A :B體積比為80% : 20 %，A :B體積比為50 % : 50 %，HPLC檢測，收集，得供試品溶液B，備用；
[0040] (3)將供試品溶液B通過疏水層析純化，疏水層析的介質(zhì)為UniPhenyl，以pH 5. 0 的0.0 lM的磷酸鹽緩沖液為流動相A，以包括5M醋酸銨的pH5. 0~7. 0的0. 01M-0. 05M的 磷酸鹽緩沖液為流動相C，先用1個柱床體積的流動相A進行活化洗脫，再用2個柱床體積