一種檢測(cè)人類(lèi)PDGFRα基因D583_W586DEL突變的診斷試劑盒和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人類(lèi)H)GFRa基因D583_W586DEL突變的診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃腸道間質(zhì)瘤（GastrointestinalStromalTumors,GIST)是一類(lèi)起源于胃腸道 間葉組織的腫瘤，占消化道間葉腫瘤的大部分。胃腸道間質(zhì)瘤占胃腸道惡性腫瘤的1~ 3%，估計(jì)年發(fā)病率約為10 - 20/100萬(wàn)，多發(fā)于中老年患者，40歲以下患者少見(jiàn)，男女發(fā)病 率無(wú)明顯差異。GIST大部分發(fā)生于胃（50~70%)和小腸（20~30%)，結(jié)直腸約占10~ 20%，食道占0~6%，腸系膜、網(wǎng)膜及腹腔后罕見(jiàn)。GIST病人20-30%是惡性的，第一次就 診時(shí)約有11~47%已有轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移主要在肝和腹腔。
[0003] 目前臨床上一線靶向藥物是格列衛(wèi)（伊馬替尼，諾華制藥），二線藥物索坦（舒尼 替尼，輝瑞制藥）每個(gè)患者年消費(fèi)均為十余萬(wàn)人民幣。不同基因突變類(lèi)型患者，輔助治療的 獲益存在差異，因此靶向治療之前需進(jìn)行基因檢測(cè)，以預(yù)測(cè)靶向治療的療效并指導(dǎo)靶向藥 物種類(lèi)和劑量的選用。其規(guī)范的用藥方案已經(jīng)進(jìn)入《中國(guó)胃腸間質(zhì)瘤診斷治療共識(shí)》（2013 年版）。
[0004] 人類(lèi)roGFRa基因是編碼血小板源性生長(zhǎng)因子家族中的一個(gè)細(xì)胞膜酪氨酸激酶 受體的基因，其突變與GIST相關(guān)。TOGFRa基因D583_W586DEL突變屬于TOGFRa第12外 顯子上的突變位點(diǎn)，其與GIST的治療相關(guān)，出現(xiàn)了該突變的病人，對(duì)GIST的一線藥物一一 格列衛(wèi)敏感，可以采用一線藥物治療有效，而未突變的患者則對(duì)一線藥物不敏感，應(yīng)當(dāng)采用 二線藥物--索坦治療。因此，檢測(cè)GIST患者是否出現(xiàn)H)GFRa基因D583_W586DEL突變， 對(duì)其臨床用藥有非常重要的意義。
[0005] 但是，目前均是通過(guò)測(cè)序的方式檢測(cè)TOGFRa基因D583_W586DEL突變，但是測(cè)序 的成本太高，不利于普通的臨床檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的定量PCR檢測(cè)檢PDGFRa基因D583_ W586DEL突變的的試劑盒和方法。
[0007] PDGFRa基因D583_W586DEL突變的信息如下：
[0009] 本發(fā)明提供了SEQIDNO. 1~2所示的引物對(duì)。
[0010] 本發(fā)明提供了SEQIDNO. 3所示的探針。
[0011] 本發(fā)明還提供了SEQ ID NO. 1~2和SEQ ID NO. 3所示的探針在制備檢測(cè)檢測(cè)人 類(lèi)TOGFRa基因D583_W586DEL突變的試劑中的用途。
[0012] 優(yōu)選地，所述試劑還包括SEQ ID NO. 4~5所示引物對(duì)與SEQ ID NO. 6所示的探 針和/或SEQ ID NO. 7~9所示引物與SEQ ID NO. 10所示的探針。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人類(lèi)TOGFRa基因D583_W586DEL突變的試劑盒，它包括 SEQ ID NO. 1~2和SEQ ID NO. 3所示的探針。
[0014] 優(yōu)選地，
[0015] 它還包括質(zhì)控引物與質(zhì)控探針：SEQ ID NO. 4~5所示引物對(duì)與SEQ ID NO. 6所 示的探針和/或SEQ ID NO. 7~9所示引物與SEQ ID NO. 10所示的探針。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人類(lèi)TOGFRa基因D583_W586DEL突變的方法，它包括如 下步驟：
[0017] (1)提取樣本DNA :取待檢組織，提取其中的DNA ;
[0018] (2)基因擴(kuò)增：用前述的試劑盒對(duì)待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；
[0019] (3)結(jié)果檢測(cè)：對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
[0020] 本發(fā)明提供的試劑盒可以準(zhǔn)確檢測(cè)人類(lèi)TOGFRa基因D583_W586DEL突變，檢測(cè)快 速、簡(jiǎn)便，成本低廉，可以大量推廣使用，臨床應(yīng)用前景良好。
[0021] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0022] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1樣品1的測(cè)序結(jié)果
[0024] 圖2樣品2的測(cè)序結(jié)果
[0025] 圖3樣品1的檢測(cè)結(jié)果
[0026] 圖4樣品2的檢測(cè)結(jié)果
[0027] 圖5靈敏度的檢測(cè)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)驗(yàn)試劑：
[0029] Roche公司
[0030] FastStart Taq DNA Polymerase
[0031] Cat No. 12 032 937 001
[0032] 大連Takara公司
[0033] Uracil DNA Glycosylase(UNG), heat labile 200U 2u/l
[0034] Cat No. 2820
[0035] 大連Takara公司
[0036] dU plus dNTP Mixture(12. 5X)
[0037] (dATP 2. 5mM, dGTP 2. 5mM, dCTP 2. 5mM, dUTP 7. 5mM,)
[0038] Cat No. 4035
[0039] 大連Takara公司
[0040] Takara Taq TM Hot Start Version
[0041] Cat No. R007A
[0042] 實(shí)施例1本發(fā)明檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
[0043] -、本發(fā)明試劑盒的組成
[0044] PCR擴(kuò)增試劑（50人份）：
[0046] PDGFRa基因D583_W586DEL突變的擴(kuò)增引物以及檢測(cè)探針：
[0047]引物：
[0048] 5? -tg cct tat gag ttt cca aga ga-3? Forward(SEQ ID NO. 1)
[0049] 5?-AGTTGTGTGCAAGGGAAA-3, Reverse(SEQ ID NO. 2)
[0050]探針：
[0051] 12P FAM-5, -CCCATGGAACTTACCAAGCACTAGTCC-3? -BQ1 Reverse (SEQ ID NO. 3)
[0052] 質(zhì)控引物和探針：
[0053]引物：
[0054] CtlF內(nèi)5,-cctcaagatcatcagcaatgcctc-3，F(xiàn)orward(SEQ ID NO. 4)
[0055] CtlR內(nèi)5,-GTG GTC ATG AGT CCT TCC ACG ATA-3' Reverse(SEQ ID NO. 5)
[0056]探針：
[0057] CtlP內(nèi)HEX-5,-TGG CCA AGG TCA TCC ATG ACA ACT-3,-BQ1 Forward (SEQ ID NO. 6)
[0058]引物：
[0059] CtlFl外5,_aa ggt gat eta ttt ttc cct ttc t_3，F(xiàn)orward(SEQ ID NO. 7)
[0060] CtlF2外5,-acaggtaaccatttatttgttctc-3' Forward(SEQ ID NO. 8)
[0061] CtlR外5,-CAA AAC AAA GGA AGC CAC TG-3' Reverse(SEQ ID NO. 9)
[0062]探針：
[0063] CtlP外FAM-5' -TGGGTACACATAACAGTGACTTTAAGGAAC-3' -BQ1 Forward (SEQ ID NO. 10)
[0064] 二、采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)
[0065] 1、樣本DNA提?。嚎梢允褂肣iagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取試劑 盒提取。
[0066] 以石賭組織樣本，用Qiagen公司試劑盒為例，提取DNA。
[0067] 1.利用手術(shù)刀取出組織邊界無(wú)用的石蠟；
[0068] 2.將石蠟包埋組織切成4 y m厚的薄片；
[0069] 3.迅速用滅菌小鑷子取2 -6枚裝入DNase/RNase Free EP管中（每張攤開(kāi)面積 500 (最大）mm2，即邊長(zhǎng)1. 6cm的正方形大?。?br>[0070] 4.加入800 y 1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0071] 5.加入800 yl二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0072] 6.棄二甲苯，加入800 y 1無(wú)水乙醇，最大轉(zhuǎn)數(shù)離心3分鐘；
[0073] 7.棄無(wú)水乙醇，揮干樣品；
[0074] 8?加入180 u 1 ALT buffer及20 u 1 proteinase K，56°C-小時(shí)以上，直至清亮；
[0075] 9.9CTC-小時(shí)；
[0076] 10.離心6000g lmin，取上清；（此步驟是防止沉淀物阻塞柱子）
[0077] 11?加入200 y 1 AL,混勻，加入200 y 1乙醇，再混勻；
[0078] 12.簡(jiǎn)單離心清潔管壁；
[0079] 13.將全部混合液加入到DNA分離柱，關(guān)蓋，離心6000g lmin，換新的收集管；
[0080] 14?加入500 y 1 AW1, 6000g離心lmin ;換收集管；
[0081] 15?加入500 y 1 AW2,6000g離心lmin，換收集管；
[0082] 16.全速離心3min，干燥柱子；
[0083] 17.換一只干凈的1. 5ml收集管，準(zhǔn)備收集DNA ;加入20-30 y 1 ATE，在室溫保持 lmin以溶解DNA。全速離心lmin收集DNA。
[0084] 2、定量PCR擴(kuò)增
[0085] H)GFRa基因D583_W586DEL突變的擴(kuò)增引物以及檢測(cè)探針：
[0086] 12F 5? -tg cct tat gag ttt cca aga ga-3? Forward
[0087] 12R 5' -AGTTGTGTGCAAGGGAAA-3' Reverse
[0088] 12P FAM-5' -CCCATGGAACTTACCAAGCACTAGTCC-3' -BQ1 Forward
[0089] 質(zhì)控引物和探針：
[0090] CtlF內(nèi)5'-cctcaagatcatcagcaatgcctc-3' Forward
[0091] CtlR內(nèi)5,-GTG