病毒基因組中的高度保守區(qū)序列作為設(shè)計(jì)治療性sliRNA模板的應(yīng)用
【專利說明】病毒基因組中的高度保守區(qū)序列作為設(shè)計(jì)治療性sIiRNA 模板的應(yīng)用
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01180050847. 5、申請(qǐng)日為2011年9月19日、2013年4月22日 進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段、發(fā)明名稱為"病毒基因組中的高度保守區(qū)序列作為設(shè)計(jì)治療性sliRNA 模板的應(yīng)用"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 奪叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求2010年9月20日提交的美國(guó)申請(qǐng)第12/886, 446號(hào)的權(quán)益，該美國(guó)申 請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容在此通過引用并入本文。
[0004] 對(duì)序列表的引用
[0005] 本申請(qǐng)包括通過EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并且該序列表的全部?jī)?nèi)容在 此通過引用并入本文。在2011年9月19日創(chuàng)建的ASCII副本的名稱為Doc.No. 4170050_1. txt，大小為 9. 28KB。
【背景技術(shù)】
[0006] 小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)是帶有特定基因密碼的短雙鏈RNA 片段，功能長(zhǎng)度一般為21-23核苷酸。siRNA與互補(bǔ)mRNA特異性結(jié)合，使靶定的mRNA降解 并失去功能。這種由siRNA有效介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象稱之為RNAi(RNA干擾），其 為自然存在于細(xì)胞中的防御機(jī)制。當(dāng)雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，其被切割成帶有21-25個(gè)核 苷酸的siRNA片段。所述片段先與細(xì)胞內(nèi)的其它成分結(jié)合以形成核酸蛋白復(fù)合體，稱之為 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC)。激活的RISC通過堿基配對(duì)靶向到同源mRNA上，從而切割 并降解mRNA，由此阻止細(xì)胞內(nèi)特定的基因表達(dá)。siRNA不僅廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研宄，而且 在治療多種疾病如病毒感染、癌癥、血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等具有廣闊的前景。
[0007] 年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD)是50歲以上的人視力不可逆性損害的主要原因之一。 AMD在臨床上分為"干性"和"濕性"兩型，濕性AMD發(fā)展快，是引起失明的主要原因。其病 理變化導(dǎo)致嚴(yán)重的視力障礙。AMD的表現(xiàn)包括視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE)功能受損和黃斑 部脈絡(luò)膜新生血管（CNV)。在一些嚴(yán)重病例中還會(huì)出現(xiàn)液體滲出，RPE或神經(jīng)上皮的脫離， 血管破裂造成出血性脫離。已發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子在CNV的生成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控 作用，所述細(xì)胞因子包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF)、VEGF受體（VEGFR)、缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF)、血管生成素（Ang)和其它細(xì)胞因子，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK)及其它。
[0008] 已對(duì)RNAi在抑制CNV方面的效力做了測(cè)試，Cashman等的研宄表明（CashmanSM 等人，InvestOphthalmolVisSci，2006;47(8) :3496-3504)，將構(gòu)建在腺病毒表達(dá)載體中 的VEGF短發(fā)夾RNA(shRNA)玻璃體腔內(nèi)注射于VEGF165誘導(dǎo)的CNV小鼠模型。該注射治療 可有效地抑制VEGF的過表達(dá)并且成功地阻止CNV的形成。證據(jù)顯示shRNA腺病毒載體被遞 送（跨膜）至細(xì)胞質(zhì)并引發(fā)RISC的活化，使目標(biāo)RNA降解。由于人們對(duì)腺病毒載體在臨床 應(yīng)用上的顧慮，嘗試使用裸露（無傳輸介質(zhì)）的VEGFsiRNA使目標(biāo)基因沉默。結(jié)果顯示通 過裸露的"siRNA"抑制VEGF表達(dá)確實(shí)降低了在小鼠模型中CNV的形成（Reich，S.J等人， Mol.Vis. 2003 ;9 :210 - 216)。
[0009] 本領(lǐng)域仍然需要改良的、基于RNA的抑制劑，用于治療如AMD和CNV的疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 一方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)Toll樣受體（TLR)的sliRNA，該sliRNA含有與病 毒基因組序列的高度保守區(qū)的片段具有至少80%同源性的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式 中，所述核苷酸序列與高度保守區(qū)的片段具有至少85%、90%、95%、100%的同源性。在一 些實(shí)施方式中，Toll樣受體是Toll樣受體3 (TLR3)。在一些實(shí)施方式中，高度保守區(qū)位于 病毒基因組的選自5'非翻譯區(qū)（UTR)、3'UTR及開放閱讀框（0RF)的區(qū)域。在一些實(shí)施方 式中，病毒是選自脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、人腸道孤病毒、微小核糖核酸病毒、腸道病 毒的人類病毒。在一些實(shí)施方式中，高度保守區(qū)序列位于SEQIDNO: 1的241-263位。在 一些實(shí)施方式中，sliRNA包括雙鏈RNA，該雙鏈RNA可為平末端或可具有3'或5'突出端。 在一些實(shí)施方式中，sliRNA的長(zhǎng)度為14-25核苷酸。在一些實(shí)施方式中，sliRNA包括位于 核苷酸序列的3'端的1~2個(gè)DNA堿基。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供sliRNA，該sliRNA包含具有以下序列的雙鏈RNA分子：
[0012] 正義鏈：5' -UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3'（SEQIDN0:14)
[0013]反義鏈：5' -UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3'，（SEQIDN0:15)
[0014] 或：
[0015]正義鏈：5' -AGGUACUUCGAGAAGCCNn-3'（SEQIDN0:28)
[0016]反義鏈：5' -GGCUUCUCGAAGUACCUNn-3'（SEQIDN0:29)
[0017]其中，N是選自胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶及其脫氧形式的核苷酸，并且，其 中，n是0~2的整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，N是dT，且n為2。在一些實(shí)施方式中，n為2。 [0018] 再一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本文提供的 sliRNA，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供了一種治療病理性血管生成相關(guān)疾病的方法，所述方法包 括將藥學(xué)有效劑量的本文提供的sliRNA給藥至需要這種治療的受治者。在一些實(shí)施方式 中，這些疾病選自：老年性黃斑變性（AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變及癌癥。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供了一種設(shè)計(jì)sliRNA的方法，所述方法包括從病毒基因組序 列中選擇高度保守區(qū)，并測(cè)試包含與高度保守區(qū)的片段具有至少80%、85%、90%、95%、 1〇〇%同源性的核苷酸序列的1?仏調(diào)節(jié)1'1^(如1'1^3)活性的能力。
[0021] 通討引用并入本f
[0022] 如同將各單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)通過引用單獨(dú)并入本文中一樣，本文所 提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均以相同的程度通過引用并入本文。
【附圖說明】
[0023] 本發(fā)明的新特征由所附的權(quán)利要求書中的具體內(nèi)容來闡述。為了更好地理解本發(fā) 明的特征和優(yōu)點(diǎn)，以下將利用本發(fā)明原理通過說明書實(shí)施例和附圖進(jìn)行詳細(xì)闡明。
[0024] 圖1是鞏膜_脈絡(luò)膜/視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE)鋪片的熒光顯微照片（放大40 倍）：綠色通道圖片顯示鬼筆環(huán)肽（Phalloidin)陽(yáng)性的RPE細(xì)胞呈均勻一致的六邊形緊密 排列（圖la)，紅色通道圖片顯示同工凝集素_B4(iB4)_陽(yáng)性的血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖lb)，綠 色-紅色-藍(lán)色通道的疊加圖像顯示出RPE、血管內(nèi)皮細(xì)胞和4'，6'-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)標(biāo)記的細(xì)胞核的重疊（圖lc)。
[0025] 圖2a為在C57BL/6J小鼠體內(nèi)通過激光光凝作用誘導(dǎo)的CNV小鼠模型的眼球剖面 圖。圖右下方箭頭指示光凝斑在視乳頭旁。圖2b為氪激光光凝后5min的眼底照片，箭頭 指示光凝斑和視網(wǎng)膜水腫；圖2c是顯微鏡下下觀察到的鞏膜-脈絡(luò)膜/RPE的鋪片顯微照 片（放大100X)，箭頭指示光凝斑在視神經(jīng)旁。
[0026] 圖3是用共焦激光視網(wǎng)膜斷層掃描儀記錄的顯微照片：眼底熒光血管造影（FFA) 檢查顯示C57BL/6J小鼠在氪激光光凝后發(fā)生血管改變。光凝后7天，可在盤狀熒光素滲漏 處觀察到光凝斑（圖3a);光凝后14天，可在熒光素滲漏處明顯地觀察到光凝斑（圖3b) (圖中箭頭所指為光凝部位）。光凝后28天，在熒光滲漏處無明顯光凝斑，并且出現(xiàn)瘢痕化 (圖 3c)。
[0027]圖4是在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片的熒光顯微照片（放大100倍）：激光誘 導(dǎo)的灼傷位于如圖4d_f所示的環(huán)形缺損區(qū)內(nèi)。在光凝后第4天，缺損區(qū)內(nèi)出現(xiàn)一些細(xì)胞碎 片以及細(xì)胞核碎片（圖4g_i)。到第7天時(shí)，在激光損傷區(qū)可以看到同工凝集素-B4染色 的CNV網(wǎng)。RPE細(xì)胞覆蓋CNV復(fù)合體區(qū)域（圖4j-l)。第14天和第28天CNV面積無明顯 不同，但是與第7天的CNV面積相比明顯增加。
[0028]圖5是在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。激光光凝 后第7天的樣品用作對(duì)照。由熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集素-B4(紅色）及鬼筆環(huán)肽（綠 色）分別標(biāo)記細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE。
[0029] 圖6是在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用5%葡萄 糖溶液處理的激光光凝后第7天的樣品用作對(duì)照。由熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集素-B4 (紅 色）及鬼筆環(huán)肽（綠色）分別標(biāo)記細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE。
[0030]圖7是在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用阿瓦斯 汀（Avastin)處理的激光光凝后第7天的樣品用作對(duì)照。由熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集 素-B4(紅色）及鬼筆環(huán)肽（綠色）分別標(biāo)記細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE。
[0031] 圖8是在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用siEv70_l 處理的激光光凝后第7天的樣品用作對(duì)照。由熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集素-B4 (紅色） 及鬼筆環(huán)肽（綠色）分別標(biāo)記細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE。
[0032] 圖9是在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用siEv70_2 處理的激光光凝后第7天的樣品用作對(duì)照。由熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集素-B4 (紅色） 及鬼筆環(huán)肽（綠色）分別標(biāo)記細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE。
[0033]圖10是在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用 siEv70_3處理的激光光凝后第7天的樣品用作對(duì)照。由熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集 素-B4(紅色）及鬼筆環(huán)肽（綠色）分別標(biāo)記細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE。
[0034]圖11是在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用 siEv70_4處理的激光光凝后第7天的樣品用作對(duì)照。由熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集 素-B4(紅色）及鬼筆環(huán)肽（綠色）分別標(biāo)記細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE。
[0035]圖12是在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微照片（放大100倍）。用 siEv70_5處理的激光光凝后第7天的樣品用作對(duì)照。由熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集 素-B4(紅色）及鬼筆環(huán)肽（綠色）分別標(biāo)記細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE。
[0036] 圖13顯示用ImageJ圖像分析軟件定量分析CNV的平均面積，圖中顯示每個(gè)處理 組均小于陰性對(duì)照組；siEv70_2處理組明顯小于其它處理組。
[0037] 圖14是不同處理組VEGFmRNA表達(dá)水平：激光誘導(dǎo)的未處理的眼內(nèi)的VEGFmRNA 水平明顯高于其它處理組，在處理組中，siEv70_2處理組的VEGFmRNA水平為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 上的最低水平。
[0038] 圖15顯示實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)不同處理組TLR3的mRNA水平：siEv70_2處理組的 TLR3mRNA水平高于對(duì)照組。其它處理組與對(duì)照組相比沒有明顯差異。siEv70_6(DNA:RNA 雜交體）激活TLR3能力弱于具有同樣序列的dsRNA(siEV70_2)。
[0039] 圖16顯示實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)不同處理組IL12amRNA水平：siEv70_2處理組的IL12a mRNA水平高于對(duì)照組。其它處理組與對(duì)照組相比沒有明顯差異。siEv70_6(DNA:RNA雜交 體）激活I(lǐng)L12a能力弱于具有同樣序列的dSRNA(SiEv70_2)。
[0040] 圖17a和17b顯示了病毒基因組的高度保守區(qū)。
[0041] 圖18a是pNF-kB-TA-luc的質(zhì)粒圖譜。圖18b是不同處理組激活的NF-kB的不 同水平。
[0042] 圖19a顯示在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微圖片（放大100X)。用 siEv70_6處理的激光光凝后第7天的樣品作為對(duì)照。細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE分別用熒光 DAPI(藍(lán)色）、同工凝集素-B4 (紅色）和鬼筆環(huán)肽（綠色）標(biāo)記。siEv70_6(DNA:RNA雜交 體）的CNV抑制效力弱于具有同樣序列的dsRNA(siEv70_2)。圖19b顯示在顯微鏡下觀察 到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微圖片（放大100X)。用siEv70_7處理的激光光凝后第7天的樣 品作為對(duì)照。細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE分別用熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集素-B4 (紅色）和 鬼筆環(huán)肽（綠色）標(biāo)記。沒有觀察到明顯的CNV抑制。
[0043] 圖20顯示了經(jīng)幻以￡￥70_2、8)阿瓦斯汀和〇5%葡萄糖刺激后觀察到的主動(dòng)脈 環(huán)內(nèi)皮發(fā)芽情況。
[0044] 圖21顯示在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微圖片（放大100X)。在CNV 小鼠中評(píng)價(jià)注射siEv70_2抑制激光誘導(dǎo)的CNV的劑量效應(yīng)關(guān)系。細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和 RPE分別用熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集素-B4(紅色）和鬼筆環(huán)肽（綠色）標(biāo)記。與未 處理組（圖21a-c)和陰性對(duì)照組（圖21d-f)相比，siEv70_2(2yg)(圖21m-〇)處理組， siEv70_2(10yg)(圖21p-r)處理組和poly(I:C)陽(yáng)性對(duì)照組（圖21g-i)的CNV面積明顯 減少。siEv70_2 (0. 2yg)處理組未觀察到CNV抑制效果（圖21j-1)。
[0045] 圖22顯示了CNV面積的盒須圖。Y軸表示CNV的面積，用平方微米（ym2)表示。 每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)CNV缺損（總數(shù)為 247)，包括siEv70_2(0. 2yg)(n= 41)、siEv70_2(2yg) (n= 52)、siEv70_2 (10yg)(n= 35)、poly(I:C)(n= 39)、GS(n= 40)和未處理組（n= 40) 〇
[0046] 圖23顯示在顯微鏡下觀察到的脈絡(luò)膜鋪片熒光顯微圖片（放大100倍）。在激 光誘導(dǎo)的CNV小鼠中評(píng)價(jià)玻璃體內(nèi)注射BM01對(duì)CNV的抑制效果。細(xì)胞核、內(nèi)皮細(xì)胞和RPE 分別用熒光DAPI(藍(lán)色）、同工凝集素-B4(紅色）和鬼筆環(huán)肽（綠色）標(biāo)記。與未處理組 (圖23&-(：)和陰性對(duì)照組（圖23(1-0相比，在811〇1處理組和口〇17(1 :〇處理組（圖23」-1 和圖23g-i)中CNV被明顯抑制。
[0047]圖24顯示CNV面積的盒須圖。Y軸表示CNV的面積，用平方微米（ym2)表示。每 個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)CNV缺損（總數(shù)為 155)，包括BM01(n= 36)、poly(I:C)(n= 39)、GS(n= 40)和未處理組（n= 40)。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面參考實(shí)施例以舉例說明的目的對(duì)本發(fā)明的幾個(gè)方面進(jìn)行描述。應(yīng)當(dāng)理解的 是，以下列出的許多具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法用以完整理解本發(fā)明。然而，相關(guān)領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明可不通過具體描述中的一個(gè)或一個(gè)以上方法來實(shí)施而以其 它方法實(shí)施。另外，本發(fā)明并不限于所示的行為或事件的順序，因?yàn)橐恍┬袨榭赡芤圆煌?順序和/或與其它行為或事件同時(shí)出現(xiàn)。此外，并不要求所有示出的動(dòng)作或事件均根據(jù)本 發(fā)明的方法來實(shí)施。
[0049] 本文使用的術(shù)語是用于描述特定實(shí)施方式，而無意限定本發(fā)明。除非另有明確說 明，本文所用的單數(shù)形式（"a"，"an"和"the"）也意在包括復(fù)數(shù)形式。此外，術(shù)語"包括"、 "包含"、"具有"、"有"、"帶有"或同類用法用在【具體實(shí)施方式】和/或權(quán)利要求書中，這些術(shù)語 意在包括與術(shù)語"包括"類似的方式。
[0050] 術(shù)語"約"或"大約"是指由本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的特定值的可接受的 誤差范圍，該誤差范圍部分取決于該值是如何被檢測(cè)或確定的，即，測(cè)量系統(tǒng)的限制。例如， 本領(lǐng)域中"大約"可意味著每次實(shí)施在1或1個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)偏差以內(nèi)。可選地，"大約"可意味 著高達(dá)給定值的20%，優(yōu)選地為高達(dá)給定值的10%，更優(yōu)選地為高達(dá)給定值的5%，并且還 更優(yōu)選地為高達(dá)給定值的1%?？蛇x地，對(duì)于生物系統(tǒng)或過程而言，該術(shù)語可意味著在一個(gè) 數(shù)量級(jí)之內(nèi)，優(yōu)選地為某個(gè)值的5倍之內(nèi)，更優(yōu)選地為某個(gè)值的2倍之內(nèi)。在本申請(qǐng)和權(quán)利 要求書中對(duì)具體值進(jìn)行描述的條件下，除非另有說明，認(rèn)為術(shù)語"約"是指在特定值的可接 受的誤差范圍內(nèi)。
[0051]I.小配體RNA
[0052] -方面，本發(fā)明提供了與用于調(diào)節(jié)Toll樣受體（TLR)的sliRNA有關(guān)的組合物和 方法，該RNA包括與病毒基因組序列的高度保守區(qū)的片段具有至少80%同源性的核苷酸序 列。
[0053] 本文所述的小配體RNA(sliRNA)是指作為TLR配體的RNA。
[0054] 術(shù)語"調(diào)節(jié)"或"調(diào)節(jié)表達(dá)"是指編碼基因的核酸分子（如DNA或RNA)的量或水 平升高（刺激）或降低（抑制）。抑制通常為調(diào)節(jié)表達(dá)的優(yōu)選形式，并且mRNA通常為優(yōu)選 的靶核酸。
[0055]Toll樣#體
[0056]Toll樣受體（TLR)在識(shí)別病原體成分以及隨后的激活先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要 作用，然后所述先天免疫反應(yīng)的激活引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。TLR由引起與病原相關(guān)分 子模式（PAMP)結(jié)合的大的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域和與分子結(jié)合并啟動(dòng)細(xì)胞免疫反應(yīng) 的細(xì)胞內(nèi)Toll/白介素-1受體（TIR)結(jié)構(gòu)域組成。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已鑒別出至少10種特 異性識(shí)別所有主要類別的病原體的TLR成員，在小鼠中已鑒別出11種特異性識(shí)別所有主要 類別的病原體的分子模式的TLR成員。TLR與親水性核酸至LPS范圍內(nèi)的多種多樣的配體 結(jié)合，而且，異源二聚作用擴(kuò)大了配體范圍。TLR2和TLR4識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞成分。TLR6與TLR2 結(jié)合識(shí)別多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分（Mariotti等人，Diversity2009, 1，7-18)。
[0057] 在一些實(shí)施方式中，Toll