發(fā)生，尤其是當該哺乳動物易感于所述疾 病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時；
[0043] (ii)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生；或者 [0044] (iii)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。
[0045] 文中在治療病癥中所用的術語"治療"通常涉及治療人類或動物（例如，被獸醫(yī)所 應用），其中可達到某些預期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展（包括降低發(fā)展速度、使發(fā) 展停止）、改善病癥和治愈病癥。還包括作為預防措施（例如預防）的治療。對還沒有發(fā)展 為病癥但有發(fā)展為該病癥危險的患者的用途，也包括在術語"治療"中。
[0046] 本發(fā)明所述的"ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用"表示TABl與ρ38 α相結合和/或TABl介 導ρ38α的自身磷酸化。
[0047] 本發(fā)明所述的"ΤΑΒ1/ρ38α相互作用導致的疾病"表示該疾病的發(fā)生與TABl/ ρ38 α相互作用相關，ΤΑΒ1/ρ38相互作用是疾病發(fā)生的一個因素或者全部因素。
[0048] ΤΑΒ1/ρ38α相互作用導致的疾病包括但不限于心肌缺血再灌注損傷。
[0049] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0050] 本發(fā)明首次發(fā)現了 ρ38α拮抗肽突變體ΡΤ5-4,其序列如SEQ ID NO. 6所示，與ΡΤ5 相比，該突變體對于ΤΑΒ1/ρ38α的結合抑制能力更強，且對TABl介導的ρ38α自身磷酸化 抑制能力更強。
【附圖說明】
[0051] 圖1顯示pGEX-KG-TABl和pET-32a_p38 α質粒雙酶切鑒定圖；
[0052] 圖2顯示GST-TABl融合蛋白考馬斯亮藍染色圖；
[0053] 圖3顯示His_p38 α融合蛋白考馬斯亮藍染色圖；
[0054] 圖4顯示利用GST-pull down和免疫印跡研宄ΡΤ5突變體對ΤΑΒ1/ρ38α結合的 影響；
[0055] 圖5顯示圖4所示的免疫印跡實驗結果的半定量分析圖；
[0056] 圖6顯示利用GST-pull down和免疫印跡研宄ΡΤ5突變體對ΜΚΚ6/ρ38α結合的 影響；
[0057] 圖7顯示圖6所示的免疫印跡實驗結果的半定量分析圖；
[0058] 圖8顯示利用體外激酶活性分析和免疫印跡研宄TABl蛋白對ρ38 α磷酸化的影 響；
[0059] 圖9顯示利用體外激酶活性分析和免疫印跡研宄ΡΤ5突變體對TABl介導的ρ38 α 自我磷酸化的影響；
[0060] 圖10顯示圖9所示的免疫印跡實驗結果的半定量分析圖；
[0061] 圖11顯示體外激酶活性分析和免疫印跡研宄ΡΤ5突變體對ΜΚΚ6介導的ρ38 α磷 酸化的影響；
[0062] 圖12顯示圖11所示的免疫印跡實驗結果的半定量分析圖。
【具體實施方式】
[0063] 以下結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。
[0064] 實施例1 pGEX-KG-TABl和pET-32a_p38 α原核表達載體的構建
[0065] 1、方法
[0066] I. I CaCl2法制備菌株JM109感受態(tài)
[0067] (1)將菌株JM109 (軍事醫(yī)學科學院基礎研宄所分子免疫室保存）涂布在無抗LB 平板上，37°C培養(yǎng)過夜，以活化菌株；
[0068] (2)從LB平板上挑取單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，按I :100~ 1 :50的比例接種于100mL無抗LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩2~3h至OD6ticinm^ 0. 5 ;
[0069] (3)將培養(yǎng)液轉入離心管中，冰上放置lOmin，離心10min以收集菌液；
[0070] (4)棄上清，用高壓預冷的0. 05mol/L的CaCl2溶液IOml輕輕懸浮菌株，冰上放置 15 ~30min 后，4°C，4000rpm 離心 IOmin ;
[0071] (5)棄上清，加入41111預冷的含15%甘油的0.05111〇1/1的0 &(：12溶液，輕輕懸浮菌 株，冰上放置5min后，100 μ 1/管分裝，-70°C可保存半年。
[0072] 1.2引物的設計合成
[0073] pET-32a載體帶有6 X His標簽和硫氧環(huán)蛋白的編碼序列，pGEX-KG載體5'端帶有 編碼GST蛋白的序列，便于用于蛋白的純化和檢測。根據美國國家生物技術信息（National Center of Biotechnology Information，NCBI)網站基因文庫中 TABl 和 ρ38α 的序列，自 行設計帶有酶切位點的5'端和3'端的寡核苷酸引物，以擴增DNA片段。TABl上游引物序 列如SEQ ID NO. 9所示，TABl下游引物序列如SEQ ID NO. 10所示，ρ38 α上游引物序列如 SEQ ID NO. 11所示，ρ38 α下游引物序列如SEQ ID NO. 12所示，引物設計信息見表1。
[0074] 表1引物設計
[0075]
[0076] I. 3 pGEX-KG-TABl 和 pET-32a_p38 α 重組質粒的構建
[0077] (I) TABl 和 ρ38 a DNA 片段的擴增
[0078] 以 pCDNA3. I (+) -XPRESS-TAB1 和 pCDNA3. I (+) -FLAG-p38 α 質粒為模版進行 PCR(質粒來源參考博士畢業(yè)論文《接頭蛋白TABl和GNB2L1調節(jié)ρ38 α的結構基礎》作者： 王慶陽第36-38頁）。
[0079] PCR 反應體系（總體積為 30 μ 1):模版 1 μ I ;2 X Taq MasterMix 酶 15 μ 1 ;5' 端 引物（ΙΟμΜ)ΙμΙ ;3' 端引物（ΙΟμΜ)ΙμΙ ;DMSO 0·5μ1 ;去離子水 11·5μ1。
[0080] PCR反應條件：①95°C預變性5min ;②94°C變性30s ;③58°C退火45s ;④72°C延 伸L 5min ;⑤到②循環(huán)25次；⑥72°C 5min。
[0081] (2)瓊脂糖凝膠電泳的分離與回收
[0082] 配制1. 2%的瓊脂糖凝膠，將全部？〇?產物和01^2000111&461'加入孔道中，20011^恒 流分離目的條帶，當Taq酶中的溴酚藍迀移至足夠分離DNA片段的距離時，在紫外燈（波長 310nm)下觀察，并切下目的條帶，按瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（購自TIANGEN公司）說明 書操作步驟回收目的DNA片段。
[0083] (3)將PCR擴增的目的片段和載體分別進行雙酶切
[0084] 酶切體系為：
[0085] 膠回收片段（總體積為 20 μ I) :10XCutsmart Buffer 2 μ I ;BamH I / Xba I 1 μ I ;HindIII 1 μ I ;膠回收片段 16 μ I ;100XBSA 0· 2 μ I ;
[0086] 載體（總體積為 20 μ I) :10 X Cutsmart Buffer 2 μ 1、BamH I /Xba I I μ I ; HindIII ΙμL ;載體2μ1 ;100XBSA 0·2μ1 ;去離子水 14μ1。
[0087] 37 °C水浴過夜。
[0088] (4)回收有粘性末端的目的片段和載體片段
[0089] 加入4 μ I 6 X Loading Buffer (購自TIANGEN公司），瓊脂糖凝膠電泳獲得目的基 因片段。方法同前所述。
[0090] (5) ΤΑΒ1/ρ38 α目的片段與pGEX-KG/pET-32a載體片段連接
[0091] 反應體系（總體積15μ1):目的片段11.5μ1 ;載體1.5μ1 ;T4連接酶緩沖液 1. 5 μ 1 ;Τ4 連接酶 1 μ 1 ;
[0092] 16°C 反應 2h。
[0093] (6)轉化
[0094] I)LB固體培養(yǎng)皿（含氨芐）放37°C孵箱中預熱；
[0095] 2)從-70°C冰箱中取出4管JM109感受態(tài)菌株，迅速插入冰中；
[0096] 3)吸取10 μ 1連接體系加入100 μ 1感受態(tài)中，輕輕吹打混勻；
[0097] 4)冰上放置30min，同時調水浴鍋至42°C ;
[0098] 5)42°C水浴鍋中熱休克90s，然后立即置冰上冷卻2min ;
[0099] 6)每管中加入500 μ1無抗的LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床上震蕩45min，轉速 150rpm ；
[0100] 7)6000rpm離心lmin，棄部分上清，剩余約100 μ I LB，重懸細菌，混勾后均勾涂布 在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上。待液體被吸收后，將平皿倒置放入37°C孵箱中過夜培養(yǎng)；
[0101] (7)菌落PCR鑒定
[0102] 挑取單克隆菌落，至5ml含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。過夜 培養(yǎng)的菌液取出50 μ 1，離心后去上清，生理鹽水100 μ 1重懸，沸水煮lOmin，離心后取2 μ 1 作為模板進行PCR，進行PCR鑒定，PCR條件和步驟同前所述。
[0103] 反應體系為：
[0104] 菌液上清 2μ1 ;2XTaq MasterMix 酶 10μ1 ;5' 端引物（10μΜ)1μ1 ;3' 端引物 (10 μ Μ) 1 μ I ;DMS0 0· 5 μ 1 ;去離子水 5. 5 μ 1 〇
[0105] (8)選取3個陽性克隆送公司測序。
[0106] 挑取陽性克隆送北京天一輝遠公司測序。
[0107] L 4 重組 pGEX-KG-TABl 和 pET-32a-p38 α 質粒的擴增
[0108] 對測序正確的質粒按無內毒素質粒中提試劑盒說明書（購自康為世紀公司）的步 驟中提質粒，用于下一步的實驗。
[0109] 2、結果
[0110] 2.1雙酶切鑒定
[0111] pGEX-KG-TABl 和 pET-32a-p38 α 質粒分別用 Xba I /Hind III和 BamH/Hind III進 行雙酶切，PGEX