一種治療心肌缺血再灌注損傷的多肽藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，涉及一種治療心肌缺血再灌注損傷的多肽藥物，具 體涉及ρ38 α拮抗肽突變體PT5-4及其在制備治療心肌缺血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 缺血性心臟病是導(dǎo)致人類死亡的主要原因，在治療上，早期成功恢復(fù)心肌再灌注 是改善臨床轉(zhuǎn)歸的最有效方法。但缺血心肌恢復(fù)血流的過程可造成損傷，這一現(xiàn)象稱為心 肌缺血 / 再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI)。。I/R 將會帶 來一些不良效應(yīng)，例如氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)鈣超載等，這些不良反應(yīng)會導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。細(xì) 胞凋亡是缺血再灌注組織損傷功能喪失的重要原因，它是一個很復(fù)雜的過程，其詳細(xì)的觸 發(fā)機(jī)制尚不完全明確。
[0003] 研宄表明，在缺血再灌注過程中TABl與ρ38 α相互作用以及TABl介導(dǎo)的ρ38 α 旁路活化在其中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞內(nèi)存在有許多能與TABl和ρ38α發(fā)生相互作用的分子， 我們希望獲得能夠特異性的阻斷ΤΑΒ1/ρ38 α結(jié)合的能力，而不會對ΤΑΒ1、ρ38 α與其他蛋 白質(zhì)的相互作用產(chǎn)生影響的ρ38α拮抗肽。目前，能夠有效降低心肌缺血再灌注損傷的干 預(yù)策略和治療藥物還非常有限。因此本發(fā)明的進(jìn)行可以為心肌缺血再灌注損傷的治療提供 一種具有臨床應(yīng)用價值的候選藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種ρ38 α拮抗肽突變體ΡΤ5-4。經(jīng)GST-pull實(shí)驗(yàn)和 Kinase assay實(shí)驗(yàn)證明：PT5突變體PT5-4對于TABl與ρ38α相互作用的抑制能力更強(qiáng)， 但是同時ΡΤ5突變體ΡΤ5-4并不影響ρ38 α經(jīng)典活化途徑中ΜΚΚ6/ρ38 α的相互作用。所 述的"相互作用的抑制"包括結(jié)合抑制以及自身磷酸化的抑制。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種ρ38 α拮抗肽突變體，所述突變體命名為ΡΤ5-4,所述ΡΤ5-4的 氨基酸序列為以下組中的任意一個：
[0007] (1)如SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列；
[0008] (2)在SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或 幾個氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。
[0009] 優(yōu)選地，所述PT5-4的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0010] 通常，已知的是，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0011] 本發(fā)明的ρ38 α拮抗肽突變體PT5-4也包括對SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列的 非保守修飾，只要經(jīng)過修飾的多肽仍然能夠保留P38 α拮抗肽突變體PT5-4的生物學(xué)活性 即可。在此類修飾中突變的氨基酸數(shù)目是3個或者更少。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種編碼上述突變體的DNA分子。
[0013] 本發(fā)明提供了一種重組載體，所述載體包括前面所述的DNA分子。
[0014] 所述重組載體可以是病毒載體或者非病毒載體。
[0015] 非病毒載體包括但不限于線性核酸、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒（cosmid)、RNA載體。
[0016] 本發(fā)明的病毒載體包括但不限于腺病毒載體（adenoviral vectors)、腺相關(guān)病 毒載體（adeno-associated viral vectors)、反車專錄病毒載體（retroviral vectors)、 單純皰疼病毒載體（herpes simplex virus-based vectors)、慢病毒載體（lentiviral vectors)〇
[0017] 如本文中所使用，術(shù)語"載體"應(yīng)理解為意指包含了能夠并入到宿主細(xì)胞中并與宿 主細(xì)胞基因組重組并整合到宿主細(xì)胞基因組中，或作為游離體自主復(fù)制的核苷酸序列的任 何核酸。此類載體包括線性核酸、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒（cosmid)、RNA載體、病毒載體等。
[0018] 在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于：表達(dá)載體、克隆載體，例如適用于原核（如 大腸桿菌等細(xì)菌）、低等真核細(xì)胞（如酵母）、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞中的載體。 總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。在表達(dá)載體中，除了含有 復(fù)制起點(diǎn)外，還可含有標(biāo)記基因和其他翻譯控制元件。
[0019] 本發(fā)明還提供了包含上述重組載體的宿主細(xì)胞。
[0020] 進(jìn)一步，宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞； 或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏 菌的細(xì)菌細(xì)胞：真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CH0、C0S、293細(xì)胞、 或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
[0021] 本發(fā)明還提供了前面所述的PT5-4突變體在制備抑制TAB1/P38 α相互作用的藥 物中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明還提供了編碼ΡΤ5-4突變體的DNA分子在制備抑制ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用 的藥物中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明還提供了包含編碼ΡΤ5-4突變體的DNA分子的重組載體在制備抑制TABl/ ρ38α相互作用的藥物中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供了包含前面所述的重組載體的宿主細(xì)胞在制備抑制ΤΑΒ1/ρ38α相 互作用的藥物中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明還提供了前面所述的ΡΤ5-4突變體在制備治療ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用導(dǎo)致 的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明還提供了編碼ΡΤ5-4突變體的DNA分子在制備治療ΤΑΒ1/ρ38 α相互作用 導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明還提供了包含編碼ΡΤ5-4突變體的DNA分子的重組載體在制備治療TABl/ ρ38α相互作用導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明還提供了包含前面所述的重組載體的宿主細(xì)胞在制備治療ΤΑΒ1/ρ38α相 互作用導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明還提供了前面所述的ΡΤ5-4突變體在制備治療心肌缺血再灌注損傷的藥 物中的應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明還提供了編碼PT5-4突變體的DNA分子在制備治療心肌缺血再灌注損傷的 藥物中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供了包含編碼PT5-4突變體的DNA分子的重組載體在制備治療心肌缺 血再灌注損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0032] 本發(fā)明還提供了包含前面所述的重組載體的宿主細(xì)胞在制備治療心肌缺血再灌 注損傷的藥物中的應(yīng)用。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含前面所述的PT5-4突變 體、編碼PT5-4突變體的DNA分子、包含編碼PT5-4突變體的DNA分子的重組載體、或包含 前面所述的重組載體的宿主細(xì)胞。
[0034] 進(jìn)一步，本發(fā)明的所述藥物組合物還包含一種或多種對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言為 公知的其它藥學(xué)上可接受的成分，該成分包括但不限于藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦 形劑、佐劑、緩沖劑、PH調(diào)節(jié)劑、防腐劑、抗氧化劑、抑菌劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、增溶劑、表面活 性劑（例如潤濕劑）、著色劑和致等滲（isotonicizing)溶質(zhì)（即其使制劑與目標(biāo)患者的 血液或其它相關(guān)的體液等滲）。適當(dāng)?shù)妮d體、稀釋劑、賦形劑等可以在標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)書籍中找 到。參見，例如藥物添加劑手冊（Handbookof Pharmaceutical Additives)，第二版（編者 M.Ash 和 I. Ash)，2001(Synapselnformation Resources, Inc. ,Endicott, New York,USA)； Remington' sPharmaceutical Science，第18版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.， 1990;以及藥物賦形劑手冊（Handbook ofPharmaceutical Excipients)，第二版，1994。
[0035] 文中使用的術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"涉及化合物、成分、材料、組合物、劑型等，它們 在醫(yī)學(xué)判斷的合理范圍內(nèi)，適于與上述患者（例如人類）的組織接觸，并未帶來過度的不希 望的毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，并有合理的益處/風(fēng)險比。每種載體、稀 釋劑、賦形劑等還必須就與組合物的其它成分可配伍的意義而言是"可接受的"。
[0036] 本發(fā)明的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑給藥，包括但不局限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼 內(nèi)，動脈內(nèi)，肺內(nèi)，口服，小泡內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸 入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關(guān)節(jié)內(nèi)，心室內(nèi)，直腸，陰道，顱骨內(nèi)，尿道內(nèi)，肝內(nèi)，瘤內(nèi)。在某些 情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。
[0037] 根據(jù)藥物組合物的施用形式，可將藥物組合物制備成相應(yīng)的各種劑型，所述劑型 包括但不限于藥物組合物被制備為胃腸外、經(jīng)皮、粘膜、鼻、口頰、舌下或經(jīng)口使用的片劑、 溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。
[0038] 供治療的受試者為經(jīng)歷心肌缺血再灌注損傷的患者，受試者包括但不限于哺乳動 物。就治療目的而言，"哺乳動物"指歸類為哺乳動物的任何動物，包括人，家養(yǎng)和農(nóng)用動物， 以及動物園動物（zoo animal)、運(yùn)動動物（sports animal)和寵物，如狗、馬、貓、母牛等。 優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
[0039] 應(yīng)了解，用于任何特定受試者的治療劑量水平和劑量頻率可以變化，并且將取決 于多種因素，包括所用藥物組合物的活性；該藥物組合物的代謝穩(wěn)定性和作用時間長度； 受試者的物種、年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；施用的模式和時間；排泄速率和清 除率；藥物組合；及特定病狀的嚴(yán)重程度。
[0040] 本發(fā)明的藥物組合物可以單獨(dú)使用，或與可用于治療心肌缺血再灌注損傷的其它 適合的治療劑組合使用?；蛘吲c其他治療心肌缺血損傷手術(shù)方法一起使用。
[0041] 本文所用的"進(jìn)行治療"或"治療"涵蓋患有相關(guān)疾病或病癥的哺乳動物例如人類 中治療相關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：
[0042] (i)預(yù)防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動物中