一種活性玉米須純多糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種活性玉米須純多糖的制備方法，屬于天然植物活性多糖的提取分離技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米須{Stigmata mad is)別名玉米麥、棒子毛，禾本科玉蜀屬植物玉米{Zea maysL.)的花柱，是一種傳統(tǒng)的中草藥，在《滇南本草》、《中藥大辭典》等都有記載，為《中華人民共和國衛(wèi)生部藥材標(biāo)準(zhǔn)》1985版(一部)收錄的常用藥材品種。
[0003]我國是玉米生產(chǎn)大國，玉米年產(chǎn)量居世界第2位。因此，作為玉米副產(chǎn)物的玉米須的資源十分豐富。
[0004]多糖類化合物是玉米須所含重要的化學(xué)成分之一，現(xiàn)已證明，玉米須中多糖含量較高，初步研宄表明玉米須多糖具有護肝、降糖、調(diào)節(jié)免疫、抗菌、抗腫瘤、利尿和解熱等作用，故玉米須多糖類是玉米須的主要有效成分。臨床試驗證實，多糖類還可作為腫瘤化學(xué)治療和放射治療的有效輔助治療藥，在醫(yī)藥、食品方面均有很好的應(yīng)用前景和開發(fā)價值。
[0005]目前玉米須多糖的生物活性研宄主要集中在多糖粗品，多糖含量較低，還沒有玉米須多糖純品。本發(fā)明綜合運用超濾和離子層析分離技術(shù)，建立一種玉米須多糖純品的制備方法。免疫活性研宄發(fā)現(xiàn)，該方法制備的玉米須純多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種活性玉米須純多糖的制備方法。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種活性玉米須純多糖的制備方法，包括如下步驟:
1.玉米須的預(yù)處理
玉米須除雜后，于60-70 °C下烘干，置于干燥環(huán)境自然冷卻后粉碎至60目。
[0008]2.玉米須的脫脂
玉米須粉按質(zhì)量體積比1:5加入95%乙醇或無水乙醇浸泡12小時，減壓過濾，濾渣同法再重復(fù)浸泡I次后于陰涼處自然干燥，并于干燥環(huán)境保存?zhèn)溆谩?br>[0009]3.粗多糖制備
按1:15質(zhì)量體積比加入蒸餾水，在95-100 °C下浸提2小時。提取液5000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀。沉淀同法再浸提I次。合并兩次提取液。提取液經(jīng)12000r/min高速離心20 min，制備多糖浸提清液。浸提清液經(jīng)截留分子量為10 KDa超濾膜超濾，去除小分子物質(zhì)。最后將濃縮液繼續(xù)超濾至干物質(zhì)含量達(dá)15-20%，冷凍干燥，獲得玉米須粗多糖粉。
4.多糖純化
制備粗多糖溶液，10000 r/min離心20 min。經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析(2.6 mmX 100 cm)，先用蒸飽水洗脫，再用NaCl梯度洗脫，最大濃度2.0mol/L。上樣量:14 mg/mL，共28 mL。收集18 mL/管，樣品峰10-23管，濃縮后，用截留分子量為8_12kDa透析袋，蒸餾水透析2天，冷凍干燥。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明綜合運用超濾和離子層析分離技術(shù)，建立一種玉米須多糖純品的制備方法，本發(fā)明的原料玉米須資源豐富，所得的玉米須純多糖是均一多糖，免疫活性研宄發(fā)現(xiàn)，該方法制備的玉米須純多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性。
【附圖說明】
[0011]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進一步說明。
[0012]圖1為本發(fā)明的HPSEC圖譜。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
一種活性玉米須純多糖的制備方法，包括如下步驟:
1.玉米須的預(yù)處理
玉米須除雜后，于65 °C下烘干，置于干燥環(huán)境自然冷卻后粉碎至60目。
[0014]2.玉米須的脫脂
玉米須粉按質(zhì)量體積比1:5加入95%乙醇或無水乙醇浸泡12小時，減壓過濾，濾渣同法再重復(fù)浸泡I次后于陰涼處自然干燥，并于干燥環(huán)境保存?zhèn)溆谩?br>[0015]3.粗多糖制備
按1:15質(zhì)量體積比加入蒸餾水，在95 °C下浸提2小時。提取液5000 r/min離心10min，分別收集上清和沉淀。沉淀同法再浸提I次。合并兩次提取液。提取液經(jīng)12000 r/min高速離心20 min，制備多糖浸提清液。浸提清液經(jīng)截留分子量為10 KDa超濾膜超濾，去除小分子物質(zhì)。最后將濃縮液繼續(xù)超濾至干物質(zhì)含量達(dá)20%，冷凍干燥，獲得玉米須粗多糖粉。
4.多糖純化
制備粗多糖溶液，10000 r/min離心20 min。經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析(2.6 mmX 100 cm)，先用蒸飽水洗脫，再用NaCl梯度洗脫，最大濃度2.0 mol/L。上樣量:14 mg/mL，共28 mL。收集18 mL/管，樣品峰10-23管峰，濃縮后，用截留分子量為8-12 kDa透析袋，蒸餾水透析2天，冷凍干燥。
[0016]純度鑒定:
HPSEC層析:配置測試樣品1.4 mg/mL，于12000 r/min 4 °C離心20 min，取上清液上樣分析。
[0017]HPLC的具體分析測試條件如下:島津高效液相色譜系統(tǒng):泵LC-20AT，示差檢測器RID-10A，柱溫箱CT0-20A ^TSK 3000 PffXLC7.8 mmX 300 mm);流速為0.5 mL/min，柱溫為30±0.1 °C，上樣 20 yLo 流動相為 pH 為 5.6 的 0.1 mol/L NaH2PO3和 0.3 mol/L NaNO30
[0018]結(jié)果見圖1。樣品洗脫后呈現(xiàn)均勻?qū)ΨQ峰，表明該多糖是均一多糖。經(jīng)測定多糖分子量為166.2 KDa0
[0019]免疫調(diào)節(jié)作用研宄:
頸椎脫白處死小鼠，無菌條件下取脾，置于100目滅菌不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器內(nèi)塞將脾研碎，過篩，用PBS沖洗網(wǎng)篩2-3遍，脾細(xì)胞的懸液轉(zhuǎn)入無菌的離心管中，再加入PBS至30-40 mL，400 G離心6 min，收集細(xì)胞，在室溫下加NH4Cl溶液(1.5 mL/只)，不斷槍打或搖晃混勻細(xì)胞10分鐘，以裂解紅細(xì)胞，加PBS至30-40 mL，400 G離心5 min，去上清，加入少量RPMI1640培養(yǎng)基細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)后，用RPMI1640稀釋細(xì)胞懸液至2 X 16個/mL。取180KL細(xì)胞懸浮液加至96孔板中，分別加入20 μ?的不同的樣品和陽性對照植物血凝素，陰性對照PBS。在37° C和5% CO2的條件下培養(yǎng)3天后，用ELISA自動讀板儀分別測定570 nm和600 nm的吸光度，加入20 μ? Alamar Blue顯色劑，培養(yǎng)6-8小時，再次測定570 nm和600 nm的吸光度，然后根據(jù)Alamer Blue Assay給的公式計算各樣品對淋巴細(xì)胞的激活率。
[0020]淋巴細(xì)胞增殖率(%) = [117216 X Αλ 570 (sample)-80586 X Αλ600 (sample)] /[117216XAx570(control)-80586XAx600(control)] X100% ；
實驗結(jié)果顯示，在低濃度(50 μ g/mL)時，增值率為140%;當(dāng)濃度增加到200 yg/mL增值率達(dá)到213% ;繼續(xù)增加濃度至500 μ g/mL時，增值率達(dá)到289% (陽性對照60 μ g/mL植物凝聚素增值率272%)。表明玉米須純多糖具有較好的刺激淋巴細(xì)胞增殖作用，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。
【主權(quán)項】
1.一種活性玉米須純多糖的制備方法，包括如下步驟: . 1、玉米須的預(yù)處理 玉米須除雜后，于60-70 °C下烘干，置于干燥環(huán)境自然冷卻后粉碎至60目； . 2、玉米須的脫脂 玉米須粉按質(zhì)量體積比1:5加入95%乙醇或無水乙醇浸泡12小時，減壓過濾，濾渣同法再重復(fù)浸泡I次后于陰涼處自然干燥，并于干燥環(huán)境保存?zhèn)溆茫?. 3、粗多糖制備 按1:15質(zhì)量體積比加入蒸餾水，在95-100 °C下浸提2小時；提取液5000 r/min離心.10 min，分別收集上清和沉淀；沉淀同法再浸提I次，合并兩次提取液；提取液經(jīng)12000 r/min高速離心20 min，制備多糖浸提清液，浸提清液經(jīng)截留分子量為10 KDa超濾膜超濾，去除小分子物質(zhì)，最后將濃縮液繼續(xù)超濾至干物質(zhì)含量達(dá)15-20%，冷凍干燥，獲得玉米須粗多糖粉； . 4、多糖純化 制備粗多糖溶液，10000 r/min離心20 min，經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析(2.6 mmX 100 cm)，先用蒸飽水洗脫，再用NaCl梯度洗脫，最大濃度2.0 mol/L，上樣量:14 mg/mL，共28 mL，收集18 mL/管，樣品峰10-23管，濃縮后，用截留分子量為8_12kDa透析袋，蒸餾水透析2天，冷凍干燥。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種活性玉米須純多糖的制備方法，屬于天然植物活性多糖的提取分離技術(shù)領(lǐng)域。該活性玉米須純多糖經(jīng)過玉米須的預(yù)處理、脫脂、粗多糖制備及多糖純化步驟，綜合運用超濾和離子層析分離技術(shù)制備而得，所得的玉米須純多糖是均一多糖，免疫活性研究發(fā)現(xiàn)，該方法制備的玉米須純多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性。
【IPC分類】C08B37/00
【公開號】CN104945533
【申請?zhí)枴緾N201510449506
【發(fā)明人】宮春宇, 余世鋒, 鄭喜群, 王文俠, 張慧君
【申請人】齊齊哈爾大學(xué)
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月28日