一種具有抗病毒和免疫活性的亞麻籽多糖的制備及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥和功能性食品領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗病毒和免疫活性的 亞麻籽多糖的制備及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 亞麻（Linum ustitatissimum L.)又稱胡麻，屬亞麻科、亞麻屬植物。作為一種傳 統(tǒng)的油料作物，亞麻籽富含不飽和脂肪酸、必需氨基酸、維生素E及糖類化合物等多種營(yíng)養(yǎng) 成分，其中多糖類物質(zhì)主要存在于亞麻籽殼中，含量隨產(chǎn)地和品種不同而有所差異。
[0003] 多糖又稱多聚糖（Polysaccharide)，是由10個(gè)以上的單糖通過糖苷鍵連接而成 的一種高分子化合物，其相對(duì)分子質(zhì)量為數(shù)萬至數(shù)百萬。多糖在自然界分布極廣，在高等植 物、藻類、菌類及動(dòng)物體內(nèi)均有存在，如真菌多糖、植物多糖、動(dòng)物多糖、藻類多糖、細(xì)菌多糖 等，是自然界含量最豐富的生物聚合物，已知的天然多糖化合物約有300多種。多糖具有多 種生物學(xué)功能，如細(xì)胞特異性識(shí)別，細(xì)胞表面對(duì)各種抗原和藥物的受體，激活免疫細(xì)胞等， 尤其是植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等多種生物活性，愈來愈引起人們 的興趣。植物多糖作為天然活性物質(zhì)，最大優(yōu)點(diǎn)是毒副作用小，來源廣泛。此外，研究表明， 具有硫酸酯結(jié)構(gòu)的多糖通常表現(xiàn)出較強(qiáng)抗病毒活性，而具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖其免疫調(diào)節(jié) 功能要顯著高于其它多糖。多糖類物質(zhì)具有廣泛多樣化的生理功能且對(duì)機(jī)體幾乎沒有毒副 作用，是理想的藥物賦形劑。
[0004] 傳統(tǒng)亞麻籽多糖的提取多采用熱水浸提法，目前公開的與亞麻籽多糖提取相關(guān)的 專利有：中國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)CN1221771、CN1242952、CN1263139,這些專利涉及的內(nèi)容都 是關(guān)于傳統(tǒng)的熱水浸提亞麻籽膠工藝的改進(jìn)，所提取的亞麻籽多糖未發(fā)現(xiàn)有硫酸酯基團(tuán)和 三螺旋高級(jí)結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有抗病毒 和免疫活性的亞麻籽多糖的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述制備方法獲得的具有抗病毒和免疫活性的亞 麻籽多糖。
[0007] 本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述具有抗病毒和免疫活性的亞麻籽多糖的應(yīng)用。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] -種具有抗病毒和免疫活性的亞麻籽多糖的制備方法，包括以下步驟：
[0010] (1)亞麻籽殼仁分離：亞麻籽經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過篩，將過篩后的亞麻籽粉與甘油 和乙醇充分混和，離心20~30min，分別收集上層亞麻籽仁和沉積在底層的亞麻籽殼；
[0011] (2)亞麻籽多糖的提?。阂圆襟E（1)獲得的亞麻籽殼為原料，微波輔助熱水浸提多 糖，提取液過篩，收集濃縮液，真空冷凍干燥；
[0012] (3)亞麻籽多糖的分離：將步驟（2)冷凍干燥后的粗提物用Sevage法脫蛋白25~ 30次，3500~5000r/min離心20~30min，取上清液；向上清液中加入無水乙醇，靜置沉淀 (即醇沉）4~12h，3500~5000r/min離心20~30min，取沉淀，真空冷凍干燥后得到亞麻 籽粗多糖；
[0013] (4)亞麻籽多糖的純化：將步驟（3)獲得的亞麻籽殼粗多糖配成5~8mg/mL溶液， 用層析柱A純化，水洗并用苯酚硫酸法檢測(cè)多糖，合并糖反應(yīng)陽性收集液，50~60°C旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)濃縮，透析后真空冷凍干燥；將干燥后的多糖配成2~5mg/mL溶液，用層析柱B純化，用 蒸餾水洗脫，收集多糖組分，透析，超濾，濃縮、冷凍干燥，得到所述具有抗病毒和免疫活性 的亞麻籽多糖（FHP-1)。
[0014] 步驟（1)所述的亞麻籽殼仁分離是根據(jù)不同體積比的甘油和乙醇（15 :3~4)利 用密度差實(shí)現(xiàn)亞麻籽殼仁的有效分離，亞麻籽粉碎后過20目篩。
[0015]步驟（2)所述的微波輔助熱水浸提的條件為：料液比1:20~l:30(w/v)、浸提溫 度60~100°C、浸提時(shí)間40~60min、輸出功率600~800W、攪拌速度600~900r/min ;微 波輔助熱水浸提所得的提取液過100目篩。
[0016] 步驟（3)所述的Sevage試劑的配制方法為將氯仿、正丁醇按體積比3 :1~5 :1混 合。
[0017] 步驟（3)所述的Sevage法脫蛋白的方法具體為：將步驟（2)冷凍干燥后的粗提物 與Sevage試劑按體積比1 :1~1 :3混合，振搖20~30min，3500~5000r/min離心20~ 30min，取出上層多糖溶液；再按上述步驟重復(fù)25~30次（即把所得上層溶液重復(fù)如下處 理過程25~30次：與Sevage試劑按體積比1 :1~1 :3混合，振搖20~30min，3500~ 5000r/min離心20~30min，取上層溶液）。
[0018] 步驟（3)所述的無水乙醇加入量為亞麻籽殼粗多糖溶液體積（是指上層溶液）的 3~5倍，加入無水乙醇后于4°C下靜置沉淀4~12h。
[0019] 上清液有3層，下面那層是澄清的（有機(jī)試劑），中間那層是白色乳化層（蛋白 層），最上面那層是亞麻籽殼粗多糖多糖溶液。
[0020] 步驟（4)所述的亞麻籽多糖純化過程中所用柱層析A為DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱，所述層析柱B為Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱；所述超濾過程中所用的 膜截留分子量為1 X 106Da ;所述透析時(shí)間為48小時(shí)，透析袋截留分子量為3000~5000Da。
[0021] 上述制備方法獲得的具有抗病毒和免疫活性的亞麻籽多糖（FHP-1)，所述亞麻籽 硫酸酯多糖（FHP-1)組分均一，經(jīng)凝膠滲透色譜（GPC)測(cè)定其平均分子量為2626kDa，經(jīng)衍 生化后氣相測(cè)定發(fā)現(xiàn)其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和巖藻糖七 種單糖組成。
[0022] 所述具有抗病毒和免疫活性的亞麻籽多糖具有三螺旋結(jié)構(gòu)及硫酸酯基團(tuán)的特殊 結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有抗乙肝病毒和增強(qiáng)免疫應(yīng)答的功能。
[0023] 所述具有抗病毒和免疫活性的亞麻籽多糖（FHP-1)同時(shí)具有抗乙肝病毒和增強(qiáng) 免疫應(yīng)答的功能，可將其作為預(yù)防乙肝病毒HBV感染、治療免疫缺陷或改善免疫力低下的 功能性食品。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0025] (1)本發(fā)明在傳統(tǒng)的熱水浸提法中引入微波輔助提取技術(shù)，利用微波熱效應(yīng)使萃 取體系中的溶劑更高效地破壞亞麻籽殼表皮組織中的細(xì)胞壁，使多糖內(nèi)容物更好地被提取 出來。本方法與傳統(tǒng)的熱水浸提法（溫度、料液比相同的條件下）相比，得到相同提取率的 亞麻籽硫酸酯多糖，提取時(shí)間縮短了 6~8倍，大大地提高了提取效率。
[0026] (2)為了深入開發(fā)利用亞麻籽資源，我們還對(duì)分離純化后亞麻籽硫酸酯多糖進(jìn)行 了化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定、抗病毒試驗(yàn)以及免疫調(diào)節(jié)活性試驗(yàn)。本發(fā)明首次利用不同比例的甘油和 乙醇實(shí)現(xiàn)了亞麻籽殼仁的有效分離，結(jié)構(gòu)鑒定中首次發(fā)現(xiàn)亞麻籽硫酸酯多糖具有三螺旋高 級(jí)結(jié)構(gòu)及硫酸酯基團(tuán)，并首次證明了亞麻籽硫酸酯多糖具有抗乙肝病毒活性和免疫調(diào)節(jié)活 性，在預(yù)防HBV的藥品及提高機(jī)體免疫功能的食品和保健品領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
[0027] 亞麻籽硫酸酯多糖（FHP-1)經(jīng)剛果紅實(shí)驗(yàn)分析，F(xiàn)HP-1與剛果紅形成絡(luò)合物的最 大吸收波長(zhǎng)同空白對(duì)照剛果紅相比發(fā)生紅移。表明FHP-1能與剛果紅形成絡(luò)合物，有規(guī)則 的三螺旋構(gòu)象。元素分析表中含有〇. 85%的S元素，經(jīng)硫酸鋇比濁法測(cè)定FHP-1中的硫酸 基含量為2. 63%，結(jié)合紅外圖譜中，1244cm1為S = 0伸縮振動(dòng)，823. 71cm 1硫酸基位于單 糖殘基的平伏位置，表明亞麻籽硫酸酯多糖FHP-1中存在少量的硫酸酯結(jié)構(gòu)。
[0028] 毒性試驗(yàn)顯示，本發(fā)明亞麻籽硫酸酯多糖（FHP-1)多糖在1000mg/mL濃度下對(duì) IfepG2. 2. 15、RAW264. 7細(xì)胞無細(xì)胞毒性；添加了 FHP-1的藥物組與空白對(duì)照相比，能明顯夠 降低乙肝表面抗原（HBsAg)、乙肝e抗原（HBeAg)的表達(dá)和抑制乙肝病毒DNA的表達(dá)水平， 同時(shí)FHP-1顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞Raw264. 7分泌腫瘤壞死因子TNF-a、白細(xì)胞介素IL-6、 IL-12及炎癥因子N0,具有顯著的抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能，可用于作為預(yù)防HBV的藥品 以及提高機(jī)體免疫功能的食品和保健品。本發(fā)明公布的亞麻籽硫酸酯多糖制備方法簡(jiǎn)單可 靠，可大規(guī)模生產(chǎn)。
[0029] (3)本發(fā)明亞麻籽原料來源廣泛，方法簡(jiǎn)單可靠，產(chǎn)品安全性高，無毒副作用，可大 批量生產(chǎn)，有望開發(fā)成預(yù)防乙型肝炎的藥品及提高機(jī)體免疫力的功能性食品。
【附圖說明】
[0030] 圖1是亞麻籽硫酸酯多糖的提取純化及應(yīng)用技術(shù)流程圖。
[0031] 圖2是亞麻籽殼表面的掃描電鏡圖，其中a為微波輔助提取前，b為微波輔助提取 后。
[0032] 圖3是亞麻籽粗多糖純化DEAE-Sepharose Fast Flow洗脫曲線。