一種新的貝殼烯酸-13α-羥化酶、其編碼基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物工程領(lǐng)域，提供了一種新的甜葉菊來源的貝殼烯 酸-13 α-羥化酶（KAH)基因及在甜菊糖苷生物合成中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著肥胖和高血壓等心血管疾病對人類健康的威脅加劇，人類對新型甜味劑的需 求越來越迫切。甜菊糖苷是一種產(chǎn)自菊科植物甜葉菊（Stevia RebaudianaBertoni)中的 二萜類糖苷化合物，具有高甜度、低熱能的特點(diǎn)，其甜度是蔗糖的200-300倍，熱值僅為蔗 糖的1/300。甜菊糖在南美和東亞地區(qū)被廣泛地作為藥草和代糖已經(jīng)有幾百年歷史，經(jīng)常食 用甜菊糖可預(yù)防高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥。隨著歐美等國對甜菊糖安全 性的逐漸認(rèn)可，甜葉菊作為新型甜味劑和功能性食品添加劑將具有越來越大的市場。
[0003] 目前有關(guān)甜菊糖苷生物合成途徑研究相對比較清楚。作為典型的二萜類化合物， 甜菊糖苷主要由廠類的通用前體-3個異戊烯焦磷酸（Isopentyl diphosphate, ΙΡΡ) 和1個二甲基丙烯基焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate, DMAPP)單元經(jīng)櫳牛兒基櫳牛 兒基焦憐酸合成酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)，ent_ 柯巴基焦憐酸 合成酶（ent-copalyl diphosphate synthase，CDPS)，貝殼烯合成酶（Kaurene synthase， KS)形成二萜骨架貝殼烯。隨后貝殼烯烴兩步細(xì)胞色素 P450酶，即貝殼烯氧化酶（Kaurene oxidase，K0)和貝殼烯酸-13 α-輕化酶（13 a-kaurenoic acid hydroxylase，KAH)，分別 在二萜骨架的C19和C13位形成羧基和羥基，形成重要中間體甜菊糖醇。最后甜菊醇經(jīng)四 步糖基化反應(yīng)，最終形成甜菊糖萊鮑迪式A(Rebaudioside A)，如圖1所示。
[0004] 目前甜菊糖合成途徑中所有酶的基因均已經(jīng)獲得了報(bào)道，并為植物細(xì)胞遺傳改造 提高甜菊糖產(chǎn)量和微生物異源合成甜菊糖苷的研究打下了基礎(chǔ)。作為催化貝殼烯酸到甜菊 醇的第二個細(xì)胞色素 P450酶KAH，雖已經(jīng)有多個甜葉菊來源的序列被報(bào)道，而且部分序列 已經(jīng)在植物中過表達(dá)以改善甜菊糖苷合成或酵母細(xì)胞中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究，但其目前仍是 甜菊糖生物合成的限速步驟，而且仍然未有能夠在原核宿主中活性表達(dá)KAH的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的貝殼烯酸-13 α -羥化酶、其編碼基因及其應(yīng)用。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的貝殼烯酸-13 α -羥化酶，其選自下組：
[0007] (a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；
[0008] (b)將SEQ ID NO: 2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個（如1-20個，較佳地1-10個；更 佳地1-5個；更佳地1-3個）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)多肽功 能的由（a)衍生的多肽；
[0009] (C)具有（a)多肽功能的SEQ ID NO:2的蛋白片段；或
[0010] ⑷具有（a)多肽功能的且與（a)多肽具有90%以上（較佳地95%以上；更佳地 98%以上；更佳地99%以上）氨基酸序列相同性的多肽。
[0011] 在一個優(yōu)選例中，所述的貝殼烯酸-13 α -羥化酶來源于甜葉菊。
[0012] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多核苷酸，其編碼如所述的貝殼烯 酸-13 α -輕化酶。
[0013] 在一個優(yōu)選例中，提供該多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示（密碼子優(yōu)化 序列）。
[0015] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組載體，它含有前面任一所述的多核苷酸。
[0016] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種宿主細(xì)胞，它含有所述的重組載體，或其基因組中 整合有所述的多核苷酸。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞或植物細(xì)胞；所述的真 菌細(xì)胞包括酵母細(xì)胞（Yeast)，如畢赤酵母（Pichiapastoris)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維酵母（Saccharomyces cerecisiae)等。所述的原核細(xì)胞包括： 腸桿菌屬（Enterobacter)，如大腸桿菌（Escherichia coli)，芽抱桿菌屬（Bacillus)， 如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，鏈霉菌屬（Streptomyces)，天藍(lán)色鏈霉菌 (Streptomyces coelicolor)、變鉛青鏈霉菌（Streptomyces Iividans)、阿維鏈霉菌 (Streptomyces avermitilis)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae)等，糖多胞菌 屬（Saccharopolyspora)，如紅霉糖多胞菌（Saccharopolyspora erythraea) 〇
[0018] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種所述的貝殼烯酸-13 α -羥化酶的制備方法，該方 法包含：(a)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出所述的貝殼烯酸-13 α -羥化酶。
[0019] 在本發(fā)明的第一方面，提供所述的貝殼烯酸-13 α-羥化酶的用途，用于將貝殼烯 酸轉(zhuǎn)化為甜菊糖醇；較佳地，在存在細(xì)胞色素 Ρ450氧化還原蛋白的情況下貝殼烯酸轉(zhuǎn)化為 甜菊糖醇。
[0020] 在一個優(yōu)選例中，所述的將貝殼烯酸轉(zhuǎn)化為甜菊糖醇在植物細(xì)胞或非植物細(xì)胞 中進(jìn)行；較佳地，所述的非植物細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞；所述的真菌細(xì)胞包括酵母 細(xì)胞（Yeast)，如畢赤酵母（Pichiapastoris)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、 乳酸克魯維酵母（Saccharomyces cerecisiae)等。所述的原核細(xì)胞包括：腸桿菌屬 (Enterobacter)，如大腸桿菌（Escherichia coli)，芽抱桿菌屬（Bacillus)，如枯草芽 抱桿菌（Bacillus subtilis)，鏈霉菌屬（Streptomyces)，天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor)、變鉛青鏈霉菌（Streptomyces Iividans)、阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae)等，糖多胞菌屬 (Saccharopolyspora)，如紅霉糖多胞菌（Saccharopolyspora erythraea) 〇
[0021] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備甜菊糖醇的方法，該方法包含：利用所述的貝 殼烯酸-13 α -羥化酶將貝殼烯酸轉(zhuǎn)化為甜菊糖醇。
[0022] 在一個優(yōu)選例中，所述方法包括：
[0023] (1)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)所述的貝殼烯酸-13 α-羥化酶；
[0024] (2)在存在細(xì)胞色素 Ρ450氧化還原蛋白（CPR)的情況下，利用步驟（1)所述的貝 殼烯酸-13 α -羥化酶將貝殼烯酸轉(zhuǎn)化為甜菊糖醇。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞色素 Ρ450氧化還原蛋白由步驟（1)所述的宿主細(xì)胞 表達(dá)。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，步驟（1)所述的宿主細(xì)胞中包含的重組載體中還包括：細(xì)胞色 素 P450氧化還原蛋白的編碼基因。
[0027] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種組合物，它含有安全有效量的所述的貝殼烯 酸-13 α -羥化酶以及食品學(xué)或工業(yè)上可接受的載體。
[0028] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0029] 圖1、甜菊糖苷類化合物的生物合成途徑。
[0030] 圖2、ΚΑΗ基因片段的PCR擴(kuò)增。泳道1-4分別是應(yīng)用引物對8-40-3US/8-40-4DS， 8-40-2DS/8-40-3US，8-40-lUS/8-40-4DS，8-40-lUS/8-40-2D 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn) 物的電泳圖。
[0031] 圖3、KAH全長DNA的PCR擴(kuò)增。
[0032] 圖4、質(zhì)粒pSY183圖譜。
[0033] 圖 5、質(zhì)粒 pET21a-srcpr 圖譜。
[0034] 圖6、質(zhì)粒pSY198圖譜。
[0035] 圖7、KAH S2蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析。M :蛋白分子量標(biāo)記；1 :未誘導(dǎo)全菌蛋白； 2 :未誘導(dǎo)上清蛋白；3 :16°C誘導(dǎo)5h全菌蛋白；4 :16°C誘導(dǎo)5h上清蛋白；5