一種h9亞型禽流感病毒、滅活疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種H9亞型禽流感病毒、滅活疫苗及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感病毒（Avian Influenza virus，AIV)隸屬于正黏病毒科A型流感病毒 屬，呈多形性，其中球形直徑80~120nm，有囊膜?；蚪M為分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA?？筛?染多種禽類，也能感染人類。依據(jù)其外膜血凝素（Haemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶 (Neuraminidase, NA)蛋白抗原性的不同分為不同的亞型，包括16種HA亞型和10種NA亞 型，兩者的不同組合形成不同亞型的禽流感病毒。由于AIV所具有的HA和NA二者發(fā)生的 抗原性漂移或轉(zhuǎn)移，AIV很容易發(fā)生變異，并不斷的突破其感染宿主的種屬障礙，引起新的 流感流行。自1966年在北美的火雞體內(nèi)首次分離到H9N2亞型AIV以來(lái)，該亞型病毒迅速 在世界范圍內(nèi)傳播，1988年我國(guó)香港分離到亞洲第一株H9N2亞型AIV，我國(guó)大陸于1992年 首次報(bào)道雞群感染，1994年首次分離到該亞型AIV。
[0003] H9N2亞型禽流感屬于低致病性禽流感，發(fā)病率高，但死亡率低。主要臨床表現(xiàn)僅 為輕度呼吸道癥狀，食量減少，產(chǎn)蛋率可從90 %降至20%以下，甚至絕產(chǎn)，對(duì)商品肉雞可導(dǎo) 致30%左右的死亡，極易與大腸桿菌混合感染，嚴(yán)重影響家禽的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán) 重的經(jīng)濟(jì)損失。更重要的是，該亞型AIV可以穿越宿主障礙感染哺乳動(dòng)物包括人，也有機(jī)會(huì) 在人類大流行，給人類健康帶來(lái)了嚴(yán)重的威脅。目前H9N2亞型是我國(guó)雞群中存在的AIV主 要亞型，占禽流感總發(fā)病率的90%以上。各種防控措施中，疫苗免疫仍為最重要的措施。目 前，雖然H9亞型禽流感滅活疫苗已廣泛應(yīng)用，該病也得到了有效控制，但是近幾年來(lái)H9亞 型禽流感在免疫雞群中仍時(shí)有發(fā)生。為此，通過(guò)研宄篩選出一株免疫原性強(qiáng)，能針對(duì)同源/ 非同源H9亞型AIV流行株提供免疫保護(hù)的疫苗毒株尤為必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種H9亞型禽 流感病毒、滅活疫苗及其制備方法。該滅活疫苗免疫原性好，產(chǎn)生抗體水平高，持續(xù)期長(zhǎng)；所 采用的制備方法簡(jiǎn)單、安全。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為，一種H9亞型禽流感病毒SY株， 其保藏編號(hào)為CGMCC No. 5968。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種H9亞型禽流感病毒SY株在制備預(yù)防H9亞型禽流感疫苗中 的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種H9亞型禽流感病毒SY株在制備H9亞型禽流感診斷試劑和 治療藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種H9亞型禽流感滅活疫苗，其含有經(jīng)滅活的H9亞型禽流感病 毒SY株。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種H9亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，包括如下：
[0010] (1)制備H9亞型禽流感病毒SY株毒液：用AIV SY株生產(chǎn)毒種接種健康易感雞胚， 收獲感染雞胚液作為H9亞型禽流感病毒SY株毒液；
[0011] (2)滅活H9亞型禽流感病毒SY株毒液：在步驟（1)中所得的H9亞型禽流感病毒 SY株毒液中加入甲醛溶液；
[0012] (3)油相溶液的制備：將注射用白油和司本-80按照體積比94:6混合，然后加硬 脂酸鋁2份，隨加熱隨攪拌至透明為止，高壓滅菌得油相溶液；
[0013] (4)水相溶液的制備：將步驟（2)中滅活的H9亞型禽流感病毒SY株毒液和滅菌 的吐溫-80按照體積比96:4混合均勻，得水相溶液；
[0014] (5)疫苗乳化：將步驟（3)中的油相溶液和步驟（4)中的水相溶液按照體積比 1. 5~2. 3:1比例混合乳化均勻，制成禽流感滅活疫苗。
[0015] 進(jìn)一步地，該步驟⑴中的H9亞型禽流感病毒SY株毒液，是指接種后24~96 小時(shí)死亡雞胚和96小時(shí)的活胚雞胚液，每0. lmlH9亞型禽流感病毒SY株毒液中病毒含量 ^ IO8 0EID50O
[0016] 進(jìn)一步地，該步驟（2)中SY株毒液中甲醛的質(zhì)量濃度為0. 1~0. 2%，并在37°C 的條件下滅活24小時(shí)。
[0017] 本發(fā)明一種H9亞型禽流感病毒、滅活疫苗及其制備方法具有以下的優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 1.該H9亞型禽流感病毒SY株，具有穩(wěn)定、良好的特異性和免疫原性，可用于制備 H9亞型禽流感疫苗、診斷試劑和治療藥物。
[0019] 2.所制備的H9亞型禽流感滅活疫苗接種后，抗體產(chǎn)生時(shí)間短，效價(jià)高，免疫持續(xù) 期長(zhǎng)，對(duì)同源/非同源的H9亞型禽流感病毒流行株均具有較強(qiáng)的免疫預(yù)防作用。
[0020] 3.所采用的制備H9亞型禽流感滅活疫苗的方法，簡(jiǎn)單、安全、成本低。
[0021] 本發(fā)明中的H9亞型禽流感病毒SY株，是從陜西省某地區(qū)臨床疑似禽流感病毒感 染死亡雞病料上分離到一株低致病性禽流感病毒，經(jīng)哈爾濱獸醫(yī)研宄所國(guó)家禽流感研宄中 心鑒定，為H9N2亞型禽流感病毒SY株，命名為A/Chicken/Shaanxi/SY/97(H9N2)株，分類 命名：A型流感病毒H9N2亞型。
[0022] 保藏信息如下：
[0023] 保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；
[0024] 單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所；
[0025] 保藏日期：2012年4月11日；
[0026] 保藏編號(hào)：CGMCC No. 5968。
[0027] 本發(fā)明中H9亞型禽流感病毒SY株具有以下特點(diǎn)：
[0028] 1.血凝性：按《中國(guó)獸藥典》（中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典 二〇一〇年版三部，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011)的方法進(jìn)行。對(duì)雞紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于 1:1024 (微量法，下同）。該病毒凝集紅細(xì)胞的特性能被禽流感H9陽(yáng)性血清特異性抑制，不 能被新城疫（ND)、減蛋綜合征（EDS)及禽流感H5陽(yáng)性血清抑制。
[0029] 2.特異性：將病毒稀釋至含105_°EID5(l/0. 1ml，與等量的抗H9亞型禽流感病毒特異 血清混合，室溫中和1小時(shí)后，接種SPF雞胚10個(gè)，觀察96小時(shí)，24~96小時(shí)內(nèi)不引起特 異性死亡且至少存活8個(gè)，雞胚液紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)為陰性。
[0030] 3.靜脈接種致病指數(shù)（IVPI)測(cè)定：按《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 二〇〇一年版附錄方法測(cè)定，IVPI彡0. 04。
[0031] 4.純凈性：按《中國(guó)獸藥典》附錄方法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒檢驗(yàn)，結(jié) 果見(jiàn)表1，均為陰性。
[0032] 5.病毒傳代：將病毒用滅菌生理鹽水作10000倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF 雞胚，每胚0. lml，置37°C孵育。收集接種后72~96小時(shí)死亡且病變明顯的雞胚，收獲感 染雞胚液，裝于無(wú)菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無(wú)菌且對(duì)1 %雞紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于1:512的雞胚液混 合，定量分裝，注明收獲日期、毒種代次等，按此方法將AIV SY株原代病毒在SPF雞胚連續(xù) 傳代至第15代。
[0033] 6.病毒含量測(cè)定：將各代次病毒用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10'10' 10_93個(gè)稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0. lml，置37°C繼續(xù)孵育，24小 時(shí)以前死亡的雞胚棄去不計(jì)，在24~96小時(shí)死亡的雞胚隨時(shí)取出，收獲雞胚液，同一稀釋 度的胚液等量混合，按稀釋度分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，至96小時(shí)，取出所有活胚，逐個(gè)收獲 雞胚液，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)不低于1:32者判為感染，計(jì)算EID5tl。每0.1 ml病 毒含量在IO8 25~10 8 65EID5tl之間。結(jié)果見(jiàn)表1 :
[0034] 表1 AIV SY株各代次病毒含量、純凈性及HA效價(jià)測(cè)定結(jié)果
[0035]
[0036] 注代表陰性。
[0037] 7.致病性：
[0038] (1)對(duì)雞胚的毒力：將AIV SY株第3代、5代、10代、15代病毒分別用滅菌生理鹽 水作10000倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10個(gè)，每胚0. lml，置37°C孵育96小時(shí) 后觀察病變，結(jié)果至少有8個(gè)雞胚死亡，胚體表現(xiàn)重度充血、出血等病變。
[0039] (2)對(duì)雛雞的毒力：將AIV SY株病毒液靜脈注射7周齡SPF雞10只，于攻毒后第 3~15天，每天采集每只雞的喉頭和泄殖腔棉拭子，將兩者混合后過(guò)濾除菌，并經(jīng)尿囊腔接 種5枚10日齡SPF雞胚，每枚雞胚0. 2ml，置于37°C孵化箱內(nèi)孵育，棄去24小時(shí)前的死胚， 逐個(gè)收獲在24~96小時(shí)死亡及96小時(shí)存活雞胚的胚液，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，每份棉 拭子樣品接種的雞胚中只要有1枚雞胚的胚液紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于1 :16,即判對(duì)應(yīng)的試驗(yàn) 雞病毒分離為陽(yáng)性。初次病毒分離陰性的樣品，盲傳一代后再進(jìn)行判定。結(jié)果病毒分離情況 如表2。SPF雞感染后第3天即開(kāi)始排毒，排毒高峰期是在攻毒后4~7天（試驗(yàn)雞10/10 向外界排毒），至攻毒后14天試驗(yàn)雞不再排毒，且試驗(yàn)雞攻毒后連續(xù)向外界排毒的最短時(shí) 間為5天，最長(zhǎng)時(shí)間為11天。
[0040] 表2 AIV SY株對(duì)SPF雞致病性測(cè)定結(jié)果
[0041]
[0042] 注：" + "代表病毒分離為陽(yáng)性，代表陰性。
[0043] 8.免疫原性：將AIV SY株第5代、10代、15代病毒液，按本發(fā)明方法分別制成滅活 苗，設(shè)0. lml、0. 3ml、0. 5ml/只劑量組，分別免疫4周齡SPF雞，10只/組，10只對(duì)照雞不接 種。接種后7天、14天、21天分別采血，分離血清，測(cè)定Al HI抗體；同時(shí)于免后21天靜脈 注射AIV SY株（IO8 7EID5tl),攻毒后第5天從試驗(yàn)雞喉頭和泄殖腔拭子分離病毒，統(tǒng)計(jì)病毒 分尚率。結(jié)果見(jiàn)表3。免疫雞疫苗注射后7天即可檢測(cè)出HI抗體，14天各組免疫雞HI抗 體幾何平均值（GMT)均在1:64以上，21天時(shí)各組免疫雞抗體GMT均達(dá)1:256以上，對(duì)照雞 抗體水平全為陰性。而且，攻毒后免疫雞均未分離到病毒，對(duì)照雞病毒分離率9/10,結(jié)果充 分說(shuō)明禽流感病毒SY株在15代以內(nèi)具有良好的免疫原性，可以作為疫苗毒株使用。
[0044] 表3不同代次AIV SY株免疫原性檢測(cè)結(jié)果
[0045]
[0046] 注代表陰性。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 本發(fā)明實(shí)施例中所用的SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。 禽流感H5、H7、H9陽(yáng)性血清購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，新城疫（ND)、減蛋綜合征 (EDS)陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0048] 實(shí)施例1