步驟三中偶聯(lián)Fmoc-Trp-OH， Fmoc-Ser-OH采用的縮合試劑組HBTU/DIPEA，DCM作溶劑反應時間為IOmin與常規(guī)偶聯(lián)方 法采用縮合試劑組HOBT/DIC DMF作溶劑反應時間為Ih相比大大的縮短了反應時間控制了 Fmoc-Trp-〇H、Fmoc-Ser-OH兩個氨基酸側鏈未保護反應中產(chǎn)生副反應及雜質的問題。
[0018] 3.本發(fā)明醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其肽序中的Fmoc-His(Trt)-OH的側鏈 保護基采用的是Trt保護，主要是利用Trt與tBu對酸的敏感度的不同來達到去除Trt保留 tBu的這樣一個目的，權利要求書步驟七中主要是利用20%TFA/DCM (TFA :DCM=1 :4)混合溶 液一次去除 Pyr-His (Trt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg(N02)-Pr〇-Azgly-NH2 肽序中的側鏈保護基Trt。與現(xiàn)有專利0. 1%-3%反復裂解五次，省去了大量成本及人力 又能很好的控制保護基tBu不受影響以便確保反應質量。本發(fā)明簡單易行首先利用原 料Fmoc-His (Trt) -OH參與反應，因為側鏈被保護所以側鏈不參與合成中的反應，不會帶 來相應的副反應及相應的雜質，待合成完全結束后再將其側鏈保護基去除，解決了現(xiàn)有 專利技術中采用Fmoc-His-OH在合成反應過程由于側鏈沒有保護又沒有現(xiàn)有條件能控 制其側鏈不參與反應由此在反應中副反應大反應雜質多的這樣一個缺點，同時也解決了 Fmoc-Hi s-〇H 采用別的保護基如：（Fmoc-His(Fmoc)-OH Fmoc-Hi s(mmt)-OH 等)操作復雜， 合成難度大，在實驗過程中我們也嘗試過選擇Fmoc-His (Fmoc)-OH作為原料但在同樣的 合成條件下Fmoc-His(Trt)-OH只要反應30min就可完成而Fmoc-His(Fmoc)-OH則需反應 20_40h還反應不完全Fmoc-His (mmt) -OH也存在同樣的難題。
[0019] 4.本發(fā)明醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其采用的精氨酸和酪氨酸的側鏈保護 基為N02和Bzl，可利用氫化反應一步去除成功，將帶有N02和Bzl的Pyr-His-Trp-Ser-T yr (Bzl)-D-Ser (tBu)-Leu-Arg (N02) -Pr〇-Azgly-NH2的白色固體粗肽用甲醇溶解后加入 甲酸銨和Pa/c (按按粗肽計算質量的10%和5%分別投入)進行氫化反應，反應溫度為40攝 氏度反應時間5h過濾得到戈舍瑞林粗肽甲醇溶液將溶液進行過濾去除過量的Pa/c及甲酸 銨然后加入5倍量的純水將樣品析出離心得到純度90%的戈舍瑞林粗肽固體，制備得到戈 舍瑞林。
[0020] 5.本發(fā)明醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，將Fmoc-His(Trt)-OH偵Ij鏈上的Trt用 酸去除，然后再利用氫化反應將Fmoc-Arg (N02) -OH和Fmoc-Tyr (Bzl) -OH上的N02和Bzl 去除，過濾掉鈀碳后用5倍純水析出離心得到固體戈舍瑞林粗肽，用少量的乙腈溶成糊狀 后加水至溶解澄清，給純化制備帶來方便，，以至于純化制備一次可得到戈舍瑞林目的物 99%，解決了現(xiàn)有技術中純化的制備溶液為二氯甲烷反復上樣反復沖出導致收率降低的成 本較高的一個不足點，同時也很好的解決了現(xiàn)有技術中到純化制備的溶液中含有大量的 酸，在制備過程中需用大量的堿與其中和，才可制備純化，整個的酸堿中和過程中會大量的 放熱，危險性較大，不可以實行放大生產(chǎn)的一個大問題。
【附圖說明】
[0021] 附圖1為本發(fā)明全保護裂解后粗肽的HPLC分析圖譜； 附圖2為本發(fā)明全保護裂解后粗肽偶聯(lián)氨基脲后的HPLC分析跟蹤圖譜； 附圖3為本發(fā)明顯示的是粗品的一個純度情況圖； 附圖4為本發(fā)明儀器DIOIVEX U3000分析的戈舍瑞林粗品HPLC圖譜圖； 附圖5為本發(fā)明雙聯(lián)質譜儀分析檢測戈舍瑞林粗品MS圖譜圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述： 實施例：一種醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，包括以下步驟： 步驟一、根據(jù)預設替代度sub (0. 6mmol/g) =n (合成規(guī)模）/ (X(iS Mrc Ke;sin+nH<M)氨基 酸分子量這里指Fmoc-Pro-OH的分子量）可計算出X(裸2-CTC Resinz的質量）=266g Fmoc-Pro-OH在合成樹脂的步驟中投料量為摩爾量的1. 3倍即計算得出Fmoc-Pro-OH為 87g將稱取替代度為I. 1~1. 3mmol/g的2-CTC Resin266g (合成規(guī)模200mmol)加入反應 柱中同時加入3000mlDMF溶脹20min，溶脹后抽掉DMF，在加入3000mlDMF洗滌兩次，每 次Imin.將稱量好的Fmoc-Pr〇-OH87g在DMF/DCM的混合溶液中冰浴條件下加入摩爾量 兩倍的DIPEA(N，N-二異丙基乙胺）的作用下，室溫反應，反應時間由所期待的替代度決 定。反應后處理DMF洗滌5次每次3000ml每次lmin，然后加入3000ml封閉液（DCM :甲醇： DIPEA=80 :15 :5)封閉兩次每次 IOmin 得到 sub=0. 6mmol/g 的 Fmoc-Pro-CTC Resin，加入 3000ml20%DBLK (哌啶：DMF=1 :4)去除Fmoc兩次，每次時間為IOmin待去除完畢后加入 3000m 的 DMF 洗滌兩次，得到 H-Pro-CTC Resin ;這里所述 Fmoc-Pro-OH 和 2-CTC Resin 的 結構式同權利要求說明書步驟一 步驟二、按照常規(guī)的固相合成方法，將步驟一中的脫完Fmoc的H- Pro-CTC Resin用 DMF洗滌4次，每次3000ml，洗滌時間lmin，將稱量好Fmoc-Arg (N02) -OH9 (摩爾量的3倍）、 和HOBT (摩爾量的3倍）投入反應柱中補加 DIC、反應lh、待反應完畢后取樹脂20-30粒用 少量DMF洗滌兩遍進行茚三酮檢測顯陽性則表明反應未完全需繼續(xù)反應或是重復偶聯(lián)，若 檢測顯陰性則表明反應完全可進行下一步的偶聯(lián)反應，按以上步驟依次偶聯(lián)以下Fmoc保 護的氨基酸 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser (tBu)-OH 和 Fmoc-Tyr(Bzl) -OH 得到 Fmoc-Tyr (B zI)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(N02)-Pro-CTC Resin ； 步驟三、將 Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(N02)-Pro-CTC Resin 加入 3000mlDBLK去除Fmoc后DMF洗滌4次，每次3000ml，時間lmin，加入稱量好HBTU (摩爾 量的3倍)和Fmoc-Ser-OH (摩爾量的3倍）投入反應柱中補加 DIPEA和DCM使其攪拌均勻 反應10min抽掉反應液加入DMF洗滌3次，每次3000ml，洗滌時間Imin取樹脂20-30粒茚 三酮檢測顯陽性則表明反應未完全需繼續(xù)反應或是重復偶聯(lián)，若檢測顯陰性則表明反應完 全可進行下一步的偶聯(lián)反應按以上步驟偶聯(lián)Fmoc-Trp-OH得到Fmoc-Trp-Ser-Tyr (Bzl)-D -Ser (tBu)-Leu-Arg(N02)-Pro-CTC Resin ； 步驟四、按照常規(guī)的固相合成方法同步驟二，采用H0BT/DIC、反應lh、DMF作溶劑依次 偶聯(lián) Fmoc-His (Trt) -〇H、Pyr 得到 H-Pyr-His (Trt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-A rg(N02)-Pro-CTC Resin 肽樹脂 520g ; 步驟五、按1:10 (w:v)的樹脂與裂解液的比例配制全保護裂解液5200mL (V三:V二 氯甲煉=1:4)加入到 H-Pyr-His (Trt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg (N02) -Pro_2-CTC Resin肽樹脂中的攪拌反應2h，待反應完畢后過濾抽掉樹脂保留溶液目的去除其載體 2-CTC Resin ； 步驟六、將全保護裂解液取出Iml作HPLC分析定位出峰時間1，然后再將其溶液用 DIPEA (N，N-二異丙基乙胺)調(diào)成偏堿性PH=7. 8-8. 5優(yōu)選7. 8-8. 2按摩爾量的3倍將稱量 好的鹽酸氨基脲和PyBop (IH-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽[用于肽的偶聯(lián) 劑)加入PH在7. 8-8. 2左右的全保護裂解液中進行反應偶聯(lián)，反應時間Ih，待反應完畢后 取出Iml同樣條件下作HPLC分析定位出峰時間2,然后根據(jù)峰型的變化及有無前移情況從 而判斷跟蹤氨基脲的偶聯(lián)情況，如峰型有變化但反應前的峰1沒有完全轉變到反應Ih后的 峰2說明還未反應完全需繼續(xù)反應，若反應前的峰1完全轉變?yōu)榉磻狪h后的峰2說明已經(jīng) 反應完全則可以進行下一步實驗最后得到保留側鏈保護基的戈舍瑞林肽溶液即Pyr-His(T rt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg (N02)-Pr0-Azgly_NH2 再將其溶液旋蒸濃縮 Ih后變?yōu)榈S色粘稠狀物； 步驟七、配置20%TFA/DCM的裂解液（V:V=1:4)緩慢加入到步驟六中的粘稠狀物中使 其攪拌室溫裂解2h，再將其裂解液緩慢加入冰凍的乙醚中放置30min進行沉降即得到去除 His (Trt)上的側鏈保護基 Trt 前體肽 II Pyr-His-Trp-Ser-Tyr (Bzl)-D-Ser (tBu)-Leu-A rg (N02)-Pr0-Azgly-NH2 320g 步驟八、將步驟七的白色固體粗肽真空抽干按lg/4ml用甲醇溶解溶解體積為1110ml， 加入甲酸銨32g和Pa/