醋酸戈舍瑞林的固相合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽藥物化學合成領(lǐng)域，具體涉及一種醋酸戈舍瑞林的固相合成方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 戈舍瑞林，其中文化學名：焦谷氨酰-L-組氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-D-絲氨 酰-L-亮氨酰-精氨酰-脯氨酰-氨基尿；英文名稱：Goserelin，分子式：C59H84N18014,分 子量：1269. 4105 ;適用癥：適用于可用激素治療的前列腺癌及絕經(jīng)前和絕經(jīng)期的乳腺癌。 子宮內(nèi)膜異位癥；
本藥是一種合成的、促黃體生成素釋放激素的類似物，長期使用可抑制垂體的促黃體 生成激素的分泌，從而引起男性血清睪酮和女性血清雌二醇的下降，停藥后這一作用是可 逆的。男性病人在第一次用藥之后21日左右，睪酮濃度可降低到去勢后的水平，在每28 天用藥1次的治療過程中，睪酮濃度一直保持在去勢后的濃度范圍內(nèi)。這種睪酮抑制作用 可使大多數(shù)病人的前列腺腫瘤消退，癥狀改善。女性患者在初次用藥后21日左右，血清雌 二醇濃度受到抑制，并在以后每28天的治療中維持在絕經(jīng)后水平。這種抑制與激素依賴性 的乳腺癌，子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)。
[0003] 藥代動力學：本藥具有幾乎完全的生物利用度。每4周使用一注射埋植劑，可保持 有效血藥濃度，而無組織蓄積。諾雷德的蛋白結(jié)合能力較差，在腎功能正常的情況下，血漿 清除半衰期為2-4小時，腎功能不全病人的半衰期將會延長，但對于每月都使用埋植劑的 患者來說，這影響非常小，故沒有必要改變這些病人的用量。在肝功能不全的病人中，藥代 動力學無明顯的變化。
[0004] 毒理研宄：在長期重復使用諾雷德的雄性鼠中，曾觀察到良性腦垂體腫瘤的發(fā)病 率上升，這一事實與以前已觀察到的行外科去勢后的大鼠的情形相似，但尚未發(fā)現(xiàn)與人體 使用的經(jīng)驗有任何關(guān)聯(lián)。在小鼠實驗中，長期重復使用數(shù)倍于人類常用劑量的諾雷德后，可 發(fā)現(xiàn)胰島細胞及幽門部胃粘膜細胞增生。這些事實與臨床的關(guān)系尚不清楚。
[0005] 從市場分析可以看出戈舍瑞林的需求量還是比較大的，前景比較可觀，但是目前 就戈舍瑞林的合成方法就歸結(jié)于兩類，一種為固相合成方法一種為液相合成方法，但每種 方法都有各自的優(yōu)缺點。
[0006] CN 101759777A采用的是"5+4 "的一個純液相片段合成法，主要是先合成一個 五肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH,選氯甲酸叔丁醋作為縮合試劑一步一步縮合而成， 同樣的方法再合成一個4肽片段D-Ser (tBu)-Leu-Arg-Pr〇-Azgly-NH2,然后將5肽片段 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH 和 4 肽片段 D-Ser (tBu) -Leu_Arg-Pr〇-Azgly-NH2 在縮合試劑的 條件下縮合完成得到目的物肽序 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (tBu)-Leu-Arg-Pro-Azgly -NH2。實驗證明這種純液相片段合成中，兩個片段偶聯(lián)時反應周期較長，時間一般是常規(guī)偶 連反應的10倍左右，造成時間的浪費合成的危險性相對加大；純液相合成法雖然省去了樹 脂的部分費用但是反應步驟較多，反應比較繁雜，過程中不容易控制，洗滌等操作加大難度 甚至難以實行造成最終產(chǎn)品純度不高給純化制備加大難度；純液相片段縮合法在合成片段 時，片段作為一個原料其量需加倍甚至有時還會出現(xiàn)補投現(xiàn)象所以說片段合成的量一般是 目的肽合成的量的5倍左右，如果放大會給生產(chǎn)造成很大的費用；雖然純液相片段合成法 也能很順利的合成出目的產(chǎn)物，但是存在上述的一些缺陷綜合考慮還是不利于大規(guī)模的生 產(chǎn)。
[0007] CN 102446383A采用的是原始的固相合成法來完成戈舍瑞林的操作，主要是這樣 的一個反應： 首先1、將Rink Amide MBHA Reain與N, Ν' -羰基二咪唑反應生成
2、 將上述的中間產(chǎn)物與Fmoc-NH-NH2反應得到Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin ; 3、 以Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin為起始物進行固相合成一次偶聯(lián)帶有保護基團的氨基 酸至結(jié)束； 4、 裂解得到粗肽進行純化制備。
[0008] 此專利中所涉及的氨基酸的支鏈基團都沒有進行保護，完全裸露。這樣首先就 是會造成在合成過程中出現(xiàn)許多副反應現(xiàn)象，造成目的肽純度低純化難度大，還有就是在 合成過程中利用Rink Amide MBHA Reain與N, Ν' -羰基二咪唑反應生成中間產(chǎn)物再與 Fmoc-NH-NH2反應得到Fmoc-NH-NH-CO-NH-Resin整個過程無法跟蹤，無法確定偶聯(lián)反應程 度及偶聯(lián)效果，整個過程放大生產(chǎn)難以實現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，該醋酸戈舍瑞林的固相 合成方法集合了固、液相合成方法中各自的優(yōu)點，避免了許多副反應現(xiàn)象，提高了目的肽的 純度，收率也相對較高，操作起來方便可行中間體可以跟蹤控制，整個過程利于放大生產(chǎn)。
[0010] 為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種醋酸戈舍瑞林的固相合成 方法，包括以下步驟： 步驟一、由 Fmoc-Pro-OH 和替代度為 L 1-1. 3mmol/g 的 2-CTC Resin 在激活劑 N，N_ 二 異丙基乙胺的作用下，室溫反應Ih得到Fmoc-Pro-CTC Resin，加入20%DBLK (哌啶：DMF=1 : 4)去除 Fmoc 得到 H- Pro-CTC Resin ; 所述Fmoc-Pro-OH的結(jié)構(gòu)式如下：
所述2-CTC Resin的結(jié)構(gòu)式如下：
步驟二、按照常規(guī)的固相合成方法，采用H0BT/DIC、反應lh、DMF作溶劑依次偶聯(lián)以下 Fmoc 的氨基酸 Fmoc-Arg (N02) -OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser (tBu) -OH 和 Fmoc-Tyr (Bzl) H3H 得到 Fmoc-Tyr (Bzl)-D-Ser (tBu)-Leu-Arg (N02)-Pro-CTC Resin ; 步驟三、采用HBTU/DIPEA作為偶聯(lián)縮合體系，在DCM作溶劑的條件下，反應lOmin，依次 偶聯(lián) Fmoc-Ser-〇H、Fmoc-Trp-〇H 得到 Fmoc-Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg (N02) -Pro-CTC Resin ； 步驟四、按照常規(guī)的固相合成方法，采用HOBT/DIC、反應lh、DMF作溶劑依次偶聯(lián) Fmoc-His (Trt) -OH、Pyr 得到 H-Pyr-His (Trt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg (N 02)-Pro-CTC Resin ； 步驟五、將全保護裂解液按樹脂重量的10倍(w: v=l: 10)加入相應體積的量將H-Pyr-H is (Trt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Ser (tBu) -Leu-Arg (N02) -Pr〇-2-CTC Resin 中的載體 2-CTC Resin去除； 步驟六、將全保護裂解液用DIPEA (N，N-二異丙基乙胺）調(diào)成偏堿性PH=7. 8-8. 5優(yōu)選 7. 8-8. 2按摩爾量的3倍將稱量好的鹽酸氨基脲和PyBop (IH-苯并三唑-1-基氧三吡咯 烷基六氟磷酸鹽[用于肽的偶聯(lián)劑)加入PH在7. 8-8. 2左右的全保護裂解液中進行反應偶 聯(lián)，從而得到保留側(cè)鏈保護基的戈舍瑞林肽溶液即Pyr-His (Trt) -Trp-Ser-Tyr (Bzl) -D-Se r (tBu)-Leu-Arg (N02)-Pr0-Azgly_NH2 旋蒸濃縮成粘稠狀物； 步驟七、配置20%TFA/DCM的裂解液（V:V=1:4)緩慢加入到步驟六中的粘稠狀物中使 其攪拌室溫裂解2h，再將其裂解液緩慢加入冰凍的乙醚中放置30min進行沉降即得到去除 His (Trt)上的側(cè)鏈保護基 Trt 前體肽 II Pyr-His-Trp-Ser-Tyr (Bzl)-D-Ser (tBu)-Leu-A rg (N02)-Pr0-Azgly-NH2 的白色固體物。
[0011] 步驟八、將步驟七的白色固體前體肽II真空抽干用甲醇溶解，加入甲酸銨和Pa/C 進行氫化反應去除肽序中側(cè)鏈保護基N02和Bz 1，從而得到戈舍瑞林粗肽甲醇溶液Pyr-Hi s -Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu_Arg-Pr〇-Azgly-NH2 ; 步驟九、將含有甲醇溶液的戈舍瑞林粗品溶液進行過濾去除過量的Pa/c及甲酸銨然 后加入5倍量的純水將樣品析出離心得到純度90%的戈舍瑞林粗肽固體，制備得到戈舍瑞 林。
[0012] 上述技術(shù)方案進一步改進的技術(shù)方案如下： 1.上述方案中，所述全保護裂解液由三氟乙醇、二氯甲烷按照1 :4的體積組成，裂解 條件為在室溫下2h。
[0013] 2.上述方案中，所述步驟八中甲酸銨和Pa/c分別按粗肽計算質(zhì)量的10%和5%投 入。
[0014] 3.上述方案中，所述步驟九還包括：將步驟八的氫化反應后的甲醇溶液過濾加入 5倍量的純水將樣品析出離心得到純度90%的戈舍瑞林粗肽。
[0015] 4.上述方案中，所述步驟八中反應時間5h，反應溫度40攝氏度。
[0016] 由于上述技術(shù)方案的運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點： 1.本發(fā)明醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，其采用的是在液相中偶聯(lián)氨基脲的這樣一 個過程采用固液結(jié)合首先是固體上合成肽樹脂全保護裂解后液相偶聯(lián)氨基脲的方法，可以 隨時跟蹤檢測氨基脲的偶聯(lián)效果，解決了現(xiàn)有技術(shù)中無法監(jiān)測的這樣一個弊端。
[0017] 2.本發(fā)明醋酸戈舍瑞林的固相合成方法，