mmlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)，保藏編號為 DSM 27483。
[0104] 連續(xù)培養(yǎng)的菌株的轉(zhuǎn)化基質(zhì)生成白藜蘆醇的能力的分析
[0105] 經(jīng)由一連串篩選與突變篩選，以上述編號72號的突變株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以YH)培 養(yǎng)基進(jìn)行種菌活化，之后將經(jīng)活化種菌接種并培養(yǎng)，當(dāng)其以O(shè)D 6tltl測定值達(dá)到10,再進(jìn)行后 續(xù)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。
[0106] (1)5公升的發(fā)酵槽連續(xù)培養(yǎng)
[0107] 利用5公升發(fā)酵槽并以虎杖為植物基質(zhì)來培養(yǎng)編號72號的突變株進(jìn)行生產(chǎn)白藜 蘆醇，而培養(yǎng)條件為：25°C、100~200rpm、通氣量為lvvm、5%接菌量（相對于培養(yǎng)基的體 基）。分別以福格爾最小鹽類培養(yǎng)基（Vogel minimal salts medium, VMSM)、20mM醋酸緩沖 液pH5. 0與水作為生產(chǎn)的培養(yǎng)基，添加2%虎杖（相對于培養(yǎng)基的體基）作為轉(zhuǎn)化白藜蘆醇 的植物基質(zhì)來培養(yǎng)編號72號的突變株，結(jié)果如圖4A所示。
[0108] 圖4A中顯示以醋酸緩沖液作為培養(yǎng)基具有最高的白藜蘆醇產(chǎn)量。最高的白藜蘆 醇的含量為7455. 6 μ g/g，之后隨時(shí)間的增加而緩慢降低，而此時(shí)的虎杖糖苷含量只剩下 198. 6 μ g/g，而其次為水作為培養(yǎng)基，最差的為福格爾最小鹽類培養(yǎng)基。
[0109] (2)20公升的發(fā)酵槽連續(xù)培養(yǎng)
[0110] 利用20公升發(fā)酵槽與并以虎杖為植物基質(zhì)來培養(yǎng)編號72號的突變株進(jìn)行生產(chǎn)白 藜蘆醇，以100-200rpm、0. 2vvm的條件進(jìn)行培養(yǎng)。以20mM醋酸緩沖液pH5. 0作為培養(yǎng)基， 并添加2%虎杖（相對于培養(yǎng)基的體基）作為基質(zhì)，結(jié)果如圖4B所示。
[0111] 圖4B中顯示，白藜蘆醇含量隨時(shí)間而增加，直到40小時(shí)趨于平緩，從2177. 6ug/g 增加到最高值為7266. 4ug/g，而虎杖糖苷的趨勢則相反。另外，計(jì)算虎杖糖苷轉(zhuǎn)化成白藜蘆 醇的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到95%以上。
[0112] 綜合前述結(jié)果可知，將β_葡萄糖苷酶高產(chǎn)量的酵母菌（編號72號的突變株） 以虎杖為植物基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，以轉(zhuǎn)化虎杖糖苷生成白藜蘆醇。從搖瓶初步測試轉(zhuǎn)化率、5公 升發(fā)酵槽測試轉(zhuǎn)速及通氣量參數(shù)、20公升發(fā)酵槽測試放大制程的轉(zhuǎn)化率均可行后，共進(jìn)行 多次發(fā)酵（包括5公升、20公升、250公升和2000公升，均進(jìn)行三次以上）。結(jié)果顯示，在所 有發(fā)酵體積的實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)第30-72小時(shí)期間，糖苷含量降至0. 5mg/g或以下，而白藜蘆 醇從30小時(shí)后則漸趨于穩(wěn)定，大約含量為8-12mg/g，其轉(zhuǎn)化率更可達(dá)95%以上。
[0113] 關(guān)于生物材料的保藏
[0114] 2013年1月9日保藏于臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心，保藏 編號為 BCRC 920084。
[0115] 2013年7月11日保藏于德國微生物菌種保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)，保藏編號為 DSM27483。保藏中心地址為：英 豪豐大街7B，D-38124布倫瑞克。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其特征在于，其包括： 提供一德克酵母屬的酵母菌或其突變株與一基質(zhì)，該基質(zhì)包括白藜蘆醇前驅(qū)物或含有 白藜蘆醇前驅(qū)物的一植物基質(zhì)； 將該德克酵母屬的酵母菌或其突變株與該基質(zhì)加入至一培養(yǎng)基中以形成一混合物；以 及 對該混合物進(jìn)行發(fā)酵，以使于該混合物中存在的該白藜蘆醇前驅(qū)物被該德克酵母屬的 酵母菌或其突變株生物轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生白藜蘆醇。2. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述德克酵母屬 的酵母菌或其突變株包括一布魯塞爾德克酵母菌或其突變株。3. 如權(quán)利要求2所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述布魯塞爾德 克酵母菌或其突變株包括布魯塞爾德克酵母菌BCRC21440或其突變株。4. 如權(quán)利要求3所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述布魯塞爾德 克酵母菌的突變株包括于2013年7月11日保藏于德國微生物菌種保藏中心DSMZ的保藏 編號為DSM27483的布魯塞爾德克酵母菌。5. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述德克酵母屬 的酵母菌或其突變株為布魯塞爾德克酵母菌BCRC21440。6. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述德克酵母屬 的酵母菌或其突變株為于2013年7月11日保藏于德國微生物菌種保藏中心DSMZ的保藏 編號為DSM27483的布魯塞爾德克酵母菌。7. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述白藜蘆醇前 驅(qū)物包括白藜蘆醇糖苷。8. 如權(quán)利要求7所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述白藜蘆醇糖 苷包括虎杖糖苷。9. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，含有白藜蘆醇前 驅(qū)物的該植物基質(zhì)包括虎杖、葡萄或葡萄皮、石榴或石榴皮、花生、可可、藍(lán)莓、桑葚、蔓越莓 或波蘿蜜。10. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述含有白藜蘆 醇前驅(qū)物的該植物基質(zhì)為虎杖。11. 如權(quán)利要求10所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，含于所述虎杖 的該白藜蘆醇前驅(qū)物為虎杖糖苷。12. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述基質(zhì)為含有 白藜蘆醇前驅(qū)物的該植物基質(zhì)。13. 如權(quán)利要求12所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述植物基質(zhì) 為虎杖。14. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述德克酵母屬 的酵母菌或其突變株的添加量為培養(yǎng)基體積的1-65%。15. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述基質(zhì)的添加 量為培養(yǎng)基體積的1-65%。16. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述培養(yǎng)基包括 水、醋酸緩沖溶液或福格爾最小鹽類培養(yǎng)基。17. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述發(fā)酵時(shí)間為 約12-72小時(shí)。18. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述發(fā)酵溫度為 約 20-35 °C。19. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述發(fā)酵于一搖 瓶或發(fā)酵槽中進(jìn)行。20. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述發(fā)酵于一發(fā) 酵槽中進(jìn)行，且該德克酵母屬的酵母菌添加量為培養(yǎng)基體積的1-65%，而該基質(zhì)的添加量 為培養(yǎng)基體積的1-65%。21. 如權(quán)利要求20所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述發(fā)酵時(shí)間 為約18-48小時(shí)。22. 如權(quán)利要求20所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述發(fā)酵溫度 為約 23-30 °C。23. 如權(quán)利要求20所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述基質(zhì)為含 有白藜蘆醇前驅(qū)物的該植物基質(zhì)。24. 如權(quán)利要求23所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，所述植物基質(zhì) 為虎杖或石榴皮。25. 如權(quán)利要求1所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，在該步驟（c)之 后，還包括（d)從該混合物中萃取該白藜蘆醇。26. 如權(quán)利要求25所述的通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，其中，在該步驟（d)中 包括： 于經(jīng)發(fā)酵的該混合物中加入酒精并進(jìn)行超音波震蕩以形成一萃取液； 將該萃取液進(jìn)行干燥后再加入水及乙醚以形成一水層與一乙醚層；以及 收集該乙醚層并將該乙醚層干燥以獲得白藜蘆醇產(chǎn)物。27. -種新布魯塞爾德克酵母菌突變株，其是于2013年7月11日保藏于德國微生物菌 種保藏中心DSMZ的保藏編號為DSM27483的布魯塞爾德克酵母菌。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種以微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇(resveratrol)的方法，其包括：(a)提供一德克酵母屬(Dekkera)的酵母菌或其突變株與一基質(zhì)，其中該基質(zhì)包括白藜蘆醇前驅(qū)物或含有白藜蘆醇前驅(qū)物的一植物基質(zhì)；(b)將該德克酵母屬的酵母菌或其突變株與該基質(zhì)加入至一培養(yǎng)基中以形成一混合物；以及(c)對該混合物進(jìn)行發(fā)酵，以使于該混合物中存在的該白藜蘆醇前驅(qū)物被該德克酵母屬的酵母菌或其突變株生物轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生白藜蘆醇。DSM 2748320130711
【IPC分類】C12N1/16, C12R1/645, C12P7/22
【公開號】CN104894172
【申請?zhí)枴緾N201410185938
【發(fā)明人】黃學(xué)聰, 郭曉萍, 賴進(jìn)此
【申請人】財(cái)團(tuán)法人食品工業(yè)發(fā)展研究所
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2014年5月5日