微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法和布魯塞爾德克酵母菌突變株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)白藜蘆醇（resveratrol)的方法，特別是涉及一種以微生物 轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白藜蘆醇（resveratrol)為一種植物多酚，主要為植物受到環(huán)境逆境時如：外 力傷害、UV過度照射、昆蟲及微生物入侵感染時所生成的抵御機制，為一種植物抗菌 素(phytoalexins)(Anastasiadi et al. , 2012 ；Burns et al. , 2002 ；Fremont, 2000 ； Potrebko and Resurreccion, 2009)。白黎蘆醇化學名稱為三羥基二苯乙稀 (3,5,4'-trihydrozystibene)(Abbott et al·)，最早于 1940 年，學者高網(wǎng)（Takaoka)由 白藜蘆（white hellebore ;Veratrum grandiflorum 0· Loes)的根部分離出鑒定，隨后于 1963年由中國傳統(tǒng)中藥材-虎杖（Polygonum cuspidatum)的根莖部中也被分離出有白藜 蘆醇成分。白藜蘆醇除了于上述植物中被發(fā)現(xiàn)，其也存在一些特定的植物中，如葡萄、藍莓 等某些莓果類，或是花生及石槽等（Burns et al·，2002 ;Counet et al·，2006;Jerkovic et al·，2010 ;Manach et al·，2004 ;Tome-Carneiro et al·，2012 ;Wang, 2012)，然而這 些的植物所含的白藜蘆醇含量差異很大，同時，在某些植物中白藜蘆醇會以糖苷（piceid; polydatin)的形式存在于體內(nèi)。
[0003] 目前已知白藜蘆醇，具有抗老化、降低糖尿病、肝病、心臟病、癌癥及其他代謝癥候 群相關(guān)疾病的罹患機率，然而因其于植物中含量稀少且萃取不易，使其售價及應(yīng)用上均受 限制。
[0004] 白藜蘆醇化合物有兩種異構(gòu)物分別為順式（Cis)與反式（trans)結(jié)構(gòu)，反式結(jié) 構(gòu)才有生理活性，反式結(jié)構(gòu)經(jīng)UV照射后會變?yōu)轫樖浇Y(jié)構(gòu)而失去生理活性（Potrebko and Resurreccion, 2009)，于植物中白藜蘆醇會與糖結(jié)合形成較穩(wěn)定的糖苷形式，糖苷形式有 接單糖于不同位置（Counet et al.，2006 ;Jerkovic et al.，2010 ;Sun et al.，2010 ;Wang et al.，2007;Zhang et al.，2007)的形式，也有同時接兩個單糖的形式，但在虎杖中主要 以單糖接于3'-位置上的羥基形式居多數(shù)（Sun et al.，2010;Wang et al.,2007;吳佳 穎，2007)，這些不同的接糖形式主要為穩(wěn)定白藜蘆醇于生物體內(nèi)，于適當時機時生物體可 直接轉(zhuǎn)化生成白藜蘆醇應(yīng)用。
[0005] 目前生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，有植物萃取法、化學合成法、植物轉(zhuǎn)化法以及微生物基 因工程等，然而植物中白藜蘆醇主要經(jīng)由酪胺酸與苯丙氨酸途徑合成，其中主要關(guān)鍵步驟 為合成二苯乙烯合成酶（stilbene synthase) (Donnez et al·，2009)，目前文獻所列以微 生物基因工程生產(chǎn)白藜蘆醇的方式，可分為酵母菌與細菌兩部分（Donnez et al.，2009)。
[0006] 文獻研究指出：目前萃取虎杖中白藜蘆醇方法主要有五種，分別以堿萃取法 (Alkaline extraction)、溶劑萃取法（Solvent extraction)、超音波輔助法（Ultrasonic extraction)、索式回流萃?。⊿oxhlet extraction)以及CO2超臨界流萃取法（SFE-C02) (Benova et al.，2010 ;Cho et al.，2006 ;Du et al.，2007 ;Lei et al.，2007 ;吳佳 穎，2007)。所有的萃取方法均有其優(yōu)缺點，然而就單純以萃取效果而言，超音波輔助法萃取 效果最佳（Lei et al.，2007)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種以微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇（resveratrol)的方法，包括：(a)提 供一德克酵母屬（Dekkera)的酵母菌或其突變株與一基質(zhì)，其中該基質(zhì)包括白藜蘆醇前驅(qū) 物或含有白藜蘆醇前驅(qū)物的一植物基質(zhì)；(b)將該德克酵母屬的酵母菌或其突變株與該基 質(zhì)加入至一培養(yǎng)基中以形成一混合物；以及（c)對該混合物進行發(fā)酵，以使于該混合物中 存在的該白藜蘆醇前驅(qū)物被該德克酵母屬的酵母菌或其突變株生物轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生白藜蘆醇。
[0008] 本發(fā)明也提供一種新穎的布魯塞爾德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)突變株， 其是于2013年1月9日保藏于臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心，保藏編 號為BCRC 920084的布魯塞爾德克酵母菌，并且是于2013年7月11日保藏于德國微生物 菌種保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)， 保藏編號為DSM 27483的布魯塞爾德克酵母菌。
【附圖說明】
[0009] 圖IA是顯示初步選擇的各菌株使用虎杖為基質(zhì)的轉(zhuǎn)化生成白藜蘆醇的實驗結(jié) 果。
[0010] 圖IB是顯示初步選擇的各菌株使用石榴皮為基質(zhì)的轉(zhuǎn)化生成白藜蘆醇的實驗結(jié) 果。
[0011] 圖2是顯示不同的布魯塞爾德克酵母菌使用虎杖為基質(zhì)的轉(zhuǎn)化生成白藜蘆醇的 實驗結(jié)果。
[0012] 圖3是顯示所挑選的12株突變株于不同培養(yǎng)時間點產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase)量。
[0013] 圖4Α是顯示利用5公升發(fā)酵槽并以虎杖為植物基質(zhì)且以水、醋酸緩沖溶液或福格 爾最小鹽類培養(yǎng)基（Vogel minimal salts medium, VMSM)來培養(yǎng)編號72號的突變株進行 白藜蘆醇轉(zhuǎn)化生成的結(jié)果。
[0014] 圖4B是顯示利用20公升發(fā)酵槽并以虎杖為植物基質(zhì)且以醋酸緩沖溶液來培養(yǎng)編 號72號的突變株進行白藜蘆醇轉(zhuǎn)化生成的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0015] 在本發(fā)明一實施方式中，本發(fā)明提供一種以上微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇 (resveratrol)的方法。本發(fā)明的以微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇方法可包括下述步驟，但不限 于此。
[0016] 首先，提供一德克酵母屬（Dekkera)的酵母菌或其突變株與一基質(zhì)。上述基質(zhì)可 包括，但不限于，白藜蘆醇前驅(qū)物或含有白藜蘆醇前驅(qū)物的一植物基質(zhì)。
[0017] 上述德克酵母屬的酵母菌或其突變株可包括一布魯塞爾德克酵母菌（Dekkera bruxellensis)或其突變株，但不限于此。上述布魯塞爾德克酵母菌或其突變株的例子，可 包括，布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440或其突變株等，但不限于此。又，布魯塞爾德克酵母 菌BCRC 21440的突變株的例子則可包括，但不限于，于2013年1月9日保藏于臺灣食品工 業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心，保藏編號為BCRC 920084的布魯塞爾德克酵母菌 (此菌也于2013年7月11日保藏于德國微生物菌種保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，保藏編號為 DSM27483)等。
[0018] 在一實施例中，于本發(fā)明的以微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法中所使用的德克酵 母屬的酵母菌或其突變株可為布魯塞爾德克酵母菌BCRC 21440。在另一實施例中，于本發(fā) 明的以微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法中所使用的德克酵母屬的酵母菌或其突變株可為， 于2013年1月9日保藏于臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心，保藏編號為 BCRC 920084的布魯塞爾德克酵母菌（此菌也于2013年7月11日保藏于德國微生物菌種 保藏中心DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)，保藏 編號為 DSM 27483)。
[0019] 于本發(fā)明的以微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法中，上述白藜蘆醇前驅(qū)物可包括白 藜蘆醇糖苷等，但不限于此，而白藜蘆醇糖苷的例子可包括，但不限于虎杖糖苷等。又，于 本發(fā)明的以微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)白藜蘆醇的方法中，上述含有白藜蘆醇前驅(qū)物的該植物基質(zhì)的 例子可包括，但不限于，虎杖、葡萄或葡萄皮、石榴或石榴皮、花生、可可、藍莓、桑葚、蔓越莓 或、波蘿蜜等。在一實施例中，上述含有白藜蘆醇前驅(qū)物的植物基質(zhì)可為虎杖，而含于虎杖 的白藜蘆醇糖苷為虎杖糖