27.根據(jù)3、4和11至26中任一項(xiàng)所述的CBH變體，其中所述變體進(jìn)一步包含T41I 置換。
[0046]在某些實(shí)施例中，親本CBH為真菌纖維二糖水解酶1 (CBH1)，例如來(lái)自以下各項(xiàng) 的CBH1:紅褐肉座菌（Hypocreajecorina)、東方肉座菌（Hypocreaorientalis)、施韋尼 茲肉座菌（Hypocreaschweinitzii)、桔綠木霉（Trichodermacitrinoviride)、擬康氏 木霉（Trichodermapseudokoningii)、康長(zhǎng)木霉（Trichodermakonilangbra)、哈茨木霉 (Trichodermaharzanium)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、黑曲霉（Aspergillus niger)、微紫青霉菌（Penicilliumjanthinellum)、灰腐質(zhì)霉（Humicolagrisea)、嗜熱色 串抱（Scytalidiumthermophilum)和柄抱霉（Podosporaanderina)(或其相應(yīng)的無(wú)性型、 有性型或全型對(duì)應(yīng)形式），例如選自SEQIDNO: 3至15中的任一者的CBH1。在某些實(shí)施例 中，親本CBH與SEQIDN0:3具有至少90%序列同一性，例如至少95%序列同一性。
[0047] 本發(fā)明的方面包括分離的多核苷酸，其包含編碼如本文所述的親本CBH的變體 的多核苷酸序列。所述分離的多核苷酸可存在于載體中，例如表達(dá)載體或用于多核苷酸 增殖的載體。載體可存在于使載體增殖和/或表達(dá)如本文所述的所編碼CBH變體的宿 主細(xì)胞中。宿主細(xì)胞可為可用于使CBH變體多核苷酸增殖和/或表達(dá)所編碼CBH變體 的任何細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞等。可采用的合適真菌細(xì)胞類型的例子包括絲狀真 菌細(xì)胞，例如以下各項(xiàng)的細(xì)胞：里氏木霉、長(zhǎng)枝木霉（Trichodermalongibrachiatum)、綠 色木霉（Trichodermaviride)、康寧木霉（Trichodermakoningii)、哈茨木霉、青霉屬 (Penicillium)、腐質(zhì)霉屬（Humicola)、特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)、灰腐質(zhì)霉、金孢 子菌屬（Chrysosporium)、魯克文金抱子菌（Chrysosporiumlucknowense)、嗜熱毀絲菌 (Myceliophthorathermophila)、粘帚霉屬（Gliocladium)、曲霉菌屬（Aspergillus)、鏡抱 屬（Fusarium)、脈胞菌屬（Neurospora)、肉座菌屬（Hypocrea)、翹孢霉屬（Emericella)、黑 曲霉、泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、棘抱曲霉和構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans)。 或者，真菌宿主細(xì)胞可為酵母細(xì)胞，例如釀酒酵母、裂殖酵母（Schizzosaccharomyces pombe)、西方許旺酵母（Schwanniomycesoccidentalis)、乳酸克魯維酵母（Kluveromyces lactus)、產(chǎn)|元假絲酵母（Candidautilis)、白假絲酵母（Candidaalbicans)、具柄畢赤 酵母（Pichiastipitis)、畢赤酵母（Pichiapastoris)、解脂耶羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica)、多形漢遜酵母（Hansenulapolymorpha)、紅發(fā)夫酵母（Phaffiarhodozyma)、 Arxulaadeninivorans、漢遜德巴利酵母（Debaryomyceshansenii)或多形德巴利酵母 (Debaryomycespolymorphus)〇
[0048] 本發(fā)明的方面包括產(chǎn)生變體CBH的方法，其包括在由多核苷酸表達(dá)（或產(chǎn)生）CBH 變體的合適培養(yǎng)基中和合適條件下培養(yǎng)含有編碼CBH變體的多核苷酸的宿主細(xì)胞，例如其 中所述編碼CBH變體的多核苷酸存在于表達(dá)載體中（即其中CBH變體編碼多核苷酸可操作 地連接至驅(qū)動(dòng)CBH變體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的啟動(dòng)子。在某些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步 包括分離所產(chǎn)生的CBH變體。
[0049] 本發(fā)明的方面還包括含有如本文所述的CBH變體的組合物。合適的組合物的例子 包括但不限于洗滌劑組合物、飼料添加劑和用于處理（或水解）纖維素底物（例如含有纖 維素的紡織品，例如粗斜紋布；含有纖維素的生物質(zhì)材料，例如已任選地經(jīng)受水解前加工預(yù) 處理的木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)材料的混合物等）的組合物。包含如本文所述的CBH變體和纖 維素底物的組合物代表本發(fā)明的另外方面。含有CHB變體的洗滌劑組合物包括洗衣洗滌劑 和碗碟洗滌劑，其中此類洗滌劑可進(jìn)一步包含其他組分，例如表面活性劑。合適纖維底物的 例子包括但不限于草、柳枝稷、繩草、黑麥草、草蘆、芒草、糖加工殘余物、甘蔗渣、農(nóng)業(yè)廢物、 稻草、稻殼、大麥秸、玉米芯、谷草、小麥秸、油菜秸、燕麥秸、燕麥殼、玉米纖維、稿桿、大豆 桿、玉米桿、林業(yè)廢物、木漿、循環(huán)利用的木漿纖維、造紙污泥、鋸肩、硬木材、軟木材和其組 合。
[0050] 本發(fā)明的方面包括用于水解纖維底物的方法，其包括使所述底物與如本文所述的 變體CBH相接觸。在某些實(shí)施例中，以不含細(xì)胞的組合物形式提供CBH變體，而在其他實(shí) 施例中，以宿主細(xì)胞組合物形式提供CBH變體，其中宿主細(xì)胞表達(dá)CBH變體。因此，用于水 解纖維素底物的方法的某些實(shí)施例包括使所述底物與含有CBH變體表達(dá)載體的宿主細(xì)胞 相接觸。在某些實(shí)施例中，所述方法用于將木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成葡萄糖，其中在這 些實(shí)施例的一些中，木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)選自但不限于：草、柳枝稷、繩草、黑麥草、草蘆、芒 草、糖加工殘余物、甘蔗渣、農(nóng)業(yè)廢物、稻草、稻殼、大麥秸、玉米芯、谷草、小麥秸、油菜秸、燕 麥秸、燕麥殼、玉米纖維、稿桿、大豆桿、玉米桿、林業(yè)廢物、木漿、循環(huán)利用的木漿纖維、造紙 污泥、鋸肩、硬木材、軟木材和其組合。在某些其他實(shí)施例中，纖維素底物為含有纖維素的紡 織品，例如粗斜紋布，其中在這些實(shí)施例的一些中，所述方法用于處理靛青染色的粗斜紋布 (例如在石磨洗過(guò)程中）。
[0051] 本發(fā)明的方面包括含有如本文所述的CBH變體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液組合物。例如， 通過(guò)以下獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清液：在由多核苷酸表達(dá)CBH變體并且將CBH變體分泌到細(xì)胞培 養(yǎng)上清液中的合適培養(yǎng)基中和合適條件下培養(yǎng)含有編碼CBH變體的多核苷酸的宿主細(xì)胞。 此類細(xì)胞培養(yǎng)上清液可包含宿主細(xì)胞產(chǎn)生的其他蛋白質(zhì)和/或酶，包括內(nèi)源性和/或外源 性表達(dá)的蛋白質(zhì)和/或酶。培養(yǎng)基的此類上清液可原樣使用，進(jìn)行最低或不進(jìn)行產(chǎn)生后處 理，所述處理可典型地包括過(guò)濾以去除細(xì)胞碎片，細(xì)胞殺死程序和/或超濾或其他步驟，以 富集或濃縮其中的酶。此類上清液在本文中稱為"全發(fā)酵液"或"全纖維素酶發(fā)酵液"。
[0052] 可通過(guò)與一種或多種其他纖維素酶和/或一種或多種半纖維素酶共表達(dá)來(lái)產(chǎn)生 CBH變體?；蛘撸稍跊](méi)有其他纖維素酶或半纖維素酶的情況下產(chǎn)生CBH變體。在后一種情 況下，CBH變體任選地可與一種或多種其他纖維素酶和/或一種或多種半纖維素酶進(jìn)行物 理混合，以形成可用于特定應(yīng)用的酶組合物，例如可用于水解木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)底物。
[0053] 還涵蓋含有所需變體纖維素酶的其他組合物以及此類組合物的使用方法。
【附圖說(shuō)明】
[0054] 圖1A和1B示出來(lái)自紅褐肉座菌的野生型Cel7A(CBHl)的核酸序列（頂部線）（SEQ IDN0:1)和氨基酸序列（底部線）（SEQIDN0:3)。
[0055] 圖2A、2B、2C以及2D示出源自紅褐肉座菌（SEQIDN0:3)、東方肉座菌（SEQID N0:4)、施韋尼茲肉座菌（SEQIDN0:5)、桔綠木霉（SEQIDN0:6)、擬康氏木霉（SEQID 勵(lì):7)、康長(zhǎng)木霉（5￡〇10勵(lì):8)、哈茨木霉（5￡〇10勵(lì):9)、棘孢曲霉（5￡〇10勵(lì)：10)、黑 曲霉（SEQIDNO: 11)、微紫青霉菌（SEQIDNO: 12)、灰腐質(zhì)霉（EQIDNO: 13)、嗜熱色串孢 (SEQIDNO: 14)和柄孢霉（SEQIDNO: 15)的成熟形式的CBH酶的氨基酸比對(duì)。頂部的編號(hào) 指示成熟形式的紅褐肉座菌的氨基酸編號(hào)。同一、保守和半保守的氨基酸分別用星號(hào)（*)、 冒號(hào)（:）和句點(diǎn)（.）指示。
[0056] 圖3為表達(dá)載體pTTT-pyrG-cbhl的示意性圖示。
[0057] 圖4示出展現(xiàn)出顯著的解鏈溫度變化（ATm)的CBH置換變體。ATm處于X軸，其 中具有顯著ATm的各特異性變體示出在其ATm值處。截距值指示模型對(duì)于沒(méi)有置換的分 子（即野生型）的ATm的預(yù)測(cè)。
[0058] 圖5示出在whPCS測(cè)定中展現(xiàn)出顯著的性能指數(shù)變化（API)的CBH置換變體。 API處于X軸（標(biāo)記為"whPCSPI的收益"），其中具有顯著API的各特異性變體示出在 其近似API值處。截距值指示模型對(duì)于沒(méi)有置換的分子（即野生型）的API的預(yù)測(cè)。
[0059] 圖6示出在daCS測(cè)定中展現(xiàn)出顯著的性能指數(shù)變化（API)的CBH置換變體。API 處于X軸（標(biāo)記為"daCSPI的收益"），其中具有顯著API的各特異性變體示出在其近似 API值處。截距值指示模型對(duì)于沒(méi)有置換的分子（即野生型）的API的預(yù)測(cè)。
[0060] 圖7示出在PASC測(cè)定中展現(xiàn)出顯著的性能指數(shù)變化（API)的CBH置換變體。API 處于X軸（標(biāo)記為"daCSPI的收益"），其中具有顯著API的各特異性變體示出在其近似 API值處。截距值指示模型對(duì)于沒(méi)有置換的分子（即野生型）的API的預(yù)測(cè)。
[0061] 圖8A、8B和8C示出來(lái)自紅褐肉座菌、含有本文所述的氨基酸置換的CBH1氨基酸 序列（SEQIDN0:16)。標(biāo)號(hào)"Xaa"指示可進(jìn)行不止一個(gè)置換的氨基酸位置。在圖8C的底 部指示這些Xaa位點(diǎn)處的置換（在位置200、246和255處）。置換的氨基酸位置以粗下劃 線示出。
【具體實(shí)施方式】
[0062] 現(xiàn)將僅通過(guò)參考使用以下定義和實(shí)例來(lái)詳細(xì)描述本發(fā)明。本文提及的所有專利和 出版物，包括在這些專利和出版物中公開的所有序列，明確地以