一種新型α-淀粉酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能基因篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型α-淀粉酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] α -淀粉酶特異性的催化水解淀粉分子內(nèi)部的α -1，4糖苷鍵，它可以將淀粉水解 為更小的片段。其作為降解淀粉的主要水解酶，α-淀粉酶組成了一個(gè)非常龐大的糖基水 解酶家族。目前發(fā)現(xiàn)的淀粉酶大部分具有耐酸、耐高溫的性質(zhì)，雖然很多物種都能產(chǎn)生淀粉 酶，但是商業(yè)應(yīng)用的α-淀粉酶主要來(lái)自芽孢桿菌屬（地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和 解淀粉芽孢桿菌等）。目前廣泛投入商業(yè)應(yīng)用的耐熱α-淀粉酶主要來(lái)自枯草芽孢桿菌，嗜 熱脂肪芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。但是鮮有低溫高活的α-淀粉酶的工 業(yè)化應(yīng)用報(bào)道。而低溫下保持高活力的α-淀粉酶對(duì)有特殊溫度要求的工藝以及節(jié)約能源 等具有很高的應(yīng)用潛力，所以篩選低溫高活的新型α -淀粉酶具有十分重要的意義

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種新型α -淀粉酶，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004] 本發(fā)明的α -淀粉酶，包含有
[0005] 1)氨基酸序列為SEQ ID NO :1的α -淀粉酶；
[0006] 2)在1)進(jìn)行取代、缺失、添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的，且具有1)中酶學(xué)性質(zhì)的 α _淀粉酶；
[0007] 編碼上述α -淀粉酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO :2 ;
[0008] 本發(fā)明還提供一種重組大腸桿菌，轉(zhuǎn)化有攜帶上述基因的表達(dá)質(zhì)粒。
[0009] 上述的重組大腸桿菌，為大腸桿菌XH031-A1 (Escherichia coli XH031-A1)，于 2015年3月25日保藏于中國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2015163〇
[0010] 本發(fā)明的α -淀粉酶具有更寬的溫度耐受范圍，50°C下測(cè)得酶比活力高達(dá)5776U/ mg，而其在低溫10°C下仍能保持38%左右的活性。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1 :本發(fā)明的α-淀粉酶的活性與溫度的關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例1 : α -淀粉酶基因 laxh3357的獲取
[0013] 通過(guò)對(duì)深海新菌XH031進(jìn)行全基因組進(jìn)行分析，得到3個(gè)淀粉酶基因及其基因序 列，利用生物學(xué)軟件Primer5. 0設(shè)計(jì)上游引物（5, -CGGAATTCATGCACCCTCGACCGGC-3'）和下 游引物（5' -CCCTCGAGACGCCGCCACATCCG-3'）以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反 應(yīng)組成如下（50μ1反應(yīng)體系）：ddH 20 11.5以1、上游和下游引物各0.5以1，0嫩模板2 4 1、 2XGC Buffer25yl、Taq 0·5μ1、（1ΝΤΡ Mixture 8μ1。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性 5min， 95°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸3min30s，72°C終延伸lOmin，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié) 束后，將PCR產(chǎn)物回收得到α-淀粉酶基因 laxh3357。laxh3357是其中的一個(gè)α-淀粉酶 基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :2,編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :1，與其最相似蛋白 Alpha-amylase (Streptomyces hygroscopicus)，entry :P08486, identity 僅為 28. 3% 〇 表 明其是一種之前沒(méi)有報(bào)道過(guò)的α-淀粉酶基因。
[0014] 實(shí)施例2 :大腸桿菌克隆載體PUCm-T-laxh3357的構(gòu)建。
[0015] α -淀粉酶基因 laxh3357與載體PUCm-T的連接，采用DNA Ligation Kit連接，連 接體系（1〇μ1)如下：SolutionI5yl，DNA 片段 4yl，PUCm-T 載體 ΙμL。16°C連接 16h 所 得到的連接液即可獲得大腸桿菌克隆載體PUCm-T-laxh3357,用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
[0016] 實(shí)施例3 :大腸桿菌重組株JM109-PUCm-T-laxh3357的構(gòu)建
[0017] 加入200 μ 1解凍的感受態(tài)Ecoli. JM109和10 μ 1實(shí)施例2得到的連接液至 2mlEppendorf 管中，冰浴 30min，42°C熱休克 90s，冰浴 15min，加入 LB 培養(yǎng)基 800 μ 1，37°C 振蕩培養(yǎng)45min。菌液與4 μ I IPTG及40 μ I X-gal混合后涂布于含有100 μ g/ml氨芐青 霉素的LB平板上，37 °C培養(yǎng)12-14h。挑取白色菌落做PCR及雙酶切檢測(cè)，酶切體系（20 μ 1) 如下：(1(1!120 8 4 1，？此111-1'-1&叉113357 質(zhì)粒0嫩8 4 14。〇1?114 1，父11〇1114 1，10\!1811打6『 2 μ 1，瓊脂糖凝膠電泳中出現(xiàn)1428bp特異帶者為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化克隆，即含有PUCm-T-laxh3357 的大腸桿菌JM109-PUCm-T-laxh3357。將Iml陽(yáng)性克隆菌液送測(cè)，以M13測(cè)序通用引物測(cè)定 外源插入序列l(wèi)axh3357核苷酸序列。
[0018] 實(shí)施例4 :大腸桿菌表達(dá)載體pET24a(+)-laxh3357的構(gòu)建
[0019] 克隆載體PUCm-T-laxh3357和表達(dá)載體pET24a (+)分別用EcoRI和XholI雙酶切， 酶切體系（20 μ 1)如下：
[0020] 反應(yīng)體系 I :ddH20 8 μ 1，PUCm-T-laxh3357 質(zhì)粒 DNA 8 μ 1，EcoRIl μ 1， XholIl μ 1，10ΧΗ Buffer 2 μ 1 反應(yīng)體系 2 :ddH20 8 μ 1，pET24a(+)質(zhì)粒 DNA 8 μ 1， EcoRIl μ 1，XholIl μ 1，10ΧΗ Buffer 2 μ I.
[0021] 37°C酶切30min，電泳后分別回收兩個(gè)目的片段1428bp和5. 3Kb，二者分別與 α-淀粉酶YMOl基因全長(zhǎng)片段與表達(dá)載體PET24a(+)片段大小相同，用DNA Ligation Kit 連接，連接體系（1〇μ 1)如下：SolutionI5y 1，DNA 片段 L 5μ 1，pET24a(+)載體 L 1 μ 1， ddH20 2. 4 μ 1。16°C連接16小時(shí)即可獲得大腸桿菌表達(dá)載體pET24a (+) -laxh3357，用于轉(zhuǎn) 化大腸桿菌BL21(DE3)。
[0022] 實(shí)施例 5:大腸桿菌重組 BL21(DE3)-pET24a(+)-laxh3357(XH031-Al)的構(gòu)建
[0023] 加入200 μ 1解凍的感受態(tài)E. coliBL21和10 μ 1實(shí)施例4得到的連接液至 2mlEppendorf 管中，冰浴 30min，42°C熱休克 90s，冰浴 15min，加入 LB 培養(yǎng)基 800 μ 1，37°C 振蕩培養(yǎng)45min。菌液涂布于含有l(wèi)OOμg/ml卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)8-12h。 挑取菌落做雙酶切檢測(cè)，酶切體系（1〇μ1)如下：ddH 20 4 μ1，pET24a(+)-laxh3357質(zhì) 粒 DNA 4 μ 1，EcoRI 0.5 μ 1，XhoI 0.5 μ 1，10XH Buffer 1 μ 1。瓊脂糖凝膠電泳中出 現(xiàn)1428bp特異帶者為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化克隆，即含有pET24a(+)-laxh3357的大腸桿菌重組株 BL21 (DE3)-pET24a(+)-laxh3357。
[0024] 實(shí)施例6 :重組α -淀粉酶的制備
[0025] 挑取大腸桿菌重組株BL21 (DE3)-pET24a(+)-laxh3357單克隆于含有濃度為 100 μ g/ml卡那霉素的LB的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1 %接種量接種至200ml 含有100 μ g/ml卡那霉素的LB的液體培養(yǎng)基中，37°C 150rpm振蕩培養(yǎng)至006(|(|為0. 4-0. 5， 加入終濃度為0.1 mMIPTG，16°C誘導(dǎo)表達(dá)16-20h。誘導(dǎo)菌液4°C 6000rpm離心10min，收集 菌體，菌體用 IOmlIXNi 柱結(jié)合緩沖液（20mM Tris-HCl，PH = 8.0 ; IOmM 咪唑；0.5mM NaCl) 重懸并進(jìn)行超聲波破碎，破碎后4°C 12000rpm離心10min，收集上清液。上清液上至用平衡 好的Ni柱，用10倍體積I XNi柱洗滌緩沖液（20mM Tris-HC1，PH = 8. O ;20mM咪唑；0. 5mM NaCl)洗脫，然后依次用不同濃度（20mM，50mM，150mM)咪唑的洗滌緩沖液洗滌親和柱，最后 用濃度為250mM咪唑的洗脫液洗滌親和柱，收集洗脫液。洗脫液于透析液（20mM Tri s-HCl， PH = 8. O ;0. 85(g/v)NaCl，10%甘油（v/v))中透析24h后SDS-PAGE檢測(cè)洗脫液中蛋白分 布，合并含單一目的條帶的洗脫液即可得到重組α-淀粉酶。用Bradford法測(cè)定目的蛋白 的濃度，分裝后將蛋白凍于_20°C保存以備用。
[0026] 實(shí)施例7 :重組α -淀粉酶活性檢測(cè)及其酶學(xué)性質(zhì)
[0027] 在淀粉酶平板上打孔，分別取10微升誘導(dǎo)的空白對(duì)照上清和大腸桿菌菌株 ΧΗ031-Α1的蛋白上清點(diǎn)在對(duì)應(yīng)孔上，37°C放置3h，然后用盧戈氏碘液染色，結(jié)果可在棕色 背景上看到XH031-A1有明顯的透明圈，然后將純化的重組酶同樣方法點(diǎn)在淀粉板上發(fā)現(xiàn) 有較大透明圈，證明其活性高。
[0028] 用DNS試劑法測(cè)得此瓊膠酶的酶學(xué)性質(zhì)如下：
[0029] 1、最適溫度為50°C，10°C下酶活力為最適酶活的38%。
[0030] 2、熱穩(wěn)定性：0°C -100°C下放置lh，其中0°C -45°C能保持100%的活性。
[0031] 3、最適 PH 為 10.0
[0032] 4、PH穩(wěn)定性：PH = 3~12緩沖液中放置12h，其中PH = 6-11能保持57%以上的 活性。
[0033] 5、不同離子對(duì)酶活的影響：金屬離子如Na+、K+、Mn2+在低濃度ImM可以提高酶的活 力，分別提高21.5%、8. 1%和17. 2% ;重金屬離子如Fe3+、Zn2+、Ag+對(duì)酶活有明顯的抑制作 用。
[0034] 6、酶比活：50°C下測(cè)得酶比活力高達(dá)5776U/mg(圖1)
[0035] 本發(fā)明的低溫高活力α -淀粉酶在洗滌劑工業(yè)，不需要較高的水溫就能達(dá)到良好 的洗滌效果，從而節(jié)約了能源；在食品工業(yè)，可以縮短生面團(tuán)的發(fā)酵時(shí)間，提高生面團(tuán)的質(zhì) 量。更重要的一點(diǎn)，該淀粉酶能夠適應(yīng)較寬的溫度范圍，適用于需要溫度變化的工藝流程， 比如飼料添加方面，飼料調(diào)制需要較高溫度，而進(jìn)入飼養(yǎng)動(dòng)物體內(nèi)的溫度降溫37攝氏度， 整個(gè)過(guò)程該酶都可以發(fā)揮很好的作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種a-淀粉酶，其特征在于，所述的a-淀粉酶包含有： 1) 氨基酸序列為SEQ ID NO :1的a -淀粉酶； 2) 在1)進(jìn)行取代、缺失、添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的，且具有1)中酶學(xué)性質(zhì)的 a _淀粉酶。
2. -種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求1所述的a -淀粉酶。
3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
4. 一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒用于重組表達(dá)權(quán)利要求1所述的a -淀 粉酶。
5. 如權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒攜帶有權(quán)利要求2所述 的基因。
6. -種重組大腸桿菌，其特征在于，所述的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求4所述的重 組質(zhì)粒。
7. 如權(quán)利要求6所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述的重組大腸桿菌的保藏編號(hào) 為 CCTCC N0:M2015163。
8. 權(quán)利要求1所述的a _淀粉酶在飼料加工領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種新型α-淀粉酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO：1，編碼上述α-淀粉酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO：2。本發(fā)明的α-淀粉酶具有更寬的溫度耐受范圍，50℃下測(cè)得酶比活力高達(dá)5776U/mg，而其在低溫10℃下仍能保持38％左右的活性。CCTCC NO:M201516320150325
【IPC分類】C12N15-56, C12N9-28, C12N1-21, C12R1-19, C12N15-70
【公開(kāi)號(hào)】CN104862292
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510205474
【發(fā)明人】王巖, 張曉華, 宋慶浩
【申請(qǐng)人】中國(guó)海洋大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2015年4月25日