一種來自真菌的低溫α-淀粉酶及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的來自真菌的低溫α-淀粉酶是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)：(a)由SEQ?ID?NO.19所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將SEQ?ID?NO.19的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的編碼基因是如下(1)或(2)的脫氧核糖核苷酸：(1)具有SEQ?ID?NO.17的所示核苷酸序列；(2)具有SEQ?ID?NO.18所示核苷酸序列。本發(fā)明提供的重組宿主細胞包括具有上述編碼基因的重組表達載體。根據(jù)本發(fā)明的α-淀粉酶最適溫度為40℃，比常溫淀粉酶低10℃左右，且低溫適應性好，在0～30℃仍保持最高活力20％以上，在洗滌劑和紡織退漿中有巨大的應用前景。
【專利說明】—種來自真菌的低溫α-淀粉酶及其編碼基因與應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種在低溫下具有較好的活性的真菌α -淀粉酶，本發(fā)明還涉及該低溫淀粉酶的編碼基因與應用。
技術背景
[0002]Ct-淀粉酶(a-1,4-D-glucan-glucanhydrolase, EC3.2.1.1)屬于內(nèi)切型淀粉酶，是可對支鏈淀粉直鏈淀粉或其他-1，4-葡聚糖分子內(nèi)部的-1，4-糖苷鍵以隨機的方式進行水解，生成長度不等的直鏈和支鏈寡糖的一類酶的總稱，是淀粉工業(yè)主要酶，在食品加工、洗漆劑、紡織退衆(zhòng)、造紙工業(yè)等領域具有重要商業(yè)價值。低溫淀粉酶(cold-adaptedamylase)是指能在低溫下有效發(fā)揮催化作用的淀粉酶，一般最適溫度在35~45°C，除了以上所述應用外，還能用于低溫環(huán)境生物修復，在工業(yè)應用中因其低能耗而具有廣闊的前景。α -淀粉酶廣泛存在于包括人、動物、植物、真菌和細菌等各種生物中，從1956年首次報道分離α-淀粉酶開始，目前已經(jīng)分離并鑒定的超過120種α-淀粉酶，從數(shù)量上看微生物來源的ct -淀粉酶占大部分。微生物中能產(chǎn)生ct-淀粉酶的屬有:Bacillus,Thermomonospor,Acinetobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Aspergillus, Penicillus 等。目前在工業(yè)上大量使用的α -淀粉酶主要來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis),解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。
[0003]當前市場上應用的α-淀粉酶主要是由米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)得到的中溫真菌淀粉酶(TAKA-amyIase，真菌淀粉酶)和芽孢桿菌產(chǎn)生的高溫細菌α -淀粉酶，雖然酶活力較高，但是最適溫度較高(50V -90V )，且在較低溫度(常溫)活力很低，導致在洗滌劑和紡織退漿中需要加熱處理，工藝繁瑣且增加能耗；而低溫淀粉酶因其結構柔韌性能有效克服該工藝中的缺陷，且因其熱易變性可以在中溫環(huán)境下即可破壞結構，降低污染。
[0004]國內(nèi)外雖然篩選出一些新的低溫α-淀粉酶生產(chǎn)菌，但普遍因低溫菌生長較慢，表達活力很低，而限制了在工業(yè)上的應用。因此，如何篩選到既具有優(yōu)良性質(zhì)，又可以獲得高表達活力的低溫α-淀粉酶成為研究熱點。早在1992年，Georges Feller等曾報道交替單胞菌(Alteromonas haloplanctis)能產(chǎn)低溫α -淀粉酶(GeorgesFeller et al.1992.Purificat1n, Characterizat1n, and Nucleotide Sequence of theThermolabile a -Amylase from the Antarctic Psychrotroph Alteromonas haloplanctisA23.THE JOURNAL OF B1LOGICAL CHEMISTR.267 (8)):5217-5221.)，近年來，一系列來自于低溫細菌的低溫淀粉酶相繼被篩選出來并在大腸桿菌中實現(xiàn)了異源表達。同時，不少南極產(chǎn)淀粉酶低溫真菌被分離和鑒定出來，1997年，M.FenicediL等從南極維多利亞島上分離到五株都具有淀粉酶活力的不同的G.pannorum var.pannorum,其中n0.1顯示出了顯著的活力，有產(chǎn)業(yè)化的應用前景(M.FeniceaL et al.1997.Product1n of extracellularenzymes by Antarctic fungal strains.Polar B1l, 17:275-280) ；2011 年，AbiramyKrishn等再次在南極島上篩選到了數(shù)株低溫下分泌淀粉酶的真菌，其主要菌屬為Geomycespannorum(Abiramy Krishn et al.2011.Extracellular hydrolase enzyme product1n bysoil fungi from King George Island, Antarctica.Polar B1l, 34:1535 - 1542)。雖然對Geomyces pannorum具有可觀的淀粉酶活性,但關于其淀粉酶基因序列和蛋白序列并無報道，且由于該菌培養(yǎng)條件限制，至今還沒有分離純化出該菌的淀粉酶，對其酶學性質(zhì)尚未研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種來自真菌的低溫α-淀粉酶及其編碼基因。
[0006]本發(fā)明提供的來自真菌的低溫α -淀粉酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì):(a)由SEQID N0.19所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將SEQ ID N0.19的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0007]該低溫α -淀粉酶具有與SEQ ID N0.19所示氨基酸序列至少70%同源性的序列。更優(yōu)選地，該低溫α -淀粉酶具有與SEQ ID N0.19所示氨基酸序列至少80%同源性的序列。進一步優(yōu)選地，該低溫α -淀粉酶具有與SEQ ID N0.19所示氨基酸序列至少90%同源性的序列。最佳地，該低溫α -淀粉酶具有與SEQ ID N0.19所示氨基酸序列至少99%同源性的序列。
[0008]本發(fā)明提供的低溫α-淀粉酶的編碼基因選自如下(1)-(4)的脫氧核糖核苷酸:(I)具有SEQ ID N0.17所示核苷酸序列；(2)具有SEQ ID N0.18所示核苷酸序列；(3)具有與所述(I)或(2)所示核苷酸序列至少70%同源性的序列；(4)該核苷酸序列不限于SEQ IDN0.17或SEQ ID N0.18所示序列，任何經(jīng)過密碼子優(yōu)化后得到如SEQ ID N0.19所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或其衍生的功能類似的蛋白質(zhì)的核苷酸序列均落入本專利保護范圍內(nèi)。
[0009]該編碼基因具有與SEQ ID N0.17所示核苷酸序列或SEQ ID N0.18所示核苷酸序列至少70%同源性的序列。更優(yōu)選地，該編碼基因具有與SEQ ID N0.17所示核苷酸序列或SEQ ID N0.18所示核苷酸序列至少80%同源性的序列。進一步優(yōu)選地，該編碼基因具有與SEQ ID N0.17所示核苷酸序列或SEQ ID N0.18所示核苷酸序列至少90%同源性的序列。最佳地，該編碼基因具有與SEQ ID N0.17所示核苷酸序列或SEQ ID N0.18所示核苷酸序列至少99%同源性的序列。
[0010]本發(fā)明提供的重組表達載體包括上述編碼基因。
[0011]所述重組表達載體為在曲霉表達載體PBC12FNH的多克隆位點間插入上述編碼基因而得到的重組表達載體。
[0012]本發(fā)明提供的重組宿主細胞包括上述重組表達載體。
[0013]所述重組宿主細胞是將上述重組表達載體轉入到米曲霉RIB40pyrF營養(yǎng)缺陷型菌株PFl (CGMCC NO:9129)中得到的重組宿主細胞。
[0014]本發(fā)明提供一種制備重組真菌低溫α -淀粉酶的方法。
[0015]本發(fā)明所提供的制備重組真菌低溫α -淀粉酶的方法，是低溫(20°C )發(fā)酵培養(yǎng)上述含有低溫α-淀粉酶編碼基因的重組菌，得到低溫α-淀粉酶。
[0016]本發(fā)明成功地公開了 Geomyces Pannorumα -淀粉酶基因和蛋白質(zhì)氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的低溫α -淀粉酶最適溫度40°C，且低溫下酶活較高，適于工業(yè)上應用的要求。本發(fā)明得到的重組宿主細胞，低溫下發(fā)酵培養(yǎng)，適于上述低溫α-淀粉酶基因的表達。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1示出了表達載體PBC12FNHA2構建圖；
[0018]圖2示出了 GpA2在米曲霉RIB40-PF1-A2重組菌誘導表達和純化的蛋白電泳圖；
[0019]圖3示出了 GpA2最適作用溫度為40°C (ρΗ5.0的條件下測定)，且在O~40°C保持較高酶活力；
[0020]圖4示出了 GpA2在40°C條件下穩(wěn)定，在40°C條件下孵育30min，仍有65%殘余酶活力，而在60°C下孵育5min基本失活；其中40°C ( )，50°C (.)，60°C ( ▲);
[0021]圖5示出了 GpA2最適作用pH為5.0，在ρΗ3.0~6.0區(qū)間內(nèi)(40°C的條件下測定)具有較高酶活力；
[0022]圖6示出了 GpA2在ρΗ4.0~9.0的區(qū)間內(nèi)30°C孵育30min后均具有較好的pH穩(wěn)定性。

【具體實施方式】
[0023]以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明保護的范圍。
[0024]下述實施例中所述試驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑或者耗材，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑獲得。如《分子克隆:實驗室手冊》(NewYork =Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進行,或按照制造廠商所建議的條件。實施例中用到的緩沖液和培養(yǎng)基如下:
[0025](I)TE(100ml):
[0026]ZnSO4.7H200.35g, MnCl2.4H200.5g, H3BO30.03g, CoCl2.6H200.945g,CuCl2.2H200.01g, NiCl.6H200.12g, NaMoO4.2H200.18g，6M HCl 13ml，加去離子水定容至500mLo
[0027](2)磷酸鈉緩沖液(100ml，ρΗ5.8):
[0028]Na2HPO4.12Η200.5788g, NaH2PO4.2Η202.8996g。
[0029](3)Tris-HCl 緩沖液(100ml, ρΗ7.5):
[0030]Tris0.6057g，用 HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7.5。
[0031](4)溶液 1:
[0032]NaCl0.7M，蔗糖1.0g,溶于50ml磷酸鈉緩沖液中，定容(加水)至10ml。
[0033](5)溶液 II:
[0034]山梨醇22.3085g, CaCl20.578g, NaCl0.204如，溶于 2Oml Tr1-HCl 緩沖液中，定容(加水)至100ml。
[0035](6)溶液 II1:
[0036]PEG400030g, CaCl20.289g,溶于 10ml Tr1-HCl 緩沖液中，定容(加水)至 50ml。
[0037](7) CM 培養(yǎng)基(100ml):
[0038]NaNO30.6g, KC10.05g, KH2PO40.08g, K2HPO40.104g,葡萄糖 lg，MgSO40.052g,Peptone0.2g, Yeast extract0.lg,尿苷 0.1221g, TElOOul ;若配成斜面，則加入 1.5 ~2.0g
瓊脂粉。
[0039](8) MM 培養(yǎng)基(100ml):
[0040]NaNO30.6g, KC10.05g, KH2PO40.08g, K2HPO40.104g,葡萄糖 lg，MgSO40.052g,TElOOul，蔗糖 20.54g。
[0041]瓊脂粉:上層0.8g，下層1.2g。
[0042](9)發(fā)酵培養(yǎng)基(100ml):
[0043]糊精2g,鹿糖 0.3g, Peptone0.lg, Yeast extract0.5g, NaNO30.lg,MgSO4.7H200.05g, FeSO4.7H200.001g。
[0044]實施例1.低溫α -淀粉酶基因的擴增
[0045]1.1菌株及其培養(yǎng)
[0046]從馬來西亞大學生物科學學院課題合作項目中獲贈Geomyces pannorumAK07KGI1001R1-2(1)(菌種鑒定 NCBI 登錄號 JF720026.biramy Krishn et al.2011.Extracellular hydrolase enzyme product1n by soil fungi from King GeorgeIsland, Antarctica.Polar B1l, 34:1535 - 1542)。
[0047]用無菌水從培養(yǎng)10天的PDA斜面上洗下G.pannorum孢子,接種液體培養(yǎng)基,20°C培養(yǎng)7天收集菌絲體，用于基因組提??；用牙簽接種淀粉固體培養(yǎng)基，20°C培養(yǎng)5天收集菌絲體，用于總RNA提取。
[0048]1.2基因組提取
[0049]參照Omega真菌基因組提取試劑盒說明書
[0050]1.3 總 RNA 提取
[0051 ] 按照Takara RNA提取試劑說明書進行操作。
[0052]1.4cDNA 第一鏈合成
[0053]以抽提的總mRNA為模板，用Takara試劑盒的方法獲得cDNA第一鏈，PCR體系及步驟如下:
[0054]
OligadTIpL
dNTP MixtureIjaL
模板(總RNA)SuI
RNaseFreedH^O3 ItL
總體枳1pL
[0055]65°C保溫5min，冰上迅速冷卻，向上述反應管中加入
[0056]
5 X PrimeScripl II Buffer4ul
RNase inhibitor (40U/uDOJul
[0057]
PrimeScript II RTase (200U/ul)Iul
RNascFrcc dH1_4, Sxil
總體1?20ul
[0058]42°C 45min,95°C 5min，冰上冷卻。
[0059]1.5Geomyces pannorum a -淀粉酶保守區(qū)域克隆
[0060]在NCBI上找到與Geomyces pannorum相近種屬的菌種以及其它絲狀真菌的α -淀粉酶氨基酸序列。在α-淀粉酶氨基酸保守區(qū)域TDRFARTDGS的位置設計正向兼并引物JGpfl，在氨基酸保守區(qū)域RGMYLMVD的位置設計反向兼并引物JGprl。其中:
[0061]JGpfl的序列為SEQ ID N0.1:ACNGA TMGTN TTGCR MGBAC (該引物由上海捷瑞生物工程有限公司生物工程公司合成，下同)
[0062]JGprl 的序列為 SEQ ID N0.2:ACNAY RTCRA CCATN ARRTA CAT
[0063]以Geomyces pannorum基因組為模板,用兼并引物JGpfl和JGprl,進行PCR擴增α -淀粉酶保守區(qū)域，PCR體系為:
[0064]

【權利要求】
1.一種來自真菌的低溫α -淀粉酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì):(a)由SEQ ID N0.19所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將SEQ ID N0.19的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.一種根據(jù)權利要求1所述的低溫α-淀粉酶的編碼基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因是如下⑴或⑵的脫氧核糖核苷酸: (1)具有SEQID N0.17所示核苷酸序列； (2)具有SEQID N0.18所示核苷酸序列。
4.一種重組表達載體，其特征在于，該重組表達載體包括根據(jù)權利要求2或3所述的編碼基因。
5.根據(jù)權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體以pBC-Hygro為原始質(zhì)粒。
6.一種重組宿主細胞，其特征在于，該重組宿主細胞包括根據(jù)權利要求4所述的重組表達載體。
7.根據(jù)權利要求6所述的重組宿主細胞，其特征在于，所述重組宿主細胞是將根據(jù)權利要求4所述的重組表達載體轉入到米曲霉的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株中得到的重組宿主細胞。
8.根據(jù)權利要求7所述的重組宿主細胞，其特征在于，所述重組宿主細胞是將根據(jù)權利要求4所述的重組表達載體轉入到保藏號為CGMCC NO:9129的米曲霉的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株RIB40-PF1中得到的重組宿主細胞。
【文檔編號】C12N1/15GK104178471SQ201410261362
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權日:2014年6月12日
【發(fā)明者】高蓓, 魏東芝, 毛佑志 申請人:華東理工大學