一種擬南芥的鎂毒害脅迫處理方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種擬南芥的鎂毒害脅迫處理方法，包括以下步驟：（1）培養(yǎng)基的配置（2）擬南芥的種植（3）鎂脅迫處理方法：將擬南芥種子單粒成行種植在培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿封口后置于4℃冰箱中處理2天；然后將培養(yǎng)皿豎直培養(yǎng)在溫室中，培養(yǎng)條件是22℃±1℃，光強65uMm-2s-1，16h光照/8h黑暗；通過對鎂脅迫培養(yǎng)基上生長28天的EMS突變株的形態(tài)特征觀察，篩選性狀優(yōu)良的突變株，移栽到含有全部養(yǎng)分的蛭石中正常培養(yǎng)。本發(fā)明建立了科學合理的擬南芥鎂脅迫培養(yǎng)體系，成功篩選到性狀優(yōu)良的鎂毒害響應(yīng)EMS突變體。本發(fā)明不僅為模式植物擬南芥提供了堅實的科研基礎(chǔ)，也為未來農(nóng)業(yè)應(yīng)用高鎂土壤生產(chǎn)糧食奠定理論基石。
【專利說明】一種擬南芥的鎂毒害脅迫處理方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種擬南芥的鎂毒害脅迫處理方法，屬于鎂對植物的脅迫處理方法的

【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 鎂離子是細胞中重要的兩價陽離子。人們對缺鎂引起的植物生理變化及其分子機 制比較清楚。缺鎂能引起淀粉和蔗糖等碳源在植物葉片中的積累，并且葉片中鎂離子的濃 度和蔗糖的濃度存在明顯相反的趨勢，不但能夠調(diào)節(jié)蔗糖的代謝，并能夠影響蔗糖的運輸。 高濃度的蔗糖能夠抑制CAB2 (編碼葉綠素 a/b蛋白）的表達，并且導致了葉綠素的降解和 C02的同化。另外，鎂缺乏會導致活性氧的積累，從而產(chǎn)生一系列活性氧傷害。
[0003] 雖然對缺鎂生理的研究了解的比較透徹，但人們對鎂毒害引起植物的生理變化及 其機理卻知之甚少，特別是鎂毒害脅迫條件下的信號傳導機制。鎂毒害之所以難以研究，是 因為植物吸收較多的鎂離子后會調(diào)控鎂離子的運輸和貯存，濃度較高的鎂離子會促進細胞 外部的鈣離子被鎂離子所取代，細胞壁的穩(wěn)定性和細胞質(zhì)膜的滲透性等都會發(fā)生改變。
[0004] 基于這些困難，提出本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有的上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種擬南芥的鎂毒害脅迫處理方 法，根據(jù)擬南芥在不同鎂離子濃度下的生長狀態(tài)，建立了擬南芥鎂脅迫突變體篩選體系，采 用該系統(tǒng)證明了擬南芥幼苗的形態(tài)至少是部分依賴于ABA-ABI1-DELLA的途徑來響應(yīng)鎂毒 害的。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 本發(fā)明擬南芥的鎂毒害脅迫處理方法，包括以下步驟： (1) 培養(yǎng)基的配置： a、 正常鎂培養(yǎng)基：LM，1. 5 mM MgS04 · 7H20 ; b、 鎂毒害培養(yǎng)基：HM, 28 mM MgS04 · 7H20 ; c、 含有不同濃度鎂離子的培養(yǎng)基：在鎂培養(yǎng)基基礎(chǔ)上配置的含有不同濃度外源ABA 的培養(yǎng)基；其中添加 2.0mM NH4N03、lmM KH2P04、L9mM KN03、0.3mM CaCl2.2H20、5yM ΚΙ、 100 μ M H3B03、30 μ M ZnS04. 7H20、100 μ M MnS04. H20、1 μ M Na2Mo04. 2Η20、0· 1 μ M CoCl2. 6H20、 0· 1 μ Μ CuS04. 5Η20、100 μ Μ FeS04. 7Η20 或 100 μ Μ Na2EDTA. 2Η20 ; 將上述培養(yǎng)基用1Μ的NaOH將ΡΗ調(diào)節(jié)至5. 8,然后添加1%的瓊脂粉，將配置好的培養(yǎng) 基放在高壓滅菌鍋中115°C滅菌15分鐘； (2) 擬南芥的種植： A1 :取適量擬南芥種子，倒入滅菌處理的1. 5ml離心管中，加入70%乙醇渦旋振蕩 lmin，吸除乙醇，然后加入6% NaCIO潤旋振蕩8min，立即吸除，用無菌水清洗種子5遍，每遍 2min，加入1. 5ml無菌水靜置lOmin，吸除后再水洗2遍，種子表面消毒完成； A2 :用滅過菌的lml槍頭將種子根據(jù)需要均勻的點播在步驟（1)中的培養(yǎng)基上，將培養(yǎng) 皿置于無菌操作臺上吹干多余的水分，用Parafilm膜將培養(yǎng)皿封口后置于4°C冰箱中處理2 天； A3 :將培養(yǎng)皿置于22°C ±1°C，光強65uM m 2 s 1，16h光照/8h黑暗的條件下堅直放 置培養(yǎng)； (3)鎂脅迫處理方法 將用NaCIO消毒后的擬南芥種子單粒成行種植在含有28mM Mg2+鎂毒害和0. 05mM Mg2+ 鎂缺乏的培養(yǎng)基上，用Parafilm膜將培養(yǎng)皿封口后置于4°C冰箱中春化2天；春化結(jié)束后， 將培養(yǎng)皿放置在22°C ±1°C，光強65uM πΓ2 s' 16h光照/8h黑暗的溫室中堅直培養(yǎng)；在鎂 脅迫突變體篩選過程中，以Col-Ο為背景，通過對鎂脅迫培養(yǎng)基上生長28天的EMS突變株 的形態(tài)特征觀察，篩選性狀優(yōu)良的突變株，移栽到含有全部養(yǎng)分的蛭石中正常培養(yǎng)，直至成 熟結(jié)種。
[0007] 本發(fā)明的有益效果如下： 本發(fā)明擬南芥的鎂毒害脅迫處理方法，通過在含有不同鎂離子濃度的改良MS培養(yǎng)基 上生長的野生型擬南芥葉色、株高、根長等形態(tài)差異的比較，建立了科學合理的鎂脅迫擬南 芥EMS突變體篩選體系。28mM作為鎂毒害突變體的篩選濃度。依托該篩選體系篩選性狀優(yōu) 良的鎂脅迫EMS突變體。同時，該體系也為我們下步探究鎂脅迫特別是鎂毒害信號傳導機 制奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為未來農(nóng)業(yè)應(yīng)用高鎂土壤生產(chǎn)糧食奠定理論基石。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1為擬南芥在各種鎂離子濃度不同的培養(yǎng)基上14天的生長特征表形； 圖2為擬南芥在各種鎂離子濃度不同的培養(yǎng)基上14天的根長生長特征； 圖3為擬南芥在各種鎂離子濃度不同的培養(yǎng)基上14天的鮮重和干重：顯著性差異采用 Student's t-test,標準誤差線表示20個單株的標準誤； 圖4為擬南芥鎂毒害突變體E Mu :a: 28天；b: 90天；c: 110天。

【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合具體實施對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0010] 擬南芥的鎂毒害脅迫處理方法，包括以下步驟： (1) 培養(yǎng)基的配置： a、 正常鎂培養(yǎng)基：LM，1. 5 mM MgS04 · 7H20 ; b、 鎂毒害培養(yǎng)基：HM, 28 mM MgS04 · 7H20 ; c、 含有不同濃度鎂離子的培養(yǎng)基：在鎂培養(yǎng)基基礎(chǔ)上配置的含有不同濃度外源ABA的 培養(yǎng)基；其中添加2. OmM NH4N03、lmM ΚΗ2Ρ04、1· 9mM ΚΝ03、0· 3mM CaCl2. 2Η20、5μΜ ΚΙ、100μΜ H3B03、30 μ M ZnS04. 7H20、100 μ M MnS04. H20、1 μ M Na2Mo04. 2Η20、0· 1 μ M CoCl2. 6Η20、0· 1 μ Μ CuS04. 5Η20、100 μ Μ FeS04. 7Η20 或 100 μ Μ Na2EDTA. 2Η20 ; 將上述培養(yǎng)基用1Μ的NaOH將ΡΗ調(diào)節(jié)至5. 8,然后添加1%的瓊脂粉，將配置好的培養(yǎng) 基放在高壓滅菌鍋中115°C滅菌15分鐘； (2) 擬南芥的種植： A1 :取適量擬南芥種子，倒入滅菌處理的1. 5ml離心管中，加入70%乙醇渦旋振蕩 lmin，吸除乙醇，然后，加入6% NaCIO潤旋振蕩8min，立即吸除，用無菌水清洗種子5遍，每 遍2min，加入1. 5ml無菌水靜置lOmin，吸除后再水洗2遍，種子表面消毒完成； A2 :用滅過菌的lml槍頭將種子根據(jù)需要均勻的點播在步驟（1)中的培養(yǎng)基上，將培養(yǎng) 皿置于無菌操作臺上吹干多余的水分，用Parafilm膜將培養(yǎng)皿封口后置于4°C冰箱中春化2 天； A3:將培養(yǎng)皿置于22°C±1°C，光強65uMm2 s1，16h光照/8h黑暗的條件下堅直放 置培養(yǎng)； (3)鎂脅迫處理方法 將用NaCIO消毒后的擬南芥種子單粒成行種植在含有28mM鎂毒害和0. 05mM鎂缺乏的 培養(yǎng)基上，用Parafilm膜將培養(yǎng)皿封口后置于4°C冰箱中春化2天；春化結(jié)束后，將培養(yǎng)皿 放置在22°C ±1°C，光強65uM πΓ2 s' 16h光照/8h黑暗的溫室中堅直培養(yǎng)；在鎂脅迫突變 體篩選過程中，以Col-Ο為背景，通過對鎂脅迫培養(yǎng)基上生長28天的EMS突變株的形態(tài)特 征觀察，篩選性狀優(yōu)良的突變株，移栽到含有全部養(yǎng)分的蛭石中正常培養(yǎng)，直至成熟結(jié)種。
[0011] 結(jié)果測定 1、擬南芥主根和根毛的觀察及測量 用LEICA MZ 95體視顯微鏡觀察在不同培養(yǎng)基上生長7天或14天的擬南芥主根和根 毛生長情況，應(yīng)用IMAGE J軟件計算主根和根毛的長度，每組實驗設(shè)置10個重復。
[0012] 2、幼苗生物量的測定 將在不同條件下培養(yǎng)的100株新鮮收獲的擬南芥幼苗放在1. 5mM離心管中（設(shè)置至少 3個獨立重復），用0. 0001的電子天平稱量植株鮮重并記錄。然后將新鮮的材料放于80 °C 烘箱烘干兩天，直至干重不在發(fā)生變化（測量3次，每次間隔30分鐘），計算幼苗的干重。
[0013] 3、根細胞形態(tài)的觀察 用 HCG(chloroacetaldehyde:water:glycerol=8 :3 :1)透明液處理擬南芥根部細胞： ⑴配置改良的HCG透明液：30 ml超純水，80g水合氯醒，10 ml 100%的甘油，攪拌1 小時，使其充分融化混勻。
[0014] (2)將新鮮的擬南芥材料置于載玻片上，滴加2-4滴HCG透明液，輕輕地蓋上蓋玻 片，以免產(chǎn)生氣泡（也可不蓋）。
[0015] (3)將樣品室溫放置過夜，使得樣品處理更加徹底。
[0016] (4)用Olympus DP 71光學顯微鏡觀察擬南芥主根伸長區(qū)的細胞形態(tài)，用IMAGEJ 軟件計算伸長區(qū)細胞的長度。
[0017] 4、淀粉染色及其含量測定 (1)淀粉碘染色 將在不同培養(yǎng)基上生長14天的擬南芥葉片，放入50 ml離心管中，加95%的乙醇，置于 70°C烘箱中進行脫色，直至葉片完全發(fā)白。棄去95%的乙醇，加入碘一碘化鉀溶液（取碘 〇. 5g與碘化鉀1. 5g，加水25ml)使其充分溶解染色10-15min。棄去碘一碘化鉀染色液，用 雙蒸水沖洗干凈后即可用LEICA MZ 95立體顯微鏡拍照。
[0018] (2)淀粉含量測定 擬南芥葉片淀粉含量的測定如下： B1、將100 mg新鮮的植物葉片浸泡在80% (v/v)乙醇中，在70°C條件下用80% (v/v) 乙醇抽提兩次。
[0019] B2、用淀粉葡糖苷酶和熱穩(wěn)定淀粉酶處理上述不溶物質(zhì)，通過測定產(chǎn)物葡萄糖的 含量計算淀粉的含量。
[0020] 5、蔗糖含量測定 (1)樣品處理：取0. 1克烘干的擬南芥葉片，研磨（加蒸餾水5毫升），移入離心管，離 心5分鐘（5000r/min)，取上層離心液，倒入容量瓶，再向離心管加5毫升，再次離心，然后移 液至50毫升容量瓶，定容。
[0021] (2)蒽酮顯色法：先配恩酮顯色劑（0· 4克恩酮溶于100ml 88/100的硫酸中）， 然后取樣品液lml，加入3ml恩酮試劑，搖勻，置于水浴加熱5分鐘，取出后立即冷卻，測定 640nm下的吸光度。做標準曲線。
[0022] (3)蔗糖的測定：取樣品液10毫升，加入2mol/L氫氧化鉀，置于沸水浴中10分 鐘，然后迅速冷卻，定容50毫升，然后進行恩酮試劑顯色測定，得光密度。
[0023] 6、葉綠素含量的測定 采用P〇rra(1989)方法測定擬南芥葉片的葉綠素總量。
[0024] (1)取100 mg新鮮的幼苗葉片加10 ml 80%丙酮遮光浸泡提取1-2天，直至肉眼 觀察葉片完全發(fā)白為止。
[0025] (2)于663 nm、645 nm和445. 5 nm處測定吸光值。然后有公式： chla (ug. ml-1) =12. 25*A663. 2-2. 79*A646. 8 chib (ug. ml-1) =21. 5*A646. 8-5. 1*A663. 2 總胡蘿卜素= (1000*A470-1.63* chla -63.14* chlb)/214,用 klorofyllimaaritys軟 件分別計算不同材料的葉綠素含量。
[0026] 7、ΑΒΑ含量測定 (1)將新鮮收獲的植物材料葉片和根分離后，放入5 ml含有1 mM苯甲醇和2.4 mM檸 檬酸的100%甲醇中。
[0027] (2)將提取物1. 5 X 103 g離心15分鐘，用70%的甲醇（v/v)將上清液調(diào)整至相 同的體積，用S印-Pak C18分離柱過濾分離上清液。
[0028] (3)用100ul甲醇和900ul Tris緩沖鹽溶液（含有25mM三羥甲基氨基甲烷，100 mM NaCl，3 mM NaN3，2 mM MgCl2 · 6H20, PH 7. 5)將干燥后的提取物重新懸浮。
[0029] (4)按照Phytodetek ΑΒΑ免疫分析試劑盒的操作說明測定樣品中的ΑΒΑ含量。
[0030] 8、元素含量測定 (1)用雙蒸水將生長14天的擬南芥樣品沖洗干凈，然后置于濾紙上吸干水份。
[0031] (2)將沖洗干凈的樣品置于70°C烘箱內(nèi)烘2-3天左右，直到完全烘干為止，將樣 品充分研磨成粉末狀。
[0032] (3)取100mg樣品加入5ml HN03和HC1 (1: l，v/v)的混合液，500°C硝煮4小時。
[0033] (4)待硝煮完全后，冷卻，加入雙蒸水至總體積為20ml，過濾，定容。
[0034] (5)用原子吸收光譜儀測定樣品中各種無機元素的含量。
[0035] 9、GFP熒光檢測 將生長五天的擬南芥pRGA:GFP - RGA幼苗用28mM MgS04 · 7H20和20 μ Μ ΑΒΑ分別處 理24小時和2小時，用ZEISS LSM 710(X40物鏡，488 nm激發(fā)波長）共聚焦顯微鏡，觀 察幼苗根細胞核的GFP-RGA蛋白的積累情況，然后用10 μ M GA3處理1.5小時，觀察DELLA 蛋白的降解情況。
[0036] 10、植物總RNA提取 按TIANGEN RNAprep pure plant kit的標準操作規(guī)程提取RNA。
[0037] (1)整個實驗在無菌操作臺中進行，實驗過程需戴口罩及手套，并及時更換，防止 RNase污染。
[0038] (2)取50-100mg植物組織用液氮迅速充分研磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移入預冷的 RNase-freel. 5離心管，加入450ul裂解液RL(lml RL中加入10ul β -巰基乙醇）渦旋振 蕩混勻，56°C水浴3min。
[0039] (3)將溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上，12, 000 rpm離心5min，小心吸取收集管中的上清 至RNase free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉淀。
[0040] (4)緩慢加入0· 5倍上清體積的無水乙醇（通常為225ul)，混勻（此時可能會出 現(xiàn)沉淀）將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，12, 000 rpm離心lmin，倒掉收集管 中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0041] (5)向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1，12, 000 rpm離心lmin，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0042] (6)向吸附柱CR3中央加入80ul的DNase I工作液，室溫放置lSmiruDNase I工 作液的配置：取l〇ul的DNase I儲存液放進新的RNase-freel. 5離心管中，加入70ul RDD 溶液，輕柔混勻。重復步驟（5)。
[0043] (7)向吸附柱CR3中加入500ul的漂洗液RW，室溫靜置2min，12, 000 rpm離心 lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中，重復步驟（7)。
[0044] (8) 12, 000 rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CR3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹 底晾干吸附材料中殘留的漂洗液。
[0045] (9)將吸附柱CR3放到一個新的RNase-freel. 5離心管中，向吸附膜的中間部位 懸空滴加 50ul RNase-free ddH20,室溫放置 2min，12, 000 rpm 離心 2min，得到 RNA 溶液。
[0046] 11、RNA 反轉(zhuǎn)錄 如PrimeScript RT Reagent Kit的標準操作說明。
[0047] (1)按照lug的RNA總量，根據(jù)測定的RNA濃度計算加入的RNA溶液的體積。然 后在 Microtube 管中加入 lul Oligo dT Primer(50uM)，lul dNTP Mixture(10 mMeach)， 加入RNase free dH20至終體積為10ul。
[0048] (2)在PCR儀上進行下列條件的變性、退火反應(yīng)：65°C 5min，冰上急冷。
[0049] (3)在上述 Microtube 管中加入 4ul 5 XPrimerScriptTM Buffer, 0· 5ul RNase Inhibitor (40U/ul)，lul PrimerScriptTM RTase(200U/ul), 4.5ul RNase free ddH20 至 終體積為20ul。
[0050] (4)在PCR儀上進行下列的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42°C 60分鐘，70°C 15分鐘，4°C保存，得 至lj SSDNA。
[0051] 結(jié)果分析 1、鎂毒害和外源ΑΒΑ對擬南芥主根和根毛的影響 將Ler種植在含有不同鎂離子濃度的MS培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)在不同的鎂離子濃度下（1. 5， 20，28，40mM)，擬南芥主根長度的差異非常明顯。當鎂離子濃度為1.5mM時，Ler的生長 狀態(tài)是最好的，主根最長，葉片最大。而當鎂離子濃度高于或者低于這個濃度時都不同程度 上抑制了主根的伸長。
[0052] 另外，鎂毒害（28mM)也一定程度上促進了根毛的增加和伸長，這與以Col-Ο型擬 南芥為材料獲得的形態(tài)數(shù)據(jù)是一致的。
[0053] 不同濃度的外源ΑΒΑ在一定程度上抑制主根的伸長，并促進根毛的發(fā)育和伸長， 因此，鎂脅迫對擬南芥根長和根毛的影響可能是通過ΑΒΑ起作用的。
[0054] 同時，對不同ΑΒΑ濃度（0，0.3，0.6，1，3，8，15Mmol)下的擬南芥生長狀態(tài)做 了研究。發(fā)現(xiàn)隨著外源ΑΒΑ濃度的升高（0-3Mffl〇l)擬南芥的主根逐漸變短，根毛卻逐漸變 長；當外源ΑΒΑ濃度高于時，ΑΒΑ嚴重抑制了主根的伸長，有的根出現(xiàn)了嚴重的畸形， 但是與低濃度外源ΑΒΑ不同的是，高濃度ΑΒΑ抑制了根毛的伸長，植株也不能正常生長，這 可能是因為過高濃度的外源ABA(>3Mmol)超越了植物體內(nèi)正常的調(diào)控范圍。
[0055] 2、Q-DELLA蛋白負向調(diào)控鎂毒害 在Q-DELLA突變體的抗性試驗中，發(fā)現(xiàn)Q-DELLA突變體能夠緩解鎂毒害引起的生長抑 制，而DELLAs的單突變體、雙突變體和三突變體都沒有顯著變化。Q-DELLA與野生型擬南 芥Ler的根長在鎂離子濃度是1. 5mM(LM)時幾乎沒有差異，但是當我們把這兩種擬南芥種 植在鎂毒害（HM)培養(yǎng)基上時，發(fā)現(xiàn)在不同時期（7天，11天，14天），相對于野生型擬南芥， Q-DELLA突變體能更好的適應(yīng)鎂毒害的環(huán)境，緩解鎂毒害對主根的抑制，說明Q-DELLA蛋白 能夠負向調(diào)控擬南芥植株對鎂脅迫的響應(yīng)。
[0056] 在正常鎂環(huán)境下，突變體（1. 93cm)與野生型（1. 85cm)都能正常生長，主根長度十 分相近，但是Q-DELLA的根毛比野生型長（Q: 0.93mm; WT: 0.06mm);然而，在高鎂環(huán)境下， 突變體（1.28cm)和野生型（0.86cm)的主根的伸長都受到了一定程度的抑制，根毛的生長 都受到了一定程度的促進（Q: 1.37mm; WT: 1.42mm)，但是，Q-DELLA受到的鎂毒害影響要 明顯小于野生型。隨后我們對正常鎂和高鎂環(huán)境下生長的野生型和突變體的根部伸長區(qū)細 胞做了觀察。在正常鎂環(huán)境下（LM)，Q-DELLA突變體的細胞（177. 46Mm)略長于野生型的細 胞（156. 76Mm);但在鎂毒害環(huán)境下，Q-DELLA突變體的細胞長度（144. 996Mm)大約是野生型 的細胞長度（96. 84Mm)的1. 5倍，與主根的差異是十分相近的，因此鎂毒害明顯通過抑制主 根伸長區(qū)細胞的長度來抑制根的伸長，而這種抑制能被突變體Q-DELLA部分解除。
[0057] 另外，在正常情況下，Q-DELLA和Ler的發(fā)芽速率差異不明顯，但鎂毒害明顯減緩 了擬南芥的發(fā)芽速率，在高鎂環(huán)境下，當有90%的種子發(fā)芽時，Q-DELLA大約需要3天的時 間，而野生型需要4天，Q-DELLA的發(fā)芽速率明顯快于野生型。鎂離子在葉綠素合成中扮 演著至關(guān)重要的角色，雖然在鎂毒害環(huán)境下，植物有充足的鎂離子來合成葉綠素，但是相對 于正常鎂環(huán)境（WT: 1. 18Pg/mg; Q: 1. 25Pg/mg)，野生型和Q-DELLA的葉綠素含量都有了 顯著地下降（WT: 0.29Pg/mg; Q: 0.82Pg/mg)，只是 Q-DELLA (0.82Pg/mg)下降的幅度明 顯小于野生型（0. 29Pg/mg)，在高鎂環(huán)境下，Q-DELLA葉綠素的含量是野生型的2. 83倍，這 可能是鎂毒害像其它滲透脅迫一樣，導致蛋白質(zhì)合成受阻，破壞了正常的葉綠素合成步驟。 Q-DELLA與野生型的這些性狀差異說明了 Q-DELLA能更好的適應(yīng)高鎂環(huán)境，減輕鎂毒害的 效應(yīng)。
[0058] 3、Q-DELLA能顯著調(diào)節(jié)離子的吸收效率及鎂離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄 Q-DELLA突變體能在一定程度上緩解鎂毒害。Q-DELLA突變體在一定程度上調(diào)節(jié)鎂離 子的吸收及其相關(guān)基因的表達來更好的適應(yīng)高鎂環(huán)境。Ler和Q-DELLA突變體在不同條件 下的鎂離子濃度，在LM條件下兩者之間鎂離子含量差異不顯著（WT: 2.30 (X 103 ppm/g)， Q: 2.31 (X103ppm/g));HM條件下，Ler和Q-DELLA突變體的鎂離子含量都有了顯著地增 加（WT: 6.45(X103 ppm/g), Q: 4.46(X103 ppm/g))，但是Ler中鎂離子的含量顯著高于 Q-DELLA突變體。
[0059] 另外，在高鎂環(huán)境下Zn和Ca的含量出現(xiàn)了大幅度的下降，但Q-DELLA突變體內(nèi) Zn (LM WT: 1.90(X103 ppm/g), Q: 2.26 (X 103 ppm/g) ; HM WT: 0.60(X103 ppm/g), Q: 1. 00(X103 ppm/g))和 Ca(LM WT: 9. 47(X103 ppm/g), Q: 10. 77 (X 103 ppm/g); HMWT: 7.43(X103 ppm/g); Q: 8.29(X103 ppm/g))的含量卻高于野生型，與鎂離子的含 量變化趨勢正好相反。而Fe(LMWT: 2.81(X103 ppm/g)，Q: 2.825 (X 103 ppm/g); HM WT: 3.44(X 103 ppm/g) ; Q: 3.52(X 103 ppm/g))和Μη(LMWT: 2.08(X 103 ppm/g)，Q: 2. 14 (X 103 ppm/g); HM WT: 2.54( X 103 ppm/g)，Q: 2.75( X 103 ppm/g))的含量也出現(xiàn) 了一定程度的增加。
[0060] 在鎂毒害條件下，Q-DELLA突變體中，與鎂離子運輸相關(guān)的10個基因的表達都出 現(xiàn)了不同程度的上調(diào)。而野生型基因的差異表達水平并不明顯。雖然在正常鎂環(huán)境下，除 了 AtMGT5, Q-DELLA突變體和野生型的鎂離子轉(zhuǎn)運基因的表達水平差異不明顯；但在高鎂 環(huán)境下，Q-DELLA突變體10個鎂離子轉(zhuǎn)運基因的表達水平顯著高于野生型。
[0061] 綜上可知，在鎂毒害環(huán)境下，Q-DELLA突變體能通過調(diào)控鎂離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表 達來改變鎂離子的吸收效率，從而能夠更好的適應(yīng)鎂毒害環(huán)境，說明Q-DELLA蛋白通過負 向調(diào)控鎂離子的轉(zhuǎn)運而參與擬南芥對鎂毒害的響應(yīng)。另一方面，這些說明建立的鎂毒害培 養(yǎng)體系在相關(guān)研究領(lǐng)域是可行的。
[0062] 4、DELLA蛋白在鎂毒害條件下調(diào)控淀粉的代謝 遇碘變藍是淀粉重要的定性指標，葉片淀粉含量越高，染色越深。隨著鎂離子濃度的 提高（0.05mM，1.5mM，20mM)，葉片染色越淺，淀粉含量越低。通過觀察不同擬南芥葉片 淀粉顏色的情況大致預測植物體內(nèi)鎂離子含量的多少。在正常鎂環(huán)境下Q-DELLA突變體 與野生型擬南芥葉片的顏色是十分相近的，淀粉的含量也大致相同（WT: 16.967um〇l/g; Q: 18. 252 umol/g)，而在高鎂環(huán)境下，Q-DELLA突變體與野生型的葉片顏色都變淺了，但 Q-DELLA突變體葉片的顏色還是明顯深于野生型，并且淀粉含量也明顯高于野生型（WT: 3.129umol/g; Q: 8.159umol/g)。另外，鹿糖的含量與淀粉的含量呈現(xiàn)了相同的趨勢。
[0063] 在鎂毒害條件下，與淀粉合成相關(guān)的關(guān)鍵基因（SS1，SS2，GBSS1，APL1，APL2) 的表達都有了一定程度的下調(diào)，而與淀粉降解相關(guān)的關(guān)鍵基因（ATAMY1，BAM1，BAM2)的表 達都有了一定程度的上調(diào)。但是在鎂毒害條件下，Q-DELLA突變體中淀粉合成相關(guān)基因的 表達都高于野生型，而與淀粉降解相關(guān)基因的表達都低于野生型。由此可知，在鎂毒害條件 下，擬南芥能通過DELLA蛋白調(diào)控淀粉的代謝。
[0064] 5、Q-DELLA減弱了鎂毒害下內(nèi)源ΑΒΑ的過度積累及調(diào)控相關(guān)基因的表達。
[0065] 鎂毒害與lMfflol外源ΑΒΑ對野生型擬南芥產(chǎn)生的表形十分相似，而DELLA突變體 能夠減輕這種傷毒害作用，Q-DELLA突變體通過調(diào)節(jié)ΑΒΑ信號的轉(zhuǎn)導來適應(yīng)鎂毒害的環(huán)境。 在正常鎂環(huán)境下Q-DELLA突變體ΑΒΑ的含量只是略低于野生型（Leaves WT: 366. 47pmol g1，Q: 331.25 pmol g1; Roots WT: 181. 37pmol g1，Q: 160.48 pmol g 〇 ;而在高緩 環(huán)境下，兩種材料ABA的含量都有所提高，但Q-DELLA突變體ABA的含量顯著低于野生型 (Leaves WT: 2757. 50pmol g \ Q: 1275.57 pmol g1; Roots WT: 1148. 98pmol g \ Q: 732. 23pmol g4)。在正常鎂環(huán)境下，在Q-DELLA突變體中，與ABA合成相關(guān)的基因其表達都 低于野生型，而ΑΒΑ不敏感性基因 ABI3, ABI4的表達量高于野生型。但是在高鎂環(huán)境下， Q-DELLA突變體所有與ΑΒΑ代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平都明顯低于野生型。另外，相對于正常 鎂環(huán)境，高鎂環(huán)境上調(diào)了除ΑΒΑ3之外其它基因的表達（ΑΒΑ1在Q中，ΑΒΙ5在Ler中有所下 調(diào)）。這些結(jié)果說明鎂毒害促進了內(nèi)源ΑΒΑ的積累，從而抑制了植株的生長發(fā)育，而DELLA 基因的突變減少了 ΑΒΑ的內(nèi)源積累，緩解了這種抑制作用。
[0066] 6、擬南芥通過ABA-ABI1-DELLA途徑來響應(yīng)鎂毒害 基因編碼的蛋白磷酸酶PP2C是ΑΒΑ信號傳導的負調(diào)控因子。ii7-7突變體是由 單堿基突變形成的ΑΒΑ不敏感突變體（Leung et al·，1994; Meyer et al·，1994)。在 高鎂環(huán)境下，Q-DELLA突變體和ii7-7突變體能緩解鎂毒害的傷害，減輕鎂毒害對根伸長 的抑制，在高鎂環(huán)境下加入lMmol的ΑΒΑ時，發(fā)現(xiàn)Q-DELLA突變體的主根的長度恢復到了 野生型在高鎂環(huán)境下的長度；而在lMfflol外源ΑΒΑ存在的條件下，突變體的根長比 Q-DELLA突變體的根長還要長。
[0067] 分別在正常鎂，高鎂，ΑΒΑ三種培養(yǎng)基上種植野生型Ler，Q-DELLA突變體、?-7 突變體，在高鎂環(huán)境下Q-DELLA突變體和ii-7突變體的根長（WT: 0.86cm; Q: 1.28cm; ?7_7 :1. 26cm);在lMmol ΑΒΑ條件下，?-7突變體的根長最長，Q-DELLA突變體次之， 野生型最短（WT: 0.89cm; Q: 1.33cm; 82cm);但三者在正常鎂環(huán)境下差異并不 明顯（WT: 1.85 cm; Q: 1.92cm; ?7_7 :1.80cm)。Q-DELLA 突變體和 ?_7 突變體能夠 緩解鎂毒害對主根的抑制，并且鎂毒害信號是通過ΑΒΑ傳導的，當ΑΒΑ的傳導出現(xiàn)問題時， 鎂毒害引起的主根生長抑制作用就會出現(xiàn)明顯的減弱。
[0068] 鎂毒害和外源ΑΒΑ都促進了根毛的生長，只是促進的程度發(fā)生差異。鎂毒害和 外源ΑΒΑ極其明顯的促進了 Ler根毛的生長（LM: 0.062; HM: 1.416mm; ABA: 1.44mm)， Q-DELLA突變體次之（LM: 0.93mm; HM: 1.37mm; ΑΒΑ: 1.43)，?-7 突變體最弱（LM: 0mm; HM: 0.81mm; ABA: 0.41mm)。該結(jié)果說明了鎂毒害引起的生長響應(yīng)是依賴ABI1通過ΑΒΑ 提高了 DELLA蛋白的功能而起作用的。這些結(jié)果說明，DELLA蛋白在擬南芥鎂毒害響應(yīng)中 具有與PP2C類似的作用，DELLA的功能與PP2C密切相關(guān)。
[0069] 7、鎂毒害和外源ΑΒΑ能調(diào)控DELLA蛋白的積累 鎂毒害和外源ΑΒΑ可以通過DELLA蛋白調(diào)控植物的生長。分別用28mM MgS04. 7H20和 20 μΜΑΒΑ處理了生長五天的轉(zhuǎn)基因擬南芥Ler (含有pRGA: GFP-RGA，幼苗24小時和2小 時，發(fā)現(xiàn)高濃度的鎂和外源ΑΒΑ都促進了 DELLA蛋白RGA在擬南芥根細胞核中的積累。然 后用10 μΜ的GA分別處理這些擬南芥幼苗1. 5小時，根細胞中的DELLA蛋白GFP-RGA逐漸 降級。但是用外源ΑΒΑ處理abi 1-1突變體幼苗時，并沒有發(fā)現(xiàn)DELLA蛋白GFP-RGA在根細 胞核中的表達（Achardetal·，2006)，PP2C是DELLA蛋白的上游調(diào)控因子，依賴ABI1的 ΑΒΑ途徑是鎂毒害條件下DELLA蛋白積累的重要途徑。
[0070] 本發(fā)明擬南芥的鎂毒害脅迫處理方法，通過在含有不同鎂離子濃度的改良MS培 養(yǎng)基上生長的野生型擬南芥葉色、株高、根長等形態(tài)差異的比較，建立了科學合理的鎂脅迫 擬南芥EMS突變體篩選體系。將28mM作為鎂毒害突變體的篩選濃度。依托該篩選體系篩 選性狀優(yōu)良的鎂脅迫EMS突變體。同時，該體系也為我們下步探究鎂脅迫特別是鎂毒害信 號傳導機制奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為未來農(nóng)業(yè)應(yīng)用高鎂土壤生產(chǎn)糧食奠定理論基石。
[0071] 上述實施僅用于解釋說明本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思，而非對本發(fā)明權(quán)利保護的限定，凡 利用此構(gòu)思對本發(fā)明進行非實質(zhì)性的改動，均應(yīng)落入本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種擬南芥的鎂毒害脅迫處理方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 培養(yǎng)基的配置： a、 正常鎂培養(yǎng)基：LM，1. 5 mM MgS04 · 7H20 ; b、 鎂毒害培養(yǎng)基：HM, 28 mM MgS04 · 7H20 ; c、 含有不同濃度鎂離子的培養(yǎng)基：在鎂培養(yǎng)基基礎(chǔ)上配置的含有不同濃度外源ABA 的培養(yǎng)基；其中添加 2.0mM NH4N03、lmM KH2P04、L9mM KN03、0.3mM CaCl2.2H20、5yM ΚΙ、 100 μ M H3B03、30 μ M ZnS04. 7H20、100 μ M MnS04. H20、1 μ M Na2Mo04. 2Η20、0· 1 μ M CoCl2. 6H20、 0· 1 μ Μ CuS04. 5Η20、100 μ Μ FeS04. 7Η20 或 100 μ Μ Na2EDTA. 2Η20 ; 將上述培養(yǎng)基用1Μ的NaOH將ΡΗ調(diào)節(jié)至5. 8,然后添加1%的瓊脂粉，將配置好的培養(yǎng) 基放在高壓滅菌鍋中115°C滅菌15分鐘； (2) 擬南芥的種植： A1 :取適量擬南芥種子，倒入滅菌處理的1. 5ml離心管中，加入70%乙醇渦旋振蕩 3min，吸除乙醇，然后，加入6% NaCIO潤旋振蕩8min，立即吸除，用無菌水清洗種子5遍，每 遍2min，加入1. 5ml無菌水靜置lOmin，吸除后再水洗2遍，種子表面消毒完成； A2 :用滅過菌的lml槍頭將種子根據(jù)需要均勻的點播在步驟（1)中的培養(yǎng)基上，將培養(yǎng) 皿置于無菌操作臺上吹干多余的水分，用Parafilm膜將培養(yǎng)皿封口后置于4°C冰箱中處理2 天； A3 :將培養(yǎng)皿置于22°C ±1°C，光強65uM m-2 s-1，16h光照/8h黑暗的條件下堅直放 置培養(yǎng)； (3) 鎂脅迫處理方法 將用NaCIO消毒后的擬南芥種子單粒成行種植在含有28mM Mg2+的鎂毒害培養(yǎng)基上，用 Parafilm膜將培養(yǎng)皿封口后置于4°C冰箱中處理2天；然后將培養(yǎng)皿放置在22°C ± 1°C，光 強65uM πΓ2 光照/8h黑暗的溫室中堅直培養(yǎng)；在鎂脅迫突變體篩選過程中，以Col-0 為背景，通過對鎂脅迫培養(yǎng)基上生長28天的EMS突變株的形態(tài)特征觀察，篩選性狀優(yōu)良的 突變株，移栽到含有全部養(yǎng)分的蛭石中正常培養(yǎng)，直至成熟接種子。
【文檔編號】C12N15/01GK104099318SQ201410261206
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】郭萬里, 叢悅璽, 梁宗鎖, 楊東風, 呂洪飛, 陳紹寧, 祁哲晨 申請人:浙江理工大學