一種消化酶組合物及其制劑、應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細胞分離技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種消化酶組合物及其制劑、應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細胞（MesenchymalStemCells，MSCs)是一群非造血功能的，主要存在 與結(jié)締組織和器官間質(zhì)中的一類同種多能干細胞。體外培養(yǎng)的實驗研宄發(fā)現(xiàn)，在不同的誘 導條件下，胎盤MSC可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和神經(jīng)元，并表達特異性標志， 如osteopontin、PPAR-y2、collagenII、NSE等，誘導體系與骨髓MSC沒有太大的差別，表 明胎盤MSC同樣具有廣泛的分化潛能。近年來，已有具有干/祖細胞特征的間充質(zhì)細胞自骨 髓、外周血、密質(zhì)骨、軟骨、肌肉等組織中分離出來，這些組織的一個共同特征就是來源于胚 胎發(fā)育期的中胚層，胎盤由滋養(yǎng)細胞及大量起源于胚外中胚層的間充質(zhì)和血管共同組成， 提示胎盤中存在間充質(zhì)干細胞（MSC)成分?？茖W家們經(jīng)過證實確定胎盤中含有大量豐富的 MSCs。而且，胎盤MSC與骨髓MSC在細胞形態(tài)，細胞表面標志表達和基因表達模式上非常相 似。由于胎盤MSCs的數(shù)量很大，在今后的試驗和臨床應用上，胎盤已經(jīng)成為一種無倫理學 爭議和簡便獲得的MSCs的新來源。
[0003]MSCs的分離一般采用胰蛋白酶消化，具體方法為：取新鮮健康臍帶，用PBS沖洗干 凈后，用剪刀鑷子剔去血管，剝出里面的華氏膠組織，將所得組織充分剪碎至1mm3大小，加 入a-MEM培養(yǎng)液置于37°C，5%的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10%FBS，100U/mL青霉素， 100U/mL鏈霉素。臍帶組織培養(yǎng)5-7天后，可見有部分細胞從組織塊周圍爬出，形態(tài)呈細小 的梭形，一周后，細胞開始迅速增殖，形成大小不等的細胞集落，待細胞長滿后，用〇. 25%胰 蛋白酶消化傳代。
[0004] 從胎盤組織中分離MSC還有采取膠原酶消化組織塊的辦法。李鐸于2011年報道 了應用膠原酶消化法對人臍帶間充質(zhì)干細胞進行分離培養(yǎng)。
[0005]CN104284976A中采用胰蛋白酶和DNaseI對胎盤干細胞進行了分離培養(yǎng)，具體 為：在含有25mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES)的平衡鹽溶液（HBSS)中，將35至40g胎盤 絨毛組織用0. 15%胰蛋白酶和0. 02%DNaseI在37°C下水浴消化30min，重復3次。在最 后兩次消化中，靜置組織碎片，用200uM孔徑尼龍篩網(wǎng)過濾上清液，至多45mL細胞懸液分層 在5mLFCS血清上，室溫1000Xg離心10min。
[0006] 又如文獻（姚旺祥等.兔胎盤源性間充質(zhì)干祖細胞的分離方法比較.生物醫(yī)學工 程與臨床.2007年02期）采用II型膠原酶+DNaseI對胎盤組織進行消化。
[0007] 但上述方法存在細胞收獲率低或者細胞活力低的問題。因此，提供一種細胞收獲 率高、細胞活力高的胎盤間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種消化酶組合物及其制劑、應用。本發(fā)明提供的消化酶 組合物能夠高效地從胎盤組織塊中分離MSC，提高了胎盤MSC的分離效率；本發(fā)明提供的消 化酶組合物能夠減少對細胞的損傷，從而使細胞活率高，同時具有較強的增殖能力，提高細 胞收獲量。
[0009] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明提供了一種消化酶組合物，包括膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶。
[0011] 本發(fā)明使用膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶聯(lián)合消化胎盤組織，使得消化 酶組合物產(chǎn)生了協(xié)同增效作用，提高了細胞的收獲量及活率，減少了對細胞的損傷，提高了 增殖速率。
[0012] 作為優(yōu)選，膠原酶I、中性蛋白酶與脫氧核糖核酸酶體積比為（0. 1~10) : (0. 1~ 10):(0? 1 ~10)〇
[0013] 優(yōu)選地，膠原酶I、中性蛋白酶與脫氧核糖核酸酶體積比為1 :〇. 5 :2。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種消化酶混合液，包括本發(fā)明提供的消化酶組合物和PBS ;該 消化酶組合物包括膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶；作為優(yōu)選，膠原酶I、中性蛋白 酶與脫氧核糖核酸酶的體積比為（〇? 1~10) : (〇? 1~10) : (〇? 1~10);優(yōu)選地，膠原酶I、 中性蛋白酶與脫氧核糖核酸酶體積比為1 :〇. 5 :2。
[0015] 作為優(yōu)選，在消化酶混合液中，膠原酶I的濃度為0. 1~10yg/mL，中性蛋白酶的 濃度為〇. 1~10yg/mL，脫氧核糖核酸酶的濃度為0. 1~10yg/mL。
[0016] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，膠原酶I的規(guī)格為125⑶U/mg。
[0017] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，中性蛋白酶的規(guī)格為50000U/g。
[0018] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，脫氧核糖核酸酶的規(guī)格2000Kunitzunits/mg。
[0019] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，在消化酶混合液中，膠原酶I的濃度為1yg/mL， 中性蛋白酶的濃度為〇. 5yg/mL，脫氧核糖核酸酶的濃度為2yg/mL。
[0020] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，在消化酶混合液中，膠原酶I的濃度為0. 1yg/ mL，中性蛋白酶的濃度為1yg/mL，脫氧核糖核酸酶的濃度為10yg/mL。
[0021]在本發(fā)明提供的另一些實施例中，在消化酶混合液中，膠原酶I的濃度為5yg/mL，中性蛋白酶的濃度為10yg/mL，脫氧核糖核酸酶的濃度為0. 1yg/mL。
[0022] 在本發(fā)明提供的另一些實施例中，在消化酶混合液中，膠原酶I的濃度為10yg/ mL，中性蛋白酶的濃度為0. 1yg/mL，脫氧核糖核酸酶的濃度為1yg/mL。
[0023] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明消化酶組合物或消化酶混合液在分離間充質(zhì)干細胞中的 應用；該消化酶組合物包括膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶；作為優(yōu)選，膠原酶I、 中性蛋白酶與脫氧核糖核酸酶的體積比為（〇. 1~10) :(〇. 1~10) :(〇. 1~10);優(yōu)選地， 膠原酶I、中性蛋白酶與脫氧核糖核酸酶的體積比為1 :〇. 5 :2;
[0024] 本發(fā)明消化酶混合液包括本發(fā)明消化酶組合物和PBS;作為優(yōu)選，在消化酶混合 液中，膠原酶I的濃度為0. 1~10yg/mL，中性蛋白酶的濃度為0. 1~10yg/mL，脫氧核糖 核酸酶的濃度為〇. 1~10ug/mL。
[0025] 在本發(fā)明提供的一些實施例中，間充質(zhì)干細胞為胎盤間充質(zhì)干細胞。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種分離胎盤間充質(zhì)干細胞的方法，采用本發(fā)明消化酶組合物， 或者采用本發(fā)明消化酶混合液消化胎盤組織。
[0027] 作為優(yōu)選，消化的溫度為36~38°C。
[0028] 優(yōu)選地，消化的溫度為37°C。
[0029] 作為優(yōu)選，消化的時間為10~60min。
[0030] 優(yōu)選地，消化的時間為30min。
[0031] 本發(fā)明提供了一種消化酶組合物及其制劑、應用。該消化酶組合物包括膠原酶I、 中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：
[0032] 本發(fā)明提供的消化酶組合物能夠高效地從胎盤組織塊中分離MSC，提高了胎盤 MSC的分離效率；
[0033] 本發(fā)明提供的消化酶組合物能夠減少對細胞的損傷，從而使細胞活率高，同時具 有較強的增殖能力，提高細胞收獲量。
【附圖說明】
[0034] 圖1示分離獲得的MSCs的形態(tài)（P1代）；A(40倍）和B(100倍）示用消化酶混合 液1獲得的人MSCs，并用Gimsa染色觀察其細胞形態(tài)；C(40倍）和D(100倍）用消化酶混 合液2獲得的人MSCs并用Gimsa染色觀察其細胞形態(tài)；
[0035] 圖2示流式細胞術(shù)檢測胎盤貼壁細胞表型，表面抗原包括⑶14、⑶29、⑶34、⑶44、 ⑶45、⑶73、⑶90、⑶105 ;其中2-1示消化酶混合液1消化獲得細胞表型；2-2示消化酶混 合液2消化獲得細胞表型；
[0036] 圖3示兩種消化酶所獲得的細胞收獲量。
【具體實施方式】
[0037] 本發(fā)明公開了一種消化酶組合物及其制劑、應用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文 內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人 員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實 施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法 和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。
[0038] 本發(fā)明提供的消化酶組合物及其制劑、應用中所用試劑、儀器均可由市場購得。其 中，膠原酶I的規(guī)格為125CDU/mg，中性蛋白酶的規(guī)格為50000U/g，脫氧核糖核酸酶的規(guī)格 為2000Kunitzunits/mg，胰蛋白酶的規(guī)格為1800U/g，II型膠原酶的規(guī)格為125CDU/mg。 [0039] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0040] 實施例1消化酶混合液的制備 [0041] 消化酶混合液組成如下：
【主權(quán)項】
1. 一種消化酶組合物，其特征在于，包括膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的消化酶組合物，其特征在于，所述膠原酶I、所述中性蛋白酶 與所述脫氧核糖核酸酶體積比為（〇. 1~10) : (〇. 1~10) : (〇. 1~10)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的消化酶組合物，其特征在于，所述膠原酶I、所述中性蛋白酶 與所述脫氧核糖核酸酶體積比為1 :〇. 5 :2。
4. 一種消化酶混合液，其特征在于，包括如權(quán)利要求1至3中任一項所述消化酶組合物 和PBS。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的消化酶混合液，其特征在于，在消化酶混合液中，所述膠原酶 I的濃度為〇. 1~10yg/mL，所述中性蛋白酶的濃度為0. 1~10yg/mL，所述脫氧核糖核酸 酶的濃度為〇. 1~10Ug/mL。
6. 如權(quán)利要求1至3中任一項所述消化酶組合物或如權(quán)利要求4或5所述消化酶混合 液在分離間充質(zhì)干細胞中的應用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞為胎盤間充質(zhì)干細胞。
8. -種分離胎盤間充質(zhì)干細胞的方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求1至3中任一項所 述消化酶組合物，或者采用如權(quán)利要求4或5所述消化酶混合液消化胎盤組織。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述消化的溫度為36~38°C。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述消化的時間為10~60min。
【專利摘要】本發(fā)明涉及干細胞分離技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種消化酶組合物及其制劑、應用。該消化酶組合物包括膠原酶I、中性蛋白酶和脫氧核糖核酸酶。本發(fā)明提供的消化酶組合物能夠高效地從胎盤組織塊中分離MSC，提高了胎盤MSC的分離效率；本發(fā)明提供的消化酶組合物能夠減少對細胞的損傷，從而使細胞活率高，同時具有較強的增殖能力，提高細胞收獲量。
【IPC分類】C12N5-0775, C12N9-22, C12N9-50
【公開號】CN104818264
【申請?zhí)枴緾N201510288438
【發(fā)明人】葛嘯虎, 陳海佳, 王一飛, 盧瑞珊, 王小燕, 李平, 馬巖巖
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年5月29日