一種噴花防治灰霉病的生物制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種防治灰霉病的生物制劑，屬于農(nóng)業(yè)生物農(nóng)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] ε-聚賴氨酸是由二三十個(gè)賴氨酸分子在α-羧基和ε-氨基之間形成酰胺鍵后連接 而成的多聚體，是一種均聚氨基酸，多年來的廣泛研究證實(shí)其具有抑菌功效，這一特性使其 作為防腐劑在食品防腐領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。
[0003] 蔬菜灰霉病菌侵染果實(shí)主要依賴殘留的花瓣及柱頭，推廣摘除花瓣和在防落素噴 花液中加入具有良好防效的ε-聚賴氨酸，是阻斷侵染的有效途徑。
[0004] 近年來的研究證實(shí)ε-聚賴氨酸對(duì)多種霉菌的生長具有一定的抑制作用，在平板對(duì) 峙中單獨(dú)使用ε_(tái)聚賴氨酸表現(xiàn)出較為理想的抑菌率，因此也有若干研究嘗試將其應(yīng)用于田 間各種灰霉病的防治，但試驗(yàn)顯示應(yīng)用于農(nóng)作物后其防效并未達(dá)到理想效果。為此本領(lǐng)域 研發(fā)了若干復(fù)合制劑，一種研究方向是將其與多種生物堿匹配，借助生物堿的抗病原體和 殺滅真菌效應(yīng)提高ε_(tái)聚賴氨酸的防效，另一種研究方向是將ε_(tái)聚賴氨酸作為輔料，搭配傳 統(tǒng)上具有良好殺滅真菌活性的銅鹽以提高其殺滅真菌的效果。
[0005] 然而，上述兩個(gè)方向研究成果均顯示，即使考慮到上述的協(xié)同作用，其用來防治番 茄灰霉病的防效也僅為80 %左右，尚有巨大的改進(jìn)空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 申請(qǐng)人在實(shí)際種植中深入研究了 ε_(tái)聚賴氨酸防治灰霉病的效果，通過在基因表達(dá) 層次上的分子生物學(xué)作用機(jī)制的深入研究，將其添加到植株噴花的防落素中，或者將其與 有機(jī)化合物(殼聚糖)或無機(jī)化合物(硫酸亞鐵)進(jìn)行復(fù)配提高對(duì)灰霉病的防治效果。
[0007] 具體地說，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種噴花防治灰霉病的生物制劑，這些組合物均包含ε-聚賴氨酸，組成為如下之 一:①以ε_(tái)聚賴氨酸為主劑，添加到植株噴花的防落素中；②以ε-聚賴氨酸為主劑，助劑分 別選用有機(jī)化合物:殼聚糖，或無機(jī)化合物:硫酸亞鐵。
[0009] 由于生物化學(xué)作用機(jī)制的差異，上述兩種組成形式適用性各有差異，組合形式① 適合噴花;組合形式②適合噴施到植物葉片。
[0010]在上述公開的組合形式中，主劑、助劑的用量可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整，通常二者 的用量比為1:1-10范圍內(nèi)。
[0011] 根據(jù)化合物類型的不同，可具體調(diào)整用量，優(yōu)選為如下用量比例：
[0012] 以ε-聚賴氨酸為主劑，添加到植株噴花的防落素中，ε-聚賴氨酸與防落素的用量 比為1:1-2,優(yōu)選1: 1。
[0013] 以ε_(tái)聚賴氨酸為主劑，助劑選用有機(jī)化合物:殼聚糖，其中主劑與助劑的用量比為 1:1-2,優(yōu)選分別為1:2。
[0014]以ε-聚賴氨酸為主劑，助劑選用無機(jī)化合物:硫酸亞鐵，其中主劑與助劑的用量比 為1:4-10,優(yōu)選分別為1:4.44。
[0015] 以ε-聚賴氨酸為主劑，添加到植株噴花的防落素中，用這種復(fù)合藥物對(duì)番茄植株 進(jìn)行噴花處理，可以增加植株的開花率，從而減少病果數(shù)。
[0016] 以ε-聚賴氨酸為主劑，有機(jī)化合物或無機(jī)化合物為助劑，能夠顯著增強(qiáng)ε-聚賴氨 酸對(duì)番茄植株上抗病相關(guān)酶或蛋白基因的誘導(dǎo)，如β-1，3_葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、PR蛋白等， 使基因表達(dá)量在不同的時(shí)間段發(fā)生上調(diào)，這些誘導(dǎo)基因表達(dá)增強(qiáng)了植株對(duì)灰霉病的抗性， 從而提高了灰霉病的防治效果。
[0017] 申請(qǐng)人深入研究了不同藥劑和ε-聚賴氨酸的協(xié)同作用，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于其它成分，將 ε_(tái)聚賴氨酸添加到植株噴花的防落素中，對(duì)灰霉病實(shí)現(xiàn)完全的防治效果，因此本發(fā)明的防 治灰霉病的復(fù)合藥物組合物優(yōu)先選用ε_(tái)聚賴氨酸+防落素。
[0018] 在本發(fā)明中，所稱的ε-聚賴氨酸，指的是交聯(lián)和非交聯(lián)的賴氨酸聚合物或低聚物， 優(yōu)選采用具有3600~4300g/mol平均摩爾質(zhì)量(重均）的ε-聚賴氨酸。組成ε-聚賴氨酸的基 本賴氨酸單元的氨基可以由α和/或ε位連接，通常是ε位連接。
[0019] 在本發(fā)明中，所稱的灰霉病是一種常見植物多發(fā)真菌性病害，多見于番茄、黃瓜和 草莓等果蔬作物，尤其是番茄和黃瓜。
[0020] 在本發(fā)明中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解在將組合物具體應(yīng)用時(shí)，需要將其溶解于 溶劑中以合理的濃度進(jìn)行噴施，最優(yōu)選的溶劑是水，然而其它芳香族溶劑、醇類、酮類等也 是可用的，在配置好的噴施溶液中，溶劑含量通常是10~95%，根據(jù)植株的種植密度，按照 30~50g/畝的用量進(jìn)行噴施。
[0021] 在本發(fā)明中，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解為了便于產(chǎn)品的銷售和生產(chǎn)，上述組合物 可根據(jù)需要制備為相應(yīng)的制劑類型，如水溶性顆粒、乳液、懸浮液、水分散性顆粒、水分散性 和水溶性粉末等，這些制劑類型都是農(nóng)藥上常見的類型，此處不予贅述。
[0022]申請(qǐng)人進(jìn)行試驗(yàn)顯示，本發(fā)明的復(fù)合藥物組合物對(duì)防治灰霉病具有理想效果，顯 示出ε_(tái)聚賴氨酸產(chǎn)生了顯著地協(xié)同增效效應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]在下述實(shí)施中，申請(qǐng)人提供了本發(fā)明技術(shù)方案的若干具體實(shí)現(xiàn)，以說明本發(fā)明的 復(fù)合藥物組合物的效果。如下所提供的實(shí)施僅為示意性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解和掌握 本發(fā)明實(shí)質(zhì)精神的基礎(chǔ)上所進(jìn)行的調(diào)整、替換等依舊屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 實(shí)施例1
[0025]將聚賴氨酸與防落素按照1:1的質(zhì)量比混合，然后加入400份水中攪拌混合均 勻。
[0026] 實(shí)施例2
[0027]將聚賴氨酸與殼聚糖按照1:2的質(zhì)量比混合，然后加入800份水中攪拌混合均 勻。
[0028] 實(shí)施例3
[0029]將ε_(tái)聚賴氨酸與硫酸亞鐵按照1:4.44的質(zhì)量比混合，然后加入800份水中攪拌混 合均勻。
[0030]在上述實(shí)施例中，所用的ε-聚賴氨酸的平均摩爾質(zhì)量(重均)為3600~4300g/mol。
[0031] 為了研究ε-聚賴氨酸+防落素防治灰霉病的效果，申請(qǐng)人進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。
[0032] 以ε-聚賴氨酸為主劑，添加到植株噴花的防落素中進(jìn)行噴花試驗(yàn)，調(diào)查防落素+ε-聚賴氨酸防治灰霉病的效果。在番茄植株的花期按照復(fù)合藥劑實(shí)施例1的比例噴花，以單施 防落素和防落素+化學(xué)農(nóng)藥為對(duì)照，在植株的第一層果和第二層果期分別調(diào)查病果數(shù)和總 果數(shù)。調(diào)查結(jié)果如下表1所示：
[0033] 表1:防落素 +ε-聚賴氨酸防治灰霉病的效果
[0034]
[0036]第一層果的防治率:防落素 +ε_(tái)聚賴氨酸100% ;防落素+化學(xué)農(nóng)藥100%。
[0037]第二層果的防治率:防落素+ε_(tái)聚賴氨酸98.40% ;防落素+化學(xué)農(nóng)藥97.50%。
[0038]為了研究ε_(tái)聚賴氨酸和有機(jī)化合物或無機(jī)化合物對(duì)番茄植株上抗病相關(guān)酶或蛋 白基因的誘導(dǎo)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究和β-1，3_葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、PR蛋白相關(guān) 基因的表達(dá)量在不同時(shí)間段的變化。
[0039]首先提取番茄葉片的總RNA，并且檢測(cè)其純度、濃度和完整性，然后合成和檢測(cè)第 一鏈cDNA，合成引物，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各基因的表達(dá)量變化。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理， A:單施實(shí)施例2-3復(fù)合藥劑;B:噴施實(shí)施例2-3復(fù)合藥劑，誘導(dǎo)3天后，接種番茄灰霉菌;C:單 接番茄灰霉菌孢子懸浮液。
[0040]試驗(yàn)結(jié)果表明，噴施ε-聚賴氨酸和有機(jī)化合物或無機(jī)化合物，誘導(dǎo)植物葉片3天 后，噴施病原菌，可以使番前葉片上的Glucanase A，Glucanase B，Chitinase3，Chitinase 9和PRlbl基因均在36h時(shí)明顯上調(diào)。而單施復(fù)合藥劑或者單施病原菌孢子懸浮液對(duì)這些基 因表達(dá)量的影響不大，說明實(shí)施例2-3復(fù)合藥劑能夠誘導(dǎo)番茄葉片抗病性，通過誘導(dǎo)抗性提 高對(duì)番茄灰霉病的防治效果。
[0041 ]為了研究ε-聚賴氨酸和有機(jī)化合物或無機(jī)化合物對(duì)番茄植株灰霉病的防治效果， 首先進(jìn)行的是平板抑菌試驗(yàn)，采用的試驗(yàn)方法為體外抑菌活性試驗(yàn)法。
[0042] 取實(shí)施例2-3的藥物組合物，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，制成折合ε-聚賴氨酸濃度為 10、5、2.5、1.25、0.625、0.25、0. lg/L的PDA平板，并設(shè)無菌水為空白對(duì)照，陽性對(duì)照80 %腐 霉利1000倍稀釋液按上述相同稀釋濃度制成含藥PDA平板。用直徑為4_的打孔器在長有灰 葡萄孢菌的PDA平板的邊緣打取菌餅，將菌餅接種到上述含藥平板中。將平板置于25°C保溫 培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h。用十字交叉法測(cè)定菌落凈生長直徑，計(jì)算抑制率。
[0043] 抑制率=(空白對(duì)照菌落凈生長直徑-含藥的菌落凈生長直徑)/空白對(duì)照菌落凈 生長直徑XI00 %。
[0044] 試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明組合物對(duì)灰葡萄孢菌的生長均有強(qiáng)烈抑制作用，在濃度為 不低于0.25g/L情況下表現(xiàn)出提取物對(duì)灰葡萄孢菌極為顯著的抑菌效果。在0.25g/L的濃度 下，實(shí)施例2-3對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率分別為91.63 %和91.04%，陽性對(duì)照的抑菌率為 51.56%〇
[0045] 在上述基礎(chǔ)上，申請(qǐng)人進(jìn)行了盆栽防效試驗(yàn)，試驗(yàn)用藥前選擇長勢(shì)一致盆栽番茄 苗，用油性記號(hào)筆寫上標(biāo)簽編號(hào)、插入盆栽盆內(nèi)，按序排放，供試驗(yàn)用。
[0046]將實(shí)施例2-3的藥物組合物稀釋到0.25g/L采用噴霧法對(duì)上述苗進(jìn)行噴藥，噴藥后 在溫室中晾干。
[0047]在排列整齊的番茄植株真葉表面均勻噴霧接種灰葡萄孢菌孢子懸浮液，每瓷盤 (40盆苗)噴菌液30ml左右，在瓷盤上罩上透明塑料保濕罩，并小心移至人工氣候箱內(nèi)，保持 相對(duì)濕度100%，溫度為20°C，24小時(shí)后去塑料保濕罩，保持溫度20°C，濕度85%以上（人工 氣候箱內(nèi)光照時(shí)間：黑暗時(shí)間= 1:1)，五天后調(diào)查，采用如下表2的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行防治效果 評(píng)價(jià)：
[0048] 表2:分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
[0049]
[0050] 其防治率分別為85.49%和76.38%。陽性對(duì)照的防治率為70.00%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種噴花防治灰霉病的生物制劑，其特征在于包含ε-聚賴氨酸，組成為如下之一:① 以ε_(tái)聚賴氨酸為主劑，添加到植株噴花的防落素中；②以ε-聚賴氨酸為主劑，助劑分別選用 有機(jī)化合物:殼聚糖，或無機(jī)化合物:硫酸亞鐵。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的生物制劑，其特征在于主劑為ε_(tái)聚賴氨酸，添加到植株噴花的防落 素中，ε-聚賴氨酸與防落素的用量比為1: 1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的生物制劑，其特征在于助劑為殼聚糖，主劑與助劑的用量比為1:2。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的生物制劑，其特征在于助劑為硫酸亞鐵，主劑與助劑的用量比為1: 4.44〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種噴花防治灰霉病的生物制劑，包含ε-聚賴氨酸，組成為如下之一：①以ε-聚賴氨酸為主劑，添加到植株噴花的防落素中；②以ε-聚賴氨酸為主劑，助劑分別選用有機(jī)化合物：殼聚糖，或無機(jī)化合物：硫酸亞鐵。本發(fā)明公開的生物制劑的主劑與助劑之間具有顯著的協(xié)同增效作用，能有效增強(qiáng)植株果實(shí)和葉片對(duì)灰霉病的抗性和防治效果。
【IPC分類】A01N37/46, A01N43/16, A01P3/00, A01N59/16, A01N39/04
【公開號(hào)】CN105532663
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610096437
【發(fā)明人】馬青, 王陽, 王蘭, 孫廣正, 上官妮妮, 趙新貝
【申請(qǐng)人】西北農(nóng)林科技大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年2月22日