一種氣微菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種氣微菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氣微菌屬由 Miller 等在 1991 年建立，模式種為 NRRL Β-3381τ。到現(xiàn)在為止，氣微菌屬共包括11個(gè)種，分離自土壤、空氣、海洋和牧草等環(huán)境。2005 年，由Yoon等對(duì)氣微菌屬的相關(guān)特性做了修正。好氧生長(zhǎng)，不產(chǎn)芽孢，細(xì)胞呈桿狀或球狀， 中溫，主要的脂肪酸為10-甲基C18:0，C16:0，C 18:1〇9c和（或）C16:Q2-OH。氣微菌屬G+C 含量范圍為70. 6~73mol%〇
[0003] 多相分類的概念最初由Colwell于1970年提出，是指利用微生物多種不同的信 息，包括表型的、基因型的和系統(tǒng)發(fā)育的信息，綜合起來研宄微生物分類和系統(tǒng)進(jìn)化的過 程。其中DNA同源性分析是確定正確的分類地位的最直接的方法，而DNA-DNA雜交可以在 總體水平上研宄微生物間的關(guān)系，用于種水平上的分類學(xué)研宄。1987年，國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)委 員會(huì)（International Committee on Systematic Bacteriology, ICSB)規(guī)定，DNA 同源性 多70%為細(xì)菌種的界限。
[0004] 氣微菌屬的很多微生物可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如酶、抗菌物質(zhì)、絮凝劑以及牛 磺膽酸，因此在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種氣微菌，該氣微菌為SEQ ID NO. 1所示的堿基序 列。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供該氣微菌在液體發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶和酯酶中的應(yīng)用。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種氣微菌，該菌株的保藏號(hào)為CGMCC No. 9738。
[0008] -種上述的氣微菌的培養(yǎng)方法，其特征在于該方法是將氣微菌YS17 CGMCC No. 9738接種于培養(yǎng)基中，在15-50°C，pH5. 5-12. 0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0009] 上述最適培養(yǎng)溫度為30-37 °C。
[0010] 上述最適 pH 為 7. 0-8. 0。
[0011] 上述的培養(yǎng)的培養(yǎng)基中還包括質(zhì)量百分比濃度不超過11%的NaCl。
[0012] 上述的培養(yǎng)在需氧條件下進(jìn)行。
[0013] 一種根據(jù)上述的氣微菌在液體發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶和酯酶中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明所述的培養(yǎng)可以是各種微生物的培養(yǎng)方式，比如液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、半固 體培養(yǎng)等，可以是搖床培養(yǎng)，也可以是發(fā)酵罐深層發(fā)酵，優(yōu)選的搖床培養(yǎng)。
[0015] 本發(fā)明所述的培養(yǎng)的接種量為常規(guī)，優(yōu)選2%，所述百分比為體積百分比。
[0016] 本發(fā)明所述的培養(yǎng)基為氣微菌常規(guī)培養(yǎng)基，優(yōu)選是TYB培養(yǎng)基。
[0017] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0018] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0019] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明提供了氣微菌屬的一個(gè)新種，該菌株的分類 地位是，依照國(guó)際細(xì)菌系統(tǒng)分類委員會(huì)的命名方法，欲將該種命名為 caffieBiae sp.nov.。該新種的發(fā)現(xiàn)和利用豐富了我們的可利用微生物資 源，對(duì)我們以后更好地利用氣微菌做出了一定的貢獻(xiàn)。本發(fā)明的氣微菌YS17,可提取酯酶和 蛋白酶，在食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)具有有廣泛應(yīng)用。
[0020] 生物材料保藏信息 本發(fā)明的氣微菌YS17,已于2014年9月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生 物研宄所，郵編：1〇〇1〇1。該菌株的保藏編號(hào)為：CGMCC No.9738。該菌株的分類命名是氣微 菌乂a?sp.，名稱為 YS17。
【附圖說明】
[0021] 圖1顯示本發(fā)明氣微菌新種菌株YS17的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。本發(fā)明中所述的室溫是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。
[0023] Jeroffiicro辦ia? e/yiAre應(yīng)DSM 8599τ購自德國(guó)微生物菌種保藏中心， Aeromicrobium alkaliterrae 為W Aeromicrobium ginsengisoli 14732? 自曰本微生物菌種保藏中心。
[0024] 實(shí)施例1、本發(fā)明新菌株YS17的分離制備 取普洱熟茶浸出液，將其稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)5-6天，挑取單菌落， 然后劃線純化得到。
[0025] 將其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，其保藏編 號(hào)為 CGMCC No. 9738。
[0026] 實(shí)施例2、本發(fā)明新菌株YS17的表觀特征 1.菌落特征 取菌株YS17的單菌落，轉(zhuǎn)接到TYB固體培養(yǎng)基(瓊脂）上，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h、36h和48h，分別觀察其菌落的大小、顏色、邊緣、凸起、光滑度、粘性、透明度等特點(diǎn)。結(jié) 果顯示，菌株YS17在TYB固體培養(yǎng)基上形成邊緣整齊，光滑，濕潤(rùn)，不透明，黃色的菌落，直 徑約1mm。
[0027] 2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 細(xì)胞為短桿，頂端圓鈍；革蘭氏染色陽性；細(xì)胞菌體大小為〇. 3-0. 5 μ mXO. 9-1. 6 μ m， 單生。
[0028] 實(shí)施例3、本發(fā)明新菌株YS17的生長(zhǎng)特性 挑取在TYC固體培養(yǎng)基(瓊脂)上培養(yǎng)24 h的新鮮培養(yǎng)物，接種到TYB液體培養(yǎng)基，37°C 搖床培養(yǎng)20~24h，作為種子。
[0029] 液體TYB培養(yǎng)基的組成（/L):胰蛋白胨15g，NaCl 5g，大豆蛋白胨5g，蒸餾水定容 至 1000 ml0
[0030] L生長(zhǎng)溫度： 將所培養(yǎng)的YS17種子按2%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接新鮮的無菌接種TYB (液體培養(yǎng)基中，混 勻。分別置于 4°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、37°C、40°C、45°C、50°C和 60°C 的水浴培養(yǎng)， 每個(gè)溫度梯度做三個(gè)平行，分別在24 h和48 h時(shí)測(cè)定其生長(zhǎng)情況。得到菌株YS17生長(zhǎng)溫 度范圍為15~50°C，最適溫度30~37°C。
[0031] 2.生長(zhǎng)NaCl耐受性 所培養(yǎng)的YS17種子按2%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接氯化鈉濃度分別為0. 0%、2. 0%、 5.0%、7.0%、9%、10.0%、11.0%和12.0%的了￥8培養(yǎng)基，30°〇培養(yǎng)，分別于24 11和48 11的 生長(zhǎng)狀態(tài)做記錄。結(jié)果顯示菌株YS17的NaCl耐受性為11%。
[0032] 3.生長(zhǎng)pH范圍 用無菌的lmol/L HCl和lmol/L NaOH將滅好菌的TYB培養(yǎng)基調(diào)至pH值分別為3. 0、 4· 0、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、8· 0、8· 5、9· 0、10· 0,將所培養(yǎng)的 YS17 種子按 2% 接種量接入， 30°C培養(yǎng)，分別于24 h和48 h的生長(zhǎng)狀態(tài)做記錄。得到菌株YS17生長(zhǎng)的pH范圍為 5. 5~12· 0,最適 pH 為 7. 0~8· 0。
[0033] 實(shí)施例4、本發(fā)明新菌株YS17的生理生化特性 利用API ZYM和API20E鑒定系統(tǒng)（生產(chǎn)廠商：bioMe' rieux)及常規(guī)的生理生化測(cè)定 方法(東秀珠，蔡妙英等，2001)對(duì)菌株YS17及相關(guān)的同屬菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定。
[0034] 菌株YS7的主要生理生化特征：好氧生長(zhǎng)；接觸酶陽性；核酸酶陰性；β -半乳糖 苷酶陰性，精氨酸雙水解酶陰性，賴氨酸脫羧酶陰性，鳥氨酸脫羧酶陰性，脲酶陰性，酯酶 (C4)陽性，類脂酯酶（C8)陽性，胰凝乳蛋白酶陽性，不產(chǎn)生吲噪，VP反應(yīng)陽性，水解Tween 60,不水解七葉靈；不液化明膠；不水解酪蛋白；不水解淀粉；還原硝酸鹽；能利用葡萄糖、 甘油、蔗糖、、果糖、海藻糖、L-谷氨酸等作為碳源；不利用阿拉伯糖、乳糖、鼠李糖、木糖、甲 酸、纖維二糖、延胡索酸、檸檬酸鹽、L-鳥氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-丙 氨酸、DL-天冬酰胺、甘氨酸、賴氨酸與組氨酸等底物。
[0035] 且菌株YS17在吲哚產(chǎn)生，胰凝乳蛋白酶活性及硝酸鹽還原等方面與同源性接近 Aeromicrobium erythreum DSM 8599T, Aeromicrobium alkaliterrae JCM 13518τ 和 Jeroffiicro辦ia? JCM 14732τ具有明顯差異。
[0036] 實(shí)施例5、本發(fā)明新菌株YS17 (CGMCC No. 9738)的16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和序 列測(cè)定及16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育特征。
[0037] 1.提取基因組DNA 將氣微菌JerofflicroWw? 5/7. YS17 (CGMCC No. 9738)接種于TSB液體培養(yǎng)基，將生長(zhǎng) 至對(duì)數(shù)晚期的發(fā)酵液，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，去除上清液；用TES (50 mM Tris，50 mM EDTA-Na2, 50mM NaCl，pH 8. 0-8. 2)溶液洗3遍；用0. 4mL TES溶液將菌體混勻，加入適量溶 菌酶，37°C保溫1小時(shí)；加入0· 04 mL20%SDS，60°C保溫30分鐘；加入0· 18 mL 5M NaClO4, 混勻；加入等體積氯仿-異戊醇（24: 1)，輕輕搖勻1分鐘左右，離心（12000轉(zhuǎn)/分鐘，10分 鐘)，吸取上清液；上清液加入20 μ 1 0. 2 % RNA酶37 °C保溫30分鐘，氯仿-異戊醇（24: l，v/v)處理一遍；上清液加入20 μ 1蛋白酶K (50-70 μ g/mL)，37°C保溫1小時(shí)，氯仿-異 戊醇（24: I，v/v)處理一遍；上清液用2倍體積冰乙醇沉淀，70%冰乙醇溶液浸泡5分鐘， 12000/分鐘離心5分鐘。晾干后溶于無菌水中作為模板DNA。
[0038] 2. 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序 用于？0?擴(kuò)增的正向引物為5'-六6六61'176六了0^66(：11^6-3'（1^8-27)，反向引物為 5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'（nt 1541-1557)，分別對(duì)應(yīng)于大腸桿菌的 16S rRNA 基因的 8-27 和 1541-1557 堿基。PCR 反應(yīng)體系（20 μL)為：10Xbuffer 2μ1、25 mmol/L MgCl22yl、 10 mmol/L dNTPs 1·5μ1、30 pmol/L 引物各 lyl、ddH20 13.4yl、Taq DNA 酶 ΙμL、模板 14 1。？0?反應(yīng)條件為：95°〇1〇111丨11，95°〇1111丨11，55°〇1111丨11，72°〇1111丨113〇8,30個(gè)循環(huán) ； 72°C 10 min，4°C保存。
[0039] PCR 產(chǎn)物