一種耐鹽堿微生物菌群及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群，該菌群用于處理高鹽堿含量的廢棄鉆井泥漿和含油污泥。本發(fā)明的耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群，包含有異希瓦氏菌，假單胞菌和鹽單胞菌；其中菌群中異希瓦氏菌，假單胞菌和鹽單胞菌的數(shù)量比優(yōu)選為4：3：1。本發(fā)明中的菌群對(duì)pH、鹽分具有很強(qiáng)的耐受能力，具有對(duì)鉆井廢棄泥漿和石油污染土壤環(huán)境廣泛的適應(yīng)能力。廢棄泥漿中的添加劑和有毒有害物質(zhì)對(duì)活性微生物菌群沒有明顯的抑制作用，菌群生長速率較快，活性穩(wěn)定，適應(yīng)性強(qiáng)，生產(chǎn)成本低廉，可以應(yīng)用于鉆井廢棄泥漿的生物降解以及修復(fù)石油環(huán)境污染及化工行業(yè)，這對(duì)提高我國油田廢棄鉆井泥漿的生物降解效率和完善處理工藝方面都具有較強(qiáng)的開發(fā)潛力。
【專利說明】—種耐鹽堿微生物菌群及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于功能微生物菌群復(fù)配和篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種耐鹽堿微生物菌群及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]廢棄鉆井泥漿是在油氣田鉆井過程中產(chǎn)生的油、水、泥的混合廢棄物，主要包括廢棄鉆井液、廢液、鉆屑和石油烴等。添加鉆井液是為達(dá)到安全、快速鉆井的目的，隨著鉆井深度增加和難度加大，添加劑及有毒有害成分也增多，組成也越來越復(fù)雜，主要含重金屬(Cr、Hg、Cd、Pb等)、石油烴類、膨潤土、堿性化合物等都是對(duì)人、畜和環(huán)境有害的物質(zhì)。廢棄鉆井泥漿中的廢液產(chǎn)生于油田勘探和開發(fā)過程中，潤滑鉆頭的同時(shí)也把鉆屑攜帶到地面，半流體形態(tài)加大了污染面積，過高的PH值(8-12)、過量的鹽(3%以上)和石油類物質(zhì)極易造成土壤板結(jié)，肥力下降，使植物從土壤中吸收水分困難，作物大幅減產(chǎn)。廢棄鉆井泥漿流入河流、海洋或滲入地層，嚴(yán)重影響水生生物生長，污染地表水和地下水資源，造成污染物大范圍遷移，給環(huán)境帶來巨大的潛在危害，同時(shí)也進(jìn)一步增加了環(huán)境修復(fù)的難度和成本。
[0003]我國將含油鉆井廢棄物列為《危險(xiǎn)廢物名錄》，要求農(nóng)用污泥中石油類含量控制在3000mg/kg以內(nèi)。國內(nèi)對(duì)于廢棄鉆井泥漿的處理通常采用固化密封的方式，少數(shù)油氣田采取焚燒、回注、生物降解方式，但目前都處于邊探索、邊應(yīng)用，邊實(shí)驗(yàn)階段，相關(guān)技術(shù)和工藝不夠成熟。更為先進(jìn)環(huán)保的生物降解技術(shù)處理廢棄泥漿，但由于技術(shù)瓶頸，還沒有大規(guī)模應(yīng)用先例。由于廢棄鉆井泥漿中的主要污染物是石油烴類物質(zhì)，而微生物作為生物圈中最大的分解者，能利用大部分石油烴作為分解代謝的底物，對(duì)污染物進(jìn)行徹底分解，不產(chǎn)生二次污染。因此，利用微生物處理技術(shù)對(duì)廢棄鉆井泥漿中的石油烴類污染物進(jìn)行處理一直是研究的重點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群，及其在處理高鹽堿含量的廢棄鉆井泥漿和含油污泥中的應(yīng)用，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0005]本發(fā)明的耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群，包含有異希瓦氏菌，假單胞菌和鹽單胞菌。
[0006]菌群中異希瓦氏菌，假單胞菌和鹽單胞菌的數(shù)量比優(yōu)選為4:3:1。
[0007]作為實(shí)施例的優(yōu)選，所述的異希瓦氏菌包含有胎兒異希瓦氏菌Alishewanellafetalis 和土壤異希瓦氏菌 Alishewanella agri:
[0008]作為實(shí)施例的優(yōu)選，假單胞菌為廈門假單胞菌Pseudomonas xiamenensis ；
[0009]鹽單胞菌為先河鹽單胞菌Halomonas xianhensis、攀式鹽單胞菌Halomonasventosae。
[0010]上述的復(fù)配微生物菌群用于處理鉆井廢棄泥漿或石油污染土壤。
[0011]本發(fā)明中的活性微生物菌群對(duì)pH，鹽分具有很強(qiáng)的耐受能力，具有對(duì)鉆井廢棄泥漿和石油污染土壤環(huán)境廣泛的適應(yīng)能力。廢棄泥漿中的添加劑和有毒有害物質(zhì)對(duì)活性微生物菌群沒有明顯的抑制作用，菌群生長速率較快，活性穩(wěn)定，適應(yīng)性強(qiáng)，生產(chǎn)成本低廉，可以應(yīng)用于鉆井廢棄泥漿的生物降解以及修復(fù)石油環(huán)境污染及化工行業(yè)，這對(duì)提高我國油田廢棄鉆井泥漿的生物降解效率和完善處理工藝方面都具有較強(qiáng)的開發(fā)潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:群落處理14d后石油烴中各組分降解率；
[0013]圖2:菌群傳代過程中對(duì)原油的降解率。

【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的活性菌群進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0015]實(shí)施例1:廢棄鉆井泥漿本源微生物群落結(jié)構(gòu)鑒定及污染物分析
[0016]利用16S rDNA克隆文庫的方法，對(duì)取自中國天津大港油田港356井場(chǎng)附近堆放的廢棄鉆井泥漿中的本源微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，用于篩選耐鹽堿活性微生物功能菌群及優(yōu)化培養(yǎng)條件。結(jié)果顯示假單胞菌(Pseudomonas sp.)在廢棄鉆井泥衆(zhòng)中所占的比例最高，達(dá)27.44%;根瘤菌屬(Rhizobium sp.)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter sp.)占比例也較高,分別% 20.73%>8.54% ο Deth1bacter alkaliphilus 在群落中所占的比例為 7.93%,這與廢棄鉆井泥楽■中硫含量聞?dòng)兄苯雨P(guān)系。
[0017]分析了廢棄鉆井泥漿中的基本理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)廢棄鉆井泥漿pH為8.2-8.5，石油烴含量為12.4g/kg，有機(jī)質(zhì)含量為4.4g/kg，含水率60%，含鹽量25g/kg。原油族組分分析發(fā)現(xiàn)廢棄鉆井泥漿中烴類污染物含量最高的是芳香烴，達(dá)42.01% (w/w)，脂肪烴類含量最少，為18.76% (w/w)，浙青質(zhì)和膠質(zhì)的含量則分別為20.31% (w/w)和18.92% (w/w) 0通常，原油中組分含量最高的是脂肪烴，與本實(shí)驗(yàn)樣品中石油的組分有所不同，原因是廢棄鉆井泥漿長期被堆置在泥漿池中，烷烴類由于其生物可利用性最高優(yōu)先被本源微生物所降解，導(dǎo)致其含量最低，芳香烴類由于其較難被微生物所利用，所以含量很高。芳香烴是一類廣泛分布于環(huán)境中的含有苯環(huán)的有毒有害污染物，其具有潛在毒性、致癌性及致畸和誘變作用，可通過生物累積及食物鏈的傳遞，給生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害。進(jìn)一步說明了利用耐鹽堿的高活性微生物功能菌群處理廢棄鉆井泥漿的必要性和保護(hù)環(huán)境的意義。
[0018]實(shí)施例2:耐鹽堿活性菌群篩選及群落結(jié)構(gòu)分析
[0019]耐鹽堿活性微生物菌群的活性特征取決于其生長環(huán)境的特殊性以及長期馴化得到的環(huán)境耐受能力，按照如下方法篩選耐鹽堿性微生物群落。
[0020]1、培養(yǎng)液制備:按照100g/L的比例，稱取廢棄鉆井泥漿接種于預(yù)先制備好的200ml含2% (w/v)原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基的500mL三角瓶中混勻，180rpm，30°C振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成如下(w/v):磷酸二氫鉀0.005%，磷酸氫二鉀0.005%，硝酸銨0.005%，硫酸鎂0.0025%，氯化鈣0.005%，硫酸亞鐵0.0005%，有固相助劑5%，無固相助劑5%, pH 7.5，廢棄鉆井泥漿中有機(jī)碳源含量低，添加2%原油有助于強(qiáng)化群落乳化和降解石油烴類的活性。
[0021]2、活性群落傳代馴化:活性群落的培養(yǎng)體系在搖床30°C，ISOrpm振蕩培養(yǎng)，將發(fā)酵液按照10% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含2% (w/v)原油無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每培養(yǎng)7d傳代一次，連續(xù)轉(zhuǎn)接20代以上，得到一個(gè)活性穩(wěn)定，對(duì)原油乳化效果好的微生物復(fù)合菌群(如下所述)。培養(yǎng)體系在30°C，搖床180rpm震蕩培養(yǎng)3d條件下，活菌數(shù)量超過101°個(gè)/ml，原油綜合降解率達(dá)到60%以上。廢棄鉆井泥漿中微生物多樣性高，群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，表明微生物經(jīng)過長期進(jìn)化后已適應(yīng)廢棄鉆井泥漿環(huán)境。因此，利用本源微生物對(duì)其中的污染物進(jìn)行降解是切實(shí)可行的。
[0022]3、活性微生物群落結(jié)構(gòu)分析:利用16S rDNA克隆文庫的方法，對(duì)傳代20代的活性微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)菌群中主要存在三個(gè)成員:假單胞菌(Pseudomonas)、異希瓦氏菌(Alishewanella)和鹽單胞菌(Halomonas)三個(gè)數(shù)量達(dá)92.72% ο 其中 Alishewanella 比例最高，達(dá) 49.09 %，其次是 Pseudomonas (27.28 % )和Halomonas (16.37% )。
[0023]實(shí)施例3:單菌復(fù)配驗(yàn)證活性菌群功能
[0024]按照實(shí)施例2中篩選到的活性功能菌群比例，分別選用分離自泥樣的胎兒異希瓦氏菌Alishewanella fetalis, CGMCCC N0.1.8064,分離自土壤樣品的土壤異希瓦氏菌Alishewanella agri, CGMCCC N0.1.10668,分離自活性污泥樣品的廈門假單胞菌Pseudomonas xiamenensis, CGMCCC N0.1.6446,分離自石油污染土壤樣品的先河鹽單胞菌Halomonas xianhensis, CGMCCC N0.1.6848以及分離自高鹽土壤樣品的攀式鹽單胞菌，Halomonas ventosae,CGMCCC N0.1.6331，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，之后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，按照異希瓦氏菌Alishewanella:假單胞菌Pseudomonas:鹽單胞菌Halomonas = 4:3:1的比例復(fù)配組成微生物菌群。其中異希瓦氏菌Alishewanella和鹽單胞菌Halomonas中的不同種的添加比例可以是任意的。
[0025]按照實(shí)施例2所述活性檢測(cè)方法，分析群落對(duì)原油降解效率，培養(yǎng)體系在30°C，搖床180rpm震蕩培養(yǎng)14d條件下,活菌數(shù)量超過111個(gè)/ml,原油綜合降解率超過60%,結(jié)果驗(yàn)證了本發(fā)明的功能菌群的活性功能。
[0026]實(shí)施例4:復(fù)配菌群活性和功能穩(wěn)定性分析
[0027]1、復(fù)配微生物群落活性分析:比較復(fù)配菌群處理14d前后的石油烴族組分變化。石油烴組分分析參照《中華人民共和國石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一巖石中可溶有機(jī)物及原油族組分分析(SY/T 5119-2008)》:用等體積氯仿將廢棄鉆井泥漿降解體系中的石油萃取出來，濃縮除去溶劑，用正己烷沉淀其中的浙青質(zhì)，濾液部分濃縮至3-4mL，通過硅膠氧化鋁層析柱，采用不同極性的溶劑，依次用正己燒，二氯甲烷:正己烷=2:l(v/v)和氯仿將其中的飽和烴、芳香烴和膠質(zhì)分別淋洗出，揮發(fā)除去溶劑，恒重后稱量，得樣品中各族組分的含量。結(jié)果顯示，經(jīng)14d處理后，大部分的脂肪烴烴被降解，降解率達(dá)92.04%,芳香烴降解率次之，為79.5%，膠質(zhì)和浙青質(zhì)的降解率分別10.27%和16.46%。殘余的石油烴中芳香烴、膠質(zhì)、浙青質(zhì)這三種難以降解的組分高達(dá)96.74%，說明相對(duì)于芳香烴、膠質(zhì)和浙青質(zhì)，微生物更優(yōu)先利用脂肪烴，原油綜合降解率60%以上(圖1)，對(duì)比篩選菌群，原油綜合降解率在55%左右，說明復(fù)配菌群在活性上優(yōu)于篩選的微生物群落。
[0028]2、復(fù)配菌群功能穩(wěn)定性分析:
[0029]分別測(cè)定復(fù)配菌群在傳代過程中第6、12、16、18、22代菌群對(duì)總石油烴的降解率來監(jiān)測(cè)群落功能的變化。取1mL培養(yǎng)體系中培養(yǎng)液接種到含有90mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，添加2% (w/v)原油為唯一碳源，于30°C, 180rpm的搖床中培養(yǎng)14d,萃取體系中剩余的總石油烴，利用實(shí)施例3-1中的方法測(cè)定不同代數(shù)的群落對(duì)總烴降解率，反映群落降解石油烴功能的穩(wěn)定性，以不添加復(fù)配菌群組作對(duì)照。第O代處理組對(duì)原油降解率為16.32%，活性較弱，細(xì)胞數(shù)量較少，隨著馴化代數(shù)增加，活性微生物得以富集，原油降解能力越來越強(qiáng)，從第6代至第22代菌群對(duì)原油的降解率均在60%以上(圖2)。同時(shí)，設(shè)置了培養(yǎng)體系中不同含鹽量0-15% (w/v)和不同pH 5-10，結(jié)果顯示，單菌復(fù)配后的菌群對(duì)原油降解率都在60%以上，含油量在10% (w/v)內(nèi)的培養(yǎng)體系中功能菌群活性沒有任何下降，說明菌群活性穩(wěn)定，耐受能力較高，在含鹽量超過20%和ρΗ>11的條件下，菌群活性受到了一定抑制，原油降解率在50%左右，保持了較強(qiáng)的活性。
[0030]實(shí)施例5:菌群處理前后泥漿有機(jī)質(zhì)含量及污泥脫油效果驗(yàn)證
[0031]參照土壤有機(jī)質(zhì)含量的測(cè)定方法(NY/T 1121.6-2006)，在加熱的條件下，用過量的重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化土壤中的有機(jī)碳，多余的重鉻酸鉀由硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，檢測(cè)了處理前后泥漿中的有機(jī)質(zhì)含量。配制培養(yǎng)基時(shí)所加物質(zhì)總有機(jī)質(zhì)含量為183.71g/kg，20代群落培養(yǎng)體系中總有機(jī)質(zhì)含量121.904g/kg，總體系降解率為38.91%。
[0032]取適量土樣，65°C烘干，碾碎，加入過量原油飽和，烘干碾碎。取第20代單菌復(fù)配的微生物群落，處理含油土壤，搖床震蕩培養(yǎng)14d，取泥烘干，碾碎。分析作用前后泥土中的原油含量變化情況。含油污泥含油量261g/kg，微生物群落處理后泥土中含油305mg/kg，可以看出，復(fù)配菌群對(duì)泥土中原油的去除率達(dá)到了 99%以上，效率很高，篩選菌群對(duì)含油污泥脫除率在90%，說明單菌復(fù)配菌群效果優(yōu)于篩選的活性菌群。降解后土壤的顏色明顯淺于加油后，甚至顏色淺于未加油時(shí)的顏色，說明馴化的活性菌群有很好的脫油活性，適用于廢棄鉆井泥漿和油污土壤中的原油降解和乳化去除。
[0033]實(shí)施例6:連續(xù)曝氣裝置的設(shè)計(jì)與試用
[0034]分析活性微生物群落對(duì)廢棄鉆井泥漿的處理效果，經(jīng)過研究和數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，由于廢棄鉆井泥漿中存在較大的顆粒物，所以上翻型的攪拌槳對(duì)含泥沙量較大的發(fā)酵體系的攪動(dòng)效果最好，有理于泥漿顆粒均勻攪動(dòng)，對(duì)氣體分散也有促進(jìn)作用。進(jìn)一步分析了不同徑高比的容器對(duì)連續(xù)曝氣裝置中通氣和攪拌的影響，發(fā)現(xiàn)徑高比在0.4-0.6之間的容器，攪拌效率較好，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵體系4L以內(nèi)攪拌效率較高，大的體系，溶氧和泥沙攪拌效率都比較低，不利于微生物在好氧條件下對(duì)石油污染物的分解利用。氣泵調(diào)節(jié)通氣量為6L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，培養(yǎng)溫度為室溫，發(fā)酵體系裝液量為4L，折合通氣量為1.5vvm，發(fā)酵容器徑高比為1:2，復(fù)合菌液投加量在10%-20%之間，經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)30d，計(jì)算發(fā)酵體系中的石油烴類污染物去除效率為70%以上，達(dá)到了預(yù)期的效果。
【權(quán)利要求】
1.一種耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群，其特征在于，所述的耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群包含有異希瓦氏菌，假單胞菌和鹽單胞菌。
2.如權(quán)利要求1所述的耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群，其特征在于，所述的菌群中異希瓦氏菌，假單胞菌和鹽單胞菌的數(shù)量比為4:3:1。
3.如權(quán)利要求1或2所述的耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群，其特征在于，所述的異希瓦氏囷為胎兒異希瓦氏囷和/或土壤異希瓦氏囷。
4.如權(quán)利要求1或2所述的耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群，其特征在于，所述的假單胞菌為廈門假單胞菌。
5.如權(quán)利要求1或2所述的耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群，其特征在于，所述的鹽單胞菌為先河鹽單胞菌和/或攀式鹽單胞菌。
6.權(quán)利要求1所述的耐鹽堿復(fù)配微生物活性菌群在處理鉆井廢棄泥漿或石油污染土壤中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104403967SQ201410623410
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】王興彪, 黃志勇, 董大媛, 常允康 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所