積的比較，其中IFN-0生產(chǎn)量在圖中的面積使用細(xì)胞數(shù)量增加在圖中的面積進(jìn) 行修正，通過梯形試樣法計(jì)算當(dāng)CH0-K1培養(yǎng)于脫?；Y(jié)冷膠存在（0. 025%)和其不存在(對(duì) 照）的情況下時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增加(左圖）和IFN-0生產(chǎn)量(右圖）的圖中面積獲得所述修正， 在測(cè)試中使用圖3中描述的CH0-K1 (圖中IFN-0生產(chǎn)量面積/圖中細(xì)胞數(shù)量增加面積)。
[0031] 圖5顯示當(dāng)凝膠在經(jīng)超聲處理和添加至培養(yǎng)基重懸時(shí)，凝膠微粉化處理對(duì)細(xì)胞增 殖的效果。
[0032] 圖6顯示當(dāng)凝膠在經(jīng)超聲處理和添加至培養(yǎng)基重懸時(shí)，凝膠微粉化對(duì)細(xì)胞IFN-0 生產(chǎn)的效果。
[0033] 圖7顯示滾瓶材料的區(qū)別對(duì)凝膠中細(xì)胞增殖潛能的效果。
[0034] 圖8顯示滾瓶材料的區(qū)別對(duì)凝膠中細(xì)胞IFN- 0生產(chǎn)的影響。
[0035] 實(shí)施方案描述 1.培養(yǎng)基添加物/蛋白質(zhì)生產(chǎn)促進(jìn)劑 本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)時(shí)，通過至少在當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞可以充分 生長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)或當(dāng)待生產(chǎn)的期望的蛋白質(zhì)可以充分生產(chǎn)的部分或全部時(shí)期內(nèi)對(duì)培養(yǎng) 基添加多糖，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)至少可以部分地高生產(chǎn)。因此，本發(fā)明提供了含有多糖的用于 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基添加物、用于促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的試劑(在下文中有時(shí)縮寫為 "本發(fā)明的培養(yǎng)基添加劑/蛋白質(zhì)生產(chǎn)促進(jìn)劑")。
[0036] 用于本發(fā)明的多糖優(yōu)選地具有陰離子官能團(tuán)。作為陰離子官能團(tuán)，可以提及羧基、 磺酸基、磷酸基及其鹽，并且羧基或其鹽是優(yōu)選的。
[0037] 本發(fā)明中使用的多糖，其中不小于10個(gè)單糖(例如，丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖 等)是聚合的，更優(yōu)選地，酸性單糖具有陰離子官能團(tuán)。所述酸性單糖不是特別限定的，只要 在其結(jié)構(gòu)中具有陰離子官能團(tuán)，并且包括，例如，具有糖醛酸(例如，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、 半乳糖醛酸、甘露糖醛酸）的多糖，在其部分結(jié)構(gòu)中具有磺酸基或磷酸基的多糖，和具有所 述兩種結(jié)構(gòu)的多糖，和不但包含天然獲得的多糖還包含通過微生物生產(chǎn)的多糖、通過遺傳 工程生產(chǎn)的多糖和使用酶人工合成的多糖。
[0038] 更特別地，所述多糖的實(shí)例包括由選自透明質(zhì)酸、結(jié)冷膠、脫?；Y(jié)冷膠、鼠李聚 糖膠、迪特膠（diutan gum)、黃原膠、角叉菜膠、黃原膠、己糖醛酸、巖藻依聚糖、果膠、果膠 酸、果膠酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸類肝素、硫酸角質(zhì)、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸 鼠李聚糖及其鹽的一種或多種構(gòu)成的聚合物。
[0039] 所述鹽包括，例如，堿金屬鹽，諸如鋰、鈉、鉀，具有堿土金屬的鹽，諸如鈣、鋇、鎂和 具有鋁、鋅、銅、鐵、銨、有機(jī)堿和氨基酸等鹽的鹽。其優(yōu)選的實(shí)例包括，但不限于，二價(jià)金屬 鹽，諸如鈣、鎂、鋅、鐵、銅等。
[0040] 這些的重均分子量?jī)?yōu)選地為10,000至50, 000, 000,更優(yōu)選地為100,000至 20, 000, 000、更優(yōu)選地為1，000, 000至10, 000, 000。本發(fā)明中的分子量，可以通過凝膠滲 透色譜（GPC)基于支鏈淀粉測(cè)量。
[0041] 本發(fā)明中使用的多糖的更優(yōu)選的特定的實(shí)例包括脫?；Y(jié)冷膠、角叉菜膠和黃原 膠，最優(yōu)選的實(shí)例包括脫酰基結(jié)冷膠。本發(fā)明中的脫?；Y(jié)冷膠是含有以1-3鍵合的葡萄 糖、1-4鍵合的葡糖醛酸、1-4鍵合的葡萄糖和1-4鍵合的鼠李糖的4分子糖作為組成單元 的線性聚合物多糖，其是下文式（I)的多糖，其中Rl、R2各自是氫原子，并且n是兩個(gè)或更 多個(gè)的整數(shù)。R1可以含有丙三基，R2可以含有乙?；?，并且乙?；捅暮?jī)?yōu)選地 不多于10%，更優(yōu)選地不多于1%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基添加物，其包含多糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的添加物，所述添加物促進(jìn)培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)期望的蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的添加物，所述添加物促進(jìn)所述動(dòng)物細(xì)胞的每一個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)生 產(chǎn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的添加物，其中所述多糖具有陰離子官能團(tuán)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的添加物，其中所述陰離子官能團(tuán)是選自羧基、磺酸基和磷酸基的 至少一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的添加物，其中所述多糖是選自透明質(zhì)酸、結(jié)冷膠、脫?；Y(jié)冷膠、 黃原膠、角叉菜膠、迪特膠、藻酸、巖藻依聚糖、果膠、果膠酸、果膠酯酸、硫酸乙酰肝素、肝 素、硫酸類肝素、硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸鼠李糖聚糖及其鹽中至少一 種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的添加物，其中所述多糖是脫酰基結(jié)冷膠或其鹽。
8. 用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的所述添加物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基具有不低于1% (w/v)并且不高于15%(w/v) 的血清濃度。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基具有不低于1% (w/v)并且不高于15%(w/v) 的血清替代物濃度，其中所述血清替代物選自血漿蛋白質(zhì)、激素、生長(zhǎng)因子和鹽。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自氨基酸、維他 命、能源、滲透壓調(diào)節(jié)劑、鐵源和pH緩沖劑的至少一種。
12. 使用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其包括在根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的添加 物的存在下或在根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述動(dòng)物細(xì)胞。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中培養(yǎng)所述動(dòng)物細(xì)胞至少（a)或（b)時(shí)期： (a) 當(dāng)所述培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞可以充分地生長(zhǎng)的部分或全部時(shí)期， (b) 當(dāng)所述動(dòng)物細(xì)胞可以充分地生產(chǎn)期望的蛋白質(zhì)的部分或全部時(shí)期。
14. 促進(jìn)培養(yǎng)基中的動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的量的方法，其包括在權(quán)利要求1至7任一 項(xiàng)的添加物的存在下或在根據(jù)權(quán)利要求8至11任一項(xiàng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述動(dòng)物細(xì)胞。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其促進(jìn)所述動(dòng)物細(xì)胞的每一個(gè)細(xì)胞的生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的 量。
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)生產(chǎn)促進(jìn)劑，所述促進(jìn)劑使得對(duì)含有血清或血清替代物的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基添加多糖并且極大地增加生產(chǎn)的期望的蛋白質(zhì)的量成為可能。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用含有該蛋白質(zhì)生產(chǎn)促進(jìn)劑的培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。FERM BP-1007720040728
【IPC分類】C12N15-09, C12N1-00, C12P21-02, C12N5-07
【公開號(hào)】CN104781389
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380043529
【發(fā)明人】戶村美沙代, 巖間武久, 猿橋康一郎, 西野泰斗, 堀川雅人, 川原浩治
【申請(qǐng)人】日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社, 獨(dú)立行政法人國(guó)立高等專門學(xué)校機(jī)構(gòu)
【公開日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2013年8月23日
【公告號(hào)】EP2889368A1, WO2014030726A1