雙酶促擴增的制作方法
【專利說明】雙酶促擴增
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用 本申請根據(jù)35 U. S.C. § 119(e)要求2012年7月23日提交的美國臨時申請?zhí)?61/674, 696的權(quán)益，所述申請出于所有目的在此以其整體通過引用并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于通過用至少兩種不同的DNA聚合酶平行擴增部分或整個基因組 而驗證基因組突變、特別是單核苷酸多態(tài)性（SNP)的存在和特征的方法。
[0003] 發(fā)明背景 實體組織癌癥開始在初始部位生長。隨著疾病進展，轉(zhuǎn)移在遠(yuǎn)端位置發(fā)生。這些轉(zhuǎn)移 事件加速了疾病，最終導(dǎo)致死亡。細(xì)胞或細(xì)胞碎片作為轉(zhuǎn)移過程的部分離開初始部位。轉(zhuǎn) 移的過程是復(fù)雜的。轉(zhuǎn)移過程的部分涉及稀有循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC)。這些CTC不是給定患 者體內(nèi)的統(tǒng)一群體（monolithic population)正變得清楚?；颊唧w內(nèi)CTC的分級對于理解 負(fù)責(zé)困擾患者的癌癥的突變是關(guān)鍵的。需要純化和分離這些稀有腫瘤細(xì)胞（或細(xì)胞衍生事 件）來定義患者血液中的致癌突變。許多細(xì)胞和細(xì)胞碎片存在于全血中，其不含突變，因 此，為了分離有用的攜帶突變的細(xì)胞，需要純化策略。
[0004] 為了通過任何技術(shù)測量從小體積全血分離的CTC的DNA基因組中的突變，足夠數(shù) 量和質(zhì)量的DNA是重要的。通常，可以預(yù)期從2至4 ml全血中回收約2至10范圍內(nèi)的CTC。 該數(shù)目的細(xì)胞必須以優(yōu)異回收率處理，以確保攜帶突變的染色體在處理過程中不丟失。因 此，為了分離足夠質(zhì)量和數(shù)量的DNA，需要特殊方法。常規(guī)方法不是有用的，因為它們改變 了 DNA基因組代表，產(chǎn)生質(zhì)量低劣的DNA和/或?qū)е聛碜源祟愊∮袠悠返牧繉τ谟糜诟鞣N 分子測定法（諸如，但不限于，定量PCR(QPCR)和DNA測序）不足。
[0005] 使用全基因組擴增的DNA已經(jīng)證明可用于分析如此產(chǎn)生的臨床樣品中的突變的 目的。然而，遵循標(biāo)準(zhǔn)測序文庫方案，使用該DNA可產(chǎn)生不一致和/或不準(zhǔn)確的測序結(jié)果。 [0006] 下一代序列技術(shù)或突變檢測的任何方法依賴于樣品材料的均質(zhì)性和足夠量，以 提供具有采樣意義的測定。Cynvenio生成了用于稀有細(xì)胞分離的設(shè)備。這些樣品（由 Cynvenio CTC分離技術(shù)產(chǎn)生）的典型特征是對于每ml全血只可回收幾個CTC細(xì)胞。對于 非常小的樣品（其中僅提供幾個細(xì)胞），對于測定測量的標(biāo)準(zhǔn)模板要求無法得到滿足。我們 已經(jīng)使用全基因組擴增以增加模板的量以繞開該限制。然而，全基因組擴增將錯誤引入樣 品，這可阻止可解釋的結(jié)果。
[0007] 發(fā)明概述 在一個方面，本發(fā)明提供了用于驗證稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞中的基因組突變的存在的方 法。在一些實施方案中，所述方法包括： a) 用第一 DNA聚合酶擴增稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞的部分或整個基因組； b) 用第二DNA聚合酶擴增稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞的部分或整個基因組，其中所述第二 DNA聚合酶不同于第一 DNA聚合酶； c) 比較步驟a)和b)中獲得的擴增的基因組序列與從包含正常體細(xì)胞基因組DNA的 細(xì)胞的對照群體獲得的未擴增的基因組序列，其中在步驟a)和b)中獲得的基因組序列中 相同、但與獲得未擴增的基因組序列的基因組序列中的相同核苷酸位置處的核苷酸多態(tài)性 不同的核苷酸多態(tài)性的鑒定驗證稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞中的基因組突變的存在。在各個實施 方案中，擴增和未擴增的基因組序列通過一種或多種程序包括測序、擴增和/或雜交進行 比較。在一些實施方案中，基因組突變的存在或不存在通過PCR檢測。在一些實施方案中， 基因組突變的存在或不存在通過微陣列檢測。在一些實施方案中，基因組突變的存在或不 存在通過測序檢測。
[0008] 在另一個方面，本發(fā)明提供了用于驗證稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞中的基因組突變的存 在的方法。在一些實施方案中，所述方法包括： a) 用第一 DNA聚合酶擴增和測序稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞的部分或整個基因組； b) 用第二DNA聚合酶擴增和測序稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞的部分或整個基因組，其中所 述第二DNA聚合酶不同于第一 DNA聚合酶； c) 測序而不擴增包含正常體細(xì)胞基因組DNA的對照細(xì)胞群體的部分或整個基因組； d) 比較步驟a)、b)和c)中獲得的基因組序列，其中在步驟a)和b)中獲得的基因組 序列中相同、但與步驟c)中獲得的基因組序列中的相同核苷酸位置處的核苷酸多態(tài)性不 同的核苷酸多態(tài)性的鑒定驗證稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞中的基因組突變的存在。
[0009] 在各個實施方案中，第一 DNA聚合酶和第二DNA聚合酶具有不同的糾錯率。在一些 實施方案中，第一 DNA聚合酶和第二DNA聚合酶具有不同的核酸拷貝保真度。在一些實施 方案中，第一 DNA聚合酶和/或第二DNA聚合酶具有5' - 3'外切核酸酶活性。在一些實 施方案中，第一 DNA聚合酶和/或第二DNA聚合酶不具有3' - 5'外切核酸酶活性。在一 些實施方案中，第一 DNA聚合酶和/或第二DNA聚合酶具有解旋酶和/或鏈置換活性。在 一些實施方案中，第一 DNA聚合酶和第二DNA聚合酶選自Φ 29 (Phi29) DNA聚合酶、水生棲 熱菌（?6?/?皿5· (Taq)DNA 聚合酶、黃棲熱菌（?6?/?皿5· /Yara1S) (Tfl)DNA 聚合 酶、嗜熱棲熱菌(rTth) DNA 聚合酶、?e/SMAs (Tli)DNA 聚合酶、海棲熱袍菌(Tma)DNA聚合酶、激烈熱球菌 Zizrio1SW1S) (Pfu)DNA 聚合酶、嗜熱脂肪芽抱桿菌（ifeciBiAs (Bst) DNA聚合酶、PHUSI0N?高保真DNA聚合酶、Vent/ DNA聚合酶、De印VentK? DNA聚合酶、 Q5?高保真DNA聚合酶和REPLI-g DNA聚合酶。在一些實施方案中，第一 DNA聚合酶和第二 0嫩聚合酶選自〇29 0嫩聚合酶、水生棲熱菌（7&6?/'皿>5<3(7?<3〇'<^/ >5)(^9)0嫩聚合酶、嗜熱 棲熱菌(rTth)DNA 聚合酶、激烈熱球菌 (Pfu)DNA 聚合酶、嗜熱脂肪芽抱桿菌（ifeciBws (Bst) DNA 聚合酶 和PHUSI0N?高保真DNA聚合酶。在一些實施方案中，第一 DNA聚合酶是Φ29 DNA聚合酶， 且第二DNA聚合酶是水生棲熱菌（Taq) DNA聚合酶。在一些實施方案中，第一 DNA聚合酶是 Φ 29 DNA聚合酶，且第二DNA聚合酶是PHUSI0N?高保真DNA聚合酶。
[0010] 在各個實施方案中，所述方法進一步包括檢測擴增和未擴增的核酸序列中一個或 多個基因組突變（例如，SNP)的存在、不存在或特性的步驟。在各個實施方案中，所述方 法進一步包括從稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞分離基因組DNA的步驟。在各個實施方案中，所述 方法進一步包括分離稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞的步驟。在各個實施方案中，所述方法進一步 包括從主體獲得稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞的步驟。在各個實施方案中，稀有細(xì)胞群體是循環(huán) 腫瘤細(xì)胞（CTC)。在一些實施方案中，CTC獲得自主體的血液樣品。在一些實施方案中， CTC基于其上皮細(xì)胞粘附分子（Ep-CAM)的表面表達進行分離。在一些實施方案中，CTC基 于其表達一種或多種CTC-相關(guān)標(biāo)志物進行分離，所述CTC-相關(guān)標(biāo)志物例如，上皮細(xì)胞粘 附分子（Ep-CAM)、角蛋白19(KRT19)、粘蛋白I (MUCl)、癌胚抗原相關(guān)的細(xì)胞粘附分子5 (CEACAM5)、含桿狀病毒IAP重復(fù)5 (BIRC5)、分泌球蛋白家族2A成員2 (SCGB2A2)、ERBB2、 細(xì)胞角蛋白8 (CK8)、細(xì)胞角蛋白18 (CK18)和細(xì)胞角蛋白19 (CK19)。
[0011] 在一些實施方案中，基因組突變是單核苷酸多態(tài)性（SNP)。
[0012] 在各個實施方案中，體細(xì)胞基因組DNA來自白細(xì)胞（WBC)。在各個實施方案中，體 細(xì)胞基因組DNA來自口腔拭子。在各個實施方案中，體細(xì)胞基因組DNA來自毛球或毛囊。
[0013] 在一些實施方案中，步驟a)和b)中的細(xì)胞的整個基因組進行擴增和測序。在一 些實施方案中，步驟a)和b)中的細(xì)胞的整個基因組的部分進行擴增和測序。在一些實施 方案中，所述細(xì)胞的部分或整個基因組通過進行下一代測序進行測序。
[0014] 在一個進一步方面，本發(fā)明提供了用于驗證稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞中的基因組突變 的存在的方法。在一些實施方案中，所述方法包括： a) 用第一 DNA聚合酶擴增稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞的部分或整個基因組兩次或更多次迭 代（iterations)； b) 比較步驟a)中獲得的基因組序列與從包含正常體細(xì)胞基因組DNA的細(xì)胞的對照群 體獲得的未擴增的基因組序列，其中在步驟a)中獲得的基因組序列中相同、但與獲得未擴 增的基因組序列的基因組序列中的相同核苷酸位置處的核苷酸多態(tài)性不同的核苷酸多態(tài) 性的鑒定驗證稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞中的基因組突變的存在。在各個實施方案中，擴增和未 擴增的基因組序列通過一種或多種程序包括測序、擴增和/或雜交進行比較。在一些實施 方案中，基因組突變的存在或不存在通過PCR檢測。在一些實施方案中，基因組突變的存在 或不存在通過微陣列檢測。在一些實施方案中，基因組突變的存在或不存在通過測序檢測。
[0015] 在另一個方面，本發(fā)明提供了用于驗證稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞中的基因組突變的存 在的方法。在一些實施方案中，所述方法包括： a) 用第一 DNA聚合酶擴增和測序稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞的部分或整個基因組兩次或更 多次迭代； b) 測序而不擴增包含正常體細(xì)胞基因組DNA的對照細(xì)胞群體的部分或整個基因組； c) 比較步驟a)和b)中獲得的基因組序列與步驟c)中獲得的未擴增的基因組序列， 其中在步驟a)中獲得的基因組序列中相同、但與步驟b)中獲得的基因組序列中的相同核 苷酸位置處的核苷酸多態(tài)性不同的核苷酸多態(tài)性的鑒定驗證稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞中的基 因組突變的存在。
[0016] 在一些實施方案中，第一 DNA聚合酶具有5' - 3'外切核酸酶活性。在一些 實施方案中，第一 DNA聚合酶不具有Y - 5'外切核酸酶活性。在一些實施方案中，第 一 DNA聚合酶具有解旋酶和/或鏈置換活性。在一些實施方案中，第一 DNA聚合酶選自 Φ29 DNA 聚合酶、水生棲熱菌S(Jttaiicw1S)(Taq)DNA 聚合酶、黃棲熱菌 flavus) (Tf I) DNA 聚合酶、嗜熱棲熱菌（?皿 5· (r T th) DNA 聚合酶、 (Tli)DNA 聚合酶、海棲熱袍菌(Tma)DNA 聚合 酶、激烈熱球菌Λ/ri〇5·?5·) (Pfu)DNA聚合酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌 5 tear o thermophi I us) (Bst) DNA 聚合酶、PHUSION? 高保真 DNA 聚合酶、VentR? DNA 聚合 酶、De印VentR? DNA聚合酶、Q5?高保真DNA聚合酶和REPLI-g DNA聚合酶。在各個實施 方案中，第一DNA聚合酶選自Φ29 DNA聚合酶、水生棲熱菌（?6?/?皿5· (Taq)DNA 聚合酶、嗜熱棲熱菌（?6?/?μ/5· (rTth)DNA聚合酶、激烈熱球菌 OdJtococcw1S Zizrio1SW1S) (Pfu)DNA 聚合酶、嗜熱脂肪芽抱桿菌（ifeciBiAs (Bst) DNA聚合酶和PHUSION?高保真DNA聚合酶。
[0017] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括從稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞分離基因組DNA 的步驟。在一些實施方案中，所述方法進一步包括分離稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞的步驟。在一些 實施方案中，所述方法進一步包括從主體獲得稀有細(xì)胞群體的細(xì)胞的步驟。在一些實施方 案中，稀有細(xì)胞群體是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC)。在一些實施方案中，CTC獲得自主體的血液樣 品。在一些實施方案中，CTC基于其上皮細(xì)胞粘附分子（Ep-CAM)的表面表達進行分離。在 一些實施方案中，CTC基于其表達一種或多種CTC-相關(guān)標(biāo)志物進行分離，所述CTC-相關(guān)標(biāo) 志物例如，上皮細(xì)胞粘附分子（Ep-CAM)、角蛋白19 (KRT19)、粘蛋白I (MUCl)、癌胚抗原相 關(guān)的細(xì)胞粘附分子5 (CEACAM5)、含桿狀病毒IAP重復(fù)5 (BIRC5)、分泌球蛋白家族2A成員2 (SCGB2A2)、ERBB2、細(xì)胞角蛋白8 (CK8)、細(xì)胞角蛋白18 (CK18)和細(xì)胞角蛋白19 (CK19)。
[0018] 在一些實施方案中，基因組突變是單核苷酸多態(tài)性（SNP)。
[0019] 在一些實施方案中，對照細(xì)胞群體來自包含正常體細(xì)胞基因組DNA的細(xì)胞群體。 在一些實施方案中，體細(xì)胞基因組DNA來自白細(xì)胞（WBC)。在各個實施方案中，體細(xì)胞基因 組DNA來自口腔拭子。在各個實施方案中，體細(xì)胞基因組DNA來自毛球或毛囊。
[0020] 在一些實施方案中，步驟a)和b)中的細(xì)胞的整個基因組進行擴增和測序。在一 些實施方案中，步驟a)和b)中的細(xì)胞的整個基因組的部分進行擴增和測序。在一些實施 方案中，所述細(xì)胞的部分或整個基因組通過進行下一代測序進行測序。
[0021] 定義 術(shù)語"稀有細(xì)胞群體"是指樣品中的細(xì)胞群體，其為樣品中總細(xì)胞的少于1/106 (即， 一百萬分之一或1〇_4%)，經(jīng)常少于1/107 (即，千萬分之一或1〇_5%)，或少于1/108 (即，一 億分之一或KT6 %)，或少于1/109 (即，十億分之一或KT7 %)。稀有細(xì)胞群體的說明性實 例是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞以大約1-10 CTC/mL全血的頻率發(fā)現(xiàn)于具有轉(zhuǎn)移 性疾病的患者中。為了比較，一毫升血液含有幾百萬個白細(xì)胞和十億個紅細(xì)胞。
[0022] 生物學(xué)和生物化學(xué)術(shù)語：當(dāng)討論分子的具體類別，諸如核酸或蛋白時，則包括合成 形式，諸如天然存在的分子的模擬物或異構(gòu)形式。除非另有說明