>[0022] 發(fā)酵過程就其本質(zhì)來說是由微生物參與的生物化學(xué)反應(yīng)過程，因此微生物細(xì)胞的 數(shù)量、狀態(tài)、代謝情況對產(chǎn)物的生物合成有著重要的影響。菌體濃度的大小對發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn) 率有著重要的影響。理論上菌體濃度越大，產(chǎn)物的產(chǎn)量也越大，但是菌體濃度過高會產(chǎn)生 其他影響，如營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分發(fā)生明顯的改變，如有毒物質(zhì)的積累 等，這些可能改變菌體的代謝途徑。因此，本發(fā)明中，以接種后且流加碳源和流加氯化銨之 前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量優(yōu)選為12-18體積％。
[0023] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，賴氨酸發(fā)酵菌種在被接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中之前， 采用常規(guī)方法將賴氨酸發(fā)酵菌種經(jīng)過種子罐培養(yǎng)，在種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)程度可以通過取樣 顯微鏡鏡檢、OD值測定對產(chǎn)賴氨酸微生物的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)通過上述方法觀察菌體形態(tài) 正常、測定OD值達(dá)到0. 75以上時停止培養(yǎng)，將此時種子罐中的種子液稱為成熟種子液。然 后再將成熟種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。因此，本發(fā)明中，賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量為12-18 體積％，指的是接入發(fā)酵培養(yǎng)基中的成熟種子液的體積占接入成熟種子液后發(fā)酵培養(yǎng)基體 積的 12_18%。
[0024] 本發(fā)明中，OD值為被測發(fā)酵液或種子液吸收的光密度，可以反映發(fā)酵液或種子液 中賴氨酸發(fā)酵菌種的數(shù)量，因此，本領(lǐng)域中一般均采用OD值來表示發(fā)酵液或種子液中賴氨 酸發(fā)酵菌種的數(shù)量，本發(fā)明也沿用本領(lǐng)域的采用OD值來表示發(fā)酵液或種子液中賴氨酸發(fā) 酵菌種的數(shù)量的習(xí)慣。且本發(fā)明中，OD值為將發(fā)酵液或種子液進(jìn)行26倍稀釋，采用722N可 見光分光光度計，在波長562納米可見光下測定的吸光值。
[0025] 種子罐培養(yǎng)可以采用一級種子罐培養(yǎng)也可以采用二級種子罐培養(yǎng)，一級種子罐培 養(yǎng)即將賴氨酸發(fā)酵菌種在一個種子罐中一直培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度；二級種子罐培養(yǎng)即先 將賴氨酸發(fā)酵菌種在一個種子罐中培養(yǎng)一段時間后再轉(zhuǎn)入另一個種子罐繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)到 所需的培養(yǎng)程度。二級種子罐培養(yǎng)在各個種子罐的培養(yǎng)時間沒有具體限定，只要最終能培 養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度即可。為了操作方便，本發(fā)明的種子罐培養(yǎng)優(yōu)選采用一級種子罐培養(yǎng)。
[0026] 本發(fā)明中，對于種子罐培養(yǎng)基的成分無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的種子罐 培養(yǎng)基，例如，可以用淀粉質(zhì)原料糖化清液、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、蘇氨酸 和蛋氨酸等配制種子罐培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，每升種子罐培養(yǎng)基中各原料的用量可以在 很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每升種子罐培養(yǎng)基中，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量可以為 30-40克，玉米漿(干重為20-50重量％)的用量可以為70-90克，磷酸氫二鉀的用量可以為 0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-1. 1克，硫酸銨的用量可以為5-15克，蘇氨酸的用量 可以為0. 1-0. 6克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克。
[0027] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)的菌種為經(jīng)過活化后進(jìn)行增 殖培養(yǎng)后的菌種?；罨驮鲋撑囵B(yǎng)為本領(lǐng)域的公知常識，在此不再贅述。
[0028] 本發(fā)明的發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中，對于碳源和氮源的流加方式，連續(xù)流 加比間歇流加的發(fā)酵效果好，因此，本發(fā)明中碳源和氮源的流加方式均優(yōu)選為連續(xù)流加。
[0029] 本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用發(fā)酵罐進(jìn)行 發(fā)酵培養(yǎng)。為了有效利用發(fā)酵罐的產(chǎn)能，接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培 養(yǎng)基的體積優(yōu)選為發(fā)酵罐體積的40-60%，隨著流加碳源和流加氮源，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液的 體積逐漸增大，為了保證發(fā)酵罐中的空氣量，優(yōu)選為流加碳源和流加氮源至發(fā)酵罐體積的 70-80%時放料，為了保證放料后發(fā)酵罐中的菌種數(shù)量，不影響放料后發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)， 放料體積優(yōu)選為放料前發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積的5-10%。
[0030] 本發(fā)明中，優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)42-54小時后放罐。本發(fā)明中的放罐是指將發(fā)酵罐中的 發(fā)酵液全部從發(fā)酵罐中放出，即停止發(fā)酵。
[0031] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，由于放料和放罐的發(fā)酵液中均含有發(fā)酵產(chǎn)生的賴 氨酸，發(fā)酵結(jié)束后，應(yīng)該將放料的發(fā)酵液和放罐的發(fā)酵液混合用于后續(xù)提取賴氨酸。因此， 本發(fā)明中，"發(fā)酵結(jié)束后收集得到的發(fā)酵液"指的是發(fā)酵結(jié)束后，將放料的發(fā)酵液和放罐的 發(fā)酵液混合得到的混合物。
[0032] 由于本發(fā)明提供的發(fā)酵制備賴氨酸的方法相對于現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)主要在于初始 培養(yǎng)基中S0 42_的含量為0. 8-4. 8克/升，流加的氮源為硫酸銨和氯化銨，流加硫酸銨的量 使發(fā)酵過程中發(fā)酵液的OD值為0. 01-0. 3時，發(fā)酵液中SO42的含量為1-5克/升；發(fā)酵液 的OD值為0. 3-0. 85時，發(fā)酵液中S042_的含量為3-10克/升；發(fā)酵液的OD值為0. 85以上 時，發(fā)酵液中SO廣的含量為1-8克/升。因此對于本發(fā)明方法的其他條件和操作沒有特別 的要求。例如，對于發(fā)酵培養(yǎng)的條件可以采用本領(lǐng)域常用的條件，優(yōu)選為：溫度為35-38°C， 壓力為〇· 05-0.1 MPa，pH值為6. 7-7. 0,通氣量為0· 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/ 分鐘。
[0033] 本發(fā)明中，對賴氨酸發(fā)酵菌種的種類無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的菌種，優(yōu) 選為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和黃色短桿菌中的至少一種。
[0034] 本發(fā)明中，碳源優(yōu)選為淀粉質(zhì)原料糖化清液。
[0035] 本發(fā)明中，淀粉質(zhì)原料糖化清液既可以采用干法制糖工藝制備，也可以采用濕法 制糖工藝制備。從工藝簡單、設(shè)備投資少，生產(chǎn)成本較低的方面考慮，優(yōu)選通過干法制糖工 藝制備。干法制糖工藝是指淀粉質(zhì)原料不經(jīng)浸泡直接進(jìn)行破碎和酶解。
[0036] 干法制糖工藝可以包括：將淀粉質(zhì)原料粉碎，將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物調(diào)漿，并 加入淀粉酶對淀粉進(jìn)行第一次水解；對第一次水解產(chǎn)物進(jìn)行固液分離，并在得到的液相組 分中加入糖化酶進(jìn)行第二次水解，得到淀粉質(zhì)原料糖化清液。優(yōu)選地，粉碎使淀粉質(zhì)原料過 30目篩的通過率大于75%，更優(yōu)選過30目篩的通過率為100%。調(diào)漿的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知，但優(yōu)選地，調(diào)漿的方法可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物加入到水中混合均 勻，水的加入量使得到的漿液的波美度可以為9-17Β?°。術(shù)語"波美度"是表示溶液濃度的 一種方法，是通過波美比重計檢測溶液得到的度數(shù)。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明，在第一次水解中，以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計，淀粉酶的用量可以 為10-30酶活力單位，酶解的溫度可以為88-92°C，酶解的時間可以為90-120分鐘，酶解的 PH值可以為5. 5-6. 0。固液分離的條件沒有特別的限定，優(yōu)選地，固液分離的條件使得到的 液相組分中的固含量為19-22重量％，更優(yōu)選為20-21重量％。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明，在第二次水解中，以每克液相組分計，糖化酶的用量可以為110-130 酶活力單位，酶解的溫度可以為55-65°C，酶解的時間可以為420-600分鐘，酶解的pH值可 以為 4. 0-4. 5。
[0039] 本發(fā)明酶活力單位的定義為：在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫 克淀粉轉(zhuǎn)化為還原性糖所需的酶量為一個酶活力單位。
[0040] 淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述淀粉酶一般包括α -淀粉 酶、β-淀粉酶。
[0041] α -淀粉酶又稱淀粉1，4-糊精酶，它能夠任意地、不規(guī)則地切開淀粉鏈內(nèi)部的 α -1，4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生 產(chǎn)此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。
[0042] β -淀粉酶又稱淀粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從淀粉分子非還原性末端切開1，4-糖 苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用于淀粉的產(chǎn)物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和 內(nèi)孢霉產(chǎn)生。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用α -淀粉酶。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明，糖化酶優(yōu)選為α -1，4-葡萄糖水解酶。
[0045] 按照本發(fā)明，淀粉質(zhì)原料可以為本領(lǐng)域公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備賴氨 酸的含