5,5’-去氫二香草乙酮的漆酶催化合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物催化和生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體涉及一種5, 5' -去氫二香草乙酮的漆 酶催化合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 香草乙酮是從植物體內(nèi)分離出來(lái)的一種活性物質(zhì)，可特異性地抑制NADPH氧化酶 活性，具有抗氧化和抗炎活性，并被用于治療帕金森癥。在自然界，5,5' -去氫二香草乙酮 (Dehydrodiacetovanillone，CAS :29799-22-2)是香草乙酮的代謝產(chǎn)物，是超氧陰離子的捕 獲劑，被認(rèn)為比香草乙酮具有更高的活性，但該產(chǎn)品在生物體內(nèi)僅微量存在。
[0003] 目前以香草乙酮為原料合成5, 5'-去氫二香草乙酮的方法主要有兩種。一種是化 學(xué)法，采用過(guò)硫酸鹽為氧化劑，以硫酸亞鐵為引發(fā)劑，在100° C時(shí)反應(yīng)5min。反應(yīng)結(jié)束時(shí)， 產(chǎn)物因不溶于水而沉淀下來(lái)，但同時(shí)一些鐵鹽、過(guò)硫酸鹽和硫酸鹽也會(huì)一起沉淀下來(lái)。后續(xù) 需要用NH 4OH或NaOH溶液將沉淀物重新溶解，再用HCl溶液進(jìn)行再沉淀，以去除雜質(zhì)，最后 用沸水多次洗滌沉淀，產(chǎn)物得率約為60%。該工藝中，由于過(guò)硫酸鹽氧化性較強(qiáng)，經(jīng)常會(huì)造成 側(cè)鏈斷裂，從而形成低分子量物質(zhì)；同時(shí)可能會(huì)有三聚體生成。可見(jiàn)，化學(xué)合成法雖然反應(yīng) 時(shí)間短，但后續(xù)純化較為復(fù)雜，需要消耗較多酸堿等化學(xué)藥品，同時(shí)所得產(chǎn)品純度和得率均 較低。另外一種合成少量5, 5' -去氫二香草乙酮的方法是利用過(guò)氧化物酶，最典型的是利 用辣根過(guò)氧化物酶，以H2O2為氧化劑，在pH=4時(shí)反應(yīng)，通過(guò)過(guò)濾洗滌，得到產(chǎn)品。
[0004] 漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，氧化還原電位較低，可氧化單酚、雙酚、氨基酚和 芳香胺化合物，可以直接以O(shè) 2為電子傳遞體實(shí)現(xiàn)氧化還原作用，反應(yīng)后唯一的副產(chǎn)物就是 水。重組漆酶是利用分子生物技術(shù)，通過(guò)基因重組表達(dá)制備得到的產(chǎn)品，具有純度高、活性 尚、氧化還原電位尚等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種環(huán)境友好的、工藝簡(jiǎn)單、效率高、生產(chǎn)成本低的漆酶催化制備 5, 5' -去氫二香草乙酮的方法，為其進(jìn)一步的生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0006] -種5, 5' -去氫二香草乙酮的漆酶催化合成方法，包括如下步驟： (1) 將香草乙酮溶解于水或pH為3. 5~6.0的緩沖溶液中，配制成溶液，控制溫度在 20~60° C，加入重組漆酶，于搖床中反應(yīng)； (2) 反應(yīng)結(jié)束后靜置沉淀，洗滌沉淀物，于不高于50°C下干燥，得到產(chǎn)品5, 5' -去氫二 香草乙酮。
[0007] 步驟（1)中，所述的香草乙酮溶液的摩爾濃度為33 mmol/L ;搖床轉(zhuǎn)速為120~150 rpm，反應(yīng)時(shí)間大于4 h ;所述重組漆酶用量為3. 0~6. 0 U/mol香草乙酮。
[0008] 步驟（1)中，所述緩沖液選自醋酸-醋酸鈉、磷酸-磷酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、酒 石酸-酒石酸鈉、琥珀酸-琥珀酸鈉、丙二酸-丙二酸鈉水溶液中的一種。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是： 1. 反應(yīng)原料和重組漆酶本身均為天然產(chǎn)物，無(wú)毒，反應(yīng)過(guò)程中利用空氣中的氧，不需要 添加其他氧化劑； 2. 反應(yīng)條件溫和，室溫下即可進(jìn)行； 3. 產(chǎn)物單一，易于純化，純化步驟中不涉及酸堿等化學(xué)藥劑，產(chǎn)品純度高。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1是原料香草乙酮（a)和實(shí)施例1 (b)、實(shí)施例2 (C)產(chǎn)品的HPLC圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] (3)本發(fā)明的重組漆酶按參考文獻(xiàn)（Xie，H. F.，Li, Q.，Wang, Μ. M.，and Zhao, L. G. (2013) Production of a Recombinant Laccase from Pichia pastoris and Biodegradation of Chlorpyrifos in a Laccase/Vani11 in System, J Microbiol 沒(méi)864-871.)中方法制備并純化。
[0012] 本發(fā)明所采用的漆酶酶活的測(cè)定方法為：采用1cm光程比色皿，利用紫外分光光 度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，檢測(cè)波長(zhǎng)為465nm。緩沖液為50mM的pH 5. 0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液， 2mL反應(yīng)體系中含有I. 8 mL緩沖液，0. 9 mL 2. 5 mM愈創(chuàng)木酚溶液和0.1 mL經(jīng)過(guò)一定稀 釋的漆酶。測(cè)定在30° C進(jìn)行，記錄3 min吸光度A的變化，計(jì)算得到平均每分鐘吸光度 的變化值Δ A，按下式計(jì)算漆酶活性，其中吸光系數(shù)為1. 2 ' IO4 if1 X cnT1:
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種5, 5' -去氫二香草乙酮的漆酶催化合成方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將香草乙酮溶解于水或pH為3. 5~6.O的緩沖溶液中，配制成溶液，控制溫度在 20~60°C，加入重組漆酶，于搖床中反應(yīng)； (2) 反應(yīng)結(jié)束后靜置沉淀，洗滌沉淀物，于不高于50°C下干燥，得到產(chǎn)品5, 5' -去氫二 香草乙酮。
2. 如權(quán)利要求1所述的5, 5' -去氫二香草乙酮的漆酶催化合成方法，其特征在于，所 述的香草乙酮溶液的摩爾濃度為33mmol/L。
3. 如權(quán)利要求1所述的5, 5' -去氫二香草乙酮的漆酶催化合成方法，其特征在于，搖 床轉(zhuǎn)速為120~150rpm，反應(yīng)時(shí)間大于4h。
4. 如權(quán)利要求1所述的5, 5' -去氫二香草乙酮的漆酶催化合成方法，其特征在于，重 組漆酶用量為3. 0~6. 0U/mol香草乙酮。
5. 如權(quán)利要求1所述的5, 5' -去氫二香草乙酮的漆酶催化合成方法，其特征在于，緩 沖液選自醋酸-醋酸鈉、磷酸-磷酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、酒石酸-酒石酸鈉、琥珀酸-琥 珀酸鈉、丙二酸-丙二酸鈉水溶液中的一種。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種5,5’-去氫二香草乙酮的漆酶催化合成方法。包括如下步驟：將香草乙酮溶解于水或pH為3.5~6.0的緩沖溶液中，配制成溶液，控制溫度在20~60°C，加入重組漆酶，于搖床中反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后靜置沉淀，洗滌沉淀物，于不高于50℃下干燥，得到產(chǎn)品5,5’-去氫二香草乙酮。本發(fā)明的反應(yīng)原料和重組漆酶本身均為天然產(chǎn)物，無(wú)毒，反應(yīng)過(guò)程中利用空氣中的氧，不需要添加其他氧化劑；本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，室溫下即可進(jìn)行，產(chǎn)物單一，易于純化，純化步驟中不涉及酸堿等化學(xué)藥劑，產(chǎn)品純度高。
【IPC分類(lèi)】C12P7-26
【公開(kāi)號(hào)】CN104726504
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510142163
【發(fā)明人】謝慧芳, 趙林果, 李琦, 惠娟, 沈錦優(yōu)
【申請(qǐng)人】南京理工大學(xué), 南京林業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年3月27日