專利名稱：：賴氨大黃酸的制備工藝及其在腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及大黃酸與賴氨酸形成穩(wěn)定的鹽一賴氨大黃酸(rheinlysate)、其制備工藝和在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。技術(shù)背景-大黃酸(Rhein，4.5-dihydroxyanthraquinone,簡稱RH)屬單蒽核類l，8_二羥基蒽醌衍生物，是從大黃、何首烏、虎杖等多種傳統(tǒng)中藥分離提純的有效成分。大黃酸含有二個(gè)羥基和一個(gè)羧基，極性較強(qiáng)，具有電化學(xué)氧化還原性質(zhì)。大黃酸的藥理作用主要包括抗腫瘤、抗炎、抗菌及調(diào)解腎功能等方面。1、抗腫瘤作用有文獻(xiàn)報(bào)道，大黃酸對黑色素瘤、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、艾氏腹水癌、PM8白血病有抑制作用。其通過改變細(xì)胞及細(xì)胞骨架膜的功能，抑制腫瘤細(xì)胞葡萄糖的攝入，抑制葡萄糖的磷酸化作用，并造成線粒體功能障礙，從而影響腫瘤細(xì)胞的糖代謝和耗氧量。大黃酸對人肝癌細(xì)胞和小鼠腹水癌細(xì)胞的殺傷作用主要通過抑制腫瘤細(xì)胞DNA模板，干擾DNA模板功能，從而使腫瘤細(xì)胞的生長受到明顯抑制[郭美姿等，國外醫(yī)學(xué)中醫(yī)藥分冊，2002，24(3):139—143]。大黃酸能夠抑制人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞株Colo-16細(xì)胞增殖周期的Gl期向S期轉(zhuǎn)變，其在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)也誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[徐麗敏等，中華皮膚科雜志，2000，21(1):47—48]。大黃酸還能顯著增加絲裂霉素(腦C)對KB(人口腔癌細(xì)胞株)細(xì)胞、BEL-7402(人肝癌細(xì)胞株)細(xì)胞和MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞株)細(xì)胞的增殖抑制作用[黃云紅等，藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36(5):334_338]。大黃酸合并絲裂霉素與單獨(dú)用藥相比，可明顯增加KB細(xì)胞的凋亡,提示大黃酸有可能作為生化調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于腫瘤聯(lián)合化療。2、抗炎作用大黃酸可以抑制IL-12的表達(dá)，對炎癥介質(zhì)白三烯的合成有較強(qiáng)的抑制作用。大黃酸抑制IL-1和IL-1誘導(dǎo)的N0的合成，最終減少關(guān)節(jié)軟骨的破壞。美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了大黃酸的前體藥二乙酰大黃酸用于治療關(guān)節(jié)炎[DomagalaFetal，Biorheology，2006:43(3-4):577-87]。此外，有報(bào)道稱，大黃酸對胰腺炎也具有治療作用。3、抗菌作用大黃酸對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、淋球菌、白喉、枯草桿菌、痢疾桿菌、炭疽桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌等具有明顯的抑制作用。還有報(bào)道稱其對新型隱球菌、白色念珠菌、煙曲菌、須發(fā)霉等真菌有抑制作用，其最低抑制濃度為25250ug/mL，其抑菌機(jī)制為抑制菌體糖和糖代謝中間產(chǎn)物的氧化和脫氫，并與DNA結(jié)合，干擾其模板功能，抑制蛋白和核酸的合成[郭美姿等，國外醫(yī)學(xué)中醫(yī)藥分冊，2002，24(3)139—143]。4、除以上作用外，大黃酸還對血管平滑肌的增殖有抑制作用，為其在抗動(dòng)脈粥樣硬化方面提供了理論支持，其可以抑制血管生成[專利申請?zhí)?2159686.7];大黃酸還具有降糖、調(diào)脂、改善胰島素抵抗、減少尿蛋白排泄等作用[劉凱等，中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22(9):1732—1734]?？傊?，大黃酸具有廣泛的藥理活性。但是，至今仍然沒有應(yīng)用于臨床，主要原因是其水溶性極差，而且口服大黃酸會(huì)被腸道內(nèi)的細(xì)菌代謝成為無活性的蒽酮類化合物[DeWitteP等，Bi叩hartnDrugDispos，1992，13:243-53]。而解決大黃酸臨床應(yīng)用的關(guān)鍵就是提高其水溶性。盡管很多科研人員進(jìn)行了不懈的努力，對大黃酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得了多種活性化合物，然而其致命的缺陷一水溶性極差依然沒有得到有效改善，至今仍然沒有開發(fā)出用于臨床的大黃酸新藥。本實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行大黃酸抗腫瘤研究過程中，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了賴氨酸能夠增加大黃酸在水中的溶解度，進(jìn)而合成了大黃酸賴氨酸鹽，并開展了一系列生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。本發(fā)明所涉及的賴氨大黃酸(rheinlysate)新化合物，迄今尚未見有國內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明的目的之一是，提供一種賴氨大黃酸(rheinlysate)新化合物；本發(fā)明的目的之二是，提供一種賴氨大黃酸(rheinlysate)新化合物的制備方法；本發(fā)明的目的之三是，提供賴氨大黃酸(rheinlysate)新化合物在臨床上的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明提供了賴氨大黃酸鹽新化合物，其結(jié)構(gòu)如式l所示:OHOOH式(1)本發(fā)明所述的賴氨大黃酸鹽是一種紫色結(jié)晶狀物質(zhì)，分子式為C21H22N208，分子量為430，其特征是大黃酸的羧基與賴氨酸的氨基結(jié)合形成穩(wěn)定鹽的結(jié)構(gòu)，水中溶解度為1.35g，紫外檢測在230nm和260nm處出現(xiàn)兩個(gè)矮峰，HPLC檢測在2.035分鐘時(shí)出現(xiàn)吸收峰，峰高為299760,曲線下面積為2686418，曲線下面積百分比為82.94%，紅外色譜檢測出現(xiàn)明顯的氨鹽峰(2937.0cm—1)和羧基離子強(qiáng)峰(1583.6cm—'和1398.9cnf1)。本發(fā)明還提供了賴氨大黃酸的制備方法，其工藝步驟是向反應(yīng)瓶內(nèi)加入適量水，稱取一定量大黃酸投入反應(yīng)瓶，加入磁力攪拌子攪拌均勻，再向反應(yīng)瓶中緩慢加入賴氨酸適量，攪拌，直到反應(yīng)液變得澄清透明為止；反應(yīng)溫度控制在2535。C之間，反應(yīng)時(shí)間在448小時(shí)范圍內(nèi)；將反應(yīng)瓶放入冰水混合物中攪拌，并緩慢滴加丙酮或者無水乙醇，滴加時(shí)間控制在2040分鐘，直至溶液出現(xiàn)紫色結(jié)晶，停止加入丙酮或者無水乙醇析晶；加入的析晶溶液丙酮或無水乙醇的量為整個(gè)反應(yīng)體積的6090%之間；將反應(yīng)液放入一800。C的冰箱析出晶體，析晶2448小時(shí)，然后把反應(yīng)液倒出，負(fù)壓干燥反應(yīng)瓶，反應(yīng)瓶干燥后再放入干燥器繼續(xù)干燥4小時(shí)，刮下反應(yīng)瓶上的晶體，通過抽慮或者離心的方法對結(jié)晶產(chǎn)物進(jìn)行分離，用丙酮或者無水乙醇洗滌數(shù)次，直至洗液無色，釆用室溫負(fù)壓干燥或者室溫干燥器內(nèi)進(jìn)行干燥。干燥產(chǎn)物通過紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜(HPLC)、紅外色譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。由于大黃酸不溶于水，可以通過觀察大黃酸沉淀的消失來控制反應(yīng)中賴氨酸加入量，所以本發(fā)明所采用反應(yīng)流程的特點(diǎn)是先加入大黃酸，然后緩慢加入賴氨酸使沉淀溶解，加入的大黃酸與賴氨酸的摩爾比在1:21:4之間。繼續(xù)反應(yīng)448小時(shí)目的是為了使反應(yīng)生成的結(jié)晶充分完全。在進(jìn)行結(jié)晶析出賴氨大黃酸時(shí)，要緩慢加入丙酮或者無水乙醇，因?yàn)榧尤脒^快會(huì)導(dǎo)致主要析出產(chǎn)物為大黃酸。加入丙酮或者無水乙醇的量為整個(gè)反應(yīng)體積的6090%，最佳丙酮的量在7080%之間。加入丙酮或者無水乙醇的速度和比例是反應(yīng)成功的關(guān)鍵步驟，一般在2040分鐘加完為宜。將反應(yīng)液放入一80(TC的冰箱的目的是為了能夠析出更多結(jié)晶。最佳的析晶溫度控制在一40一2(TC之間。本發(fā)明所提供的反應(yīng)產(chǎn)物賴氨大黃酸水溶性佳，在水中的溶解度為1.35g。大黃酸在無水乙醇中微溶，可以用無水乙醇對結(jié)晶進(jìn)行反復(fù)的洗滌，本發(fā)明采用洗滌，離心，再洗滌，再離心，最后干燥的工藝進(jìn)行結(jié)晶的純化。采用本發(fā)明合成出的賴氨大黃酸純度高，晶體穩(wěn)定性好，不加任何穩(wěn)定劑就可以達(dá)到作為商品使用和儲(chǔ)存的目的。本發(fā)明通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，還提供了賴氨大黃酸在臨床治療中的應(yīng)用。體外研究結(jié)果表明，賴氨大黃酸對體外培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，對HER-2高表達(dá)的SKBR-3細(xì)胞作用更明顯；通過MTT方法研究發(fā)現(xiàn)，賴氨大黃酸能夠協(xié)同紫杉醇、諾維苯、阿霉素、甲氨喋呤發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用；通過Westernblot方法研究發(fā)現(xiàn)，賴氨大黃酸對p-EGFR、p-HER-2、HER-2蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用，并且通過抑制Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。體內(nèi)研究結(jié)果表明，賴氨大黃酸對小鼠H22肝癌和MCF-7裸小鼠移植瘤模型腫瘤生長有明顯的抑制作用。此外研究還發(fā)現(xiàn)，賴氨大黃酸可以協(xié)同紫杉醇抑制腫瘤生長，并且具有大黃酸所具有的藥理活性如抗炎、抗菌及調(diào)解腎功能等作用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果在于，采用所述賴氨大黃酸的制備工藝，解決了產(chǎn)物穩(wěn)定性及水溶性的最大技術(shù)難題，而且由于工藝簡單，成本低廉，符合環(huán)保要求，利于批量生產(chǎn)，從而為使其盡快推上臨床創(chuàng)造了良好條件。圖l賴氨酸、大黃酸、賴氨大黃酸紫外吸光度分析圖其中l(wèi)一賴氨大黃酸；2—大黃酸；3—賴氨酸；圖2HPLC圖譜其中A—賴氨酸；B—大黃酸；C一賴氨大黃酸；圖3賴氨酸紅外色譜圖6其中賴氨酸氨基的特征峰出現(xiàn)在3361.8cm—'處；圖4大黃酸紅外色譜圖其中大黃酸羧基的特征峰出現(xiàn)在1693.2cnT處；圖5賴氨大黃酸紅外色譜圖其中賴氨大黃酸的氨鹽特征峰出現(xiàn)在2937.0cnf'處；羧基離子強(qiáng)峰出現(xiàn)在1583.6cm—'和1398.9cm—'兩處；圖6賴氨大黃酸抑制乳腺癌細(xì)胞增殖圖其中_MCF-7細(xì)胞；—SKBR-3細(xì)胞；▲一MDA-MB-231細(xì)胞；圖7賴氨大黃酸對表皮生長因子和MAPK通路影響的WesternBlot圖其中0、10、20、40、80、160—賴氨大黃酸的劑量、單位umol/L;1一EGFR蛋白表達(dá)水平；2—HER-2蛋白表達(dá)水平；3—k-Ras蛋白表達(dá)水平；4一MEK蛋白表達(dá)水平；5—ERK蛋白表達(dá)水平；6—ACTIN蛋白表達(dá)水平；7—EGFR蛋白磷酸化水平；8—HER-2蛋白磷酸化水平；9一c-Raf蛋白表達(dá)水平；10—MEK蛋白磷酸化水平；ll一ERK蛋白磷酸化水平；12—ACTIN蛋白表達(dá)水平；圖8賴氨大黃酸抑制由紫杉醇引起的酪氨酸激酶活性增加WesternBlot圖其中A—空白組；B—紫杉醇10—9mol/L劑量組；C一紫杉醇l(Tmol/L劑量組;D—紫杉醇l(Tiiiol/L劑量組；E—紫杉醇l(Tmol/L劑量組；F—紫杉醇10—8mol/L和賴氨大黃酸80umol/L劑量聯(lián)合組；G—紫杉醇10—^Ql/L和賴氨大黃酸80"mol/L劑量聯(lián)合組；H—紫杉醇10—6mol/L和賴氨大黃酸80nmol/L劑量聯(lián)合組；1一EGFR蛋白磷酸化水平；2—EGFR蛋白表達(dá)水平；3—MEK蛋白表達(dá)水平；4—MEK蛋白磷酸化水平；5_k-Ras蛋白表達(dá)水平；6—c-Raf蛋白表達(dá)水平；7-c-Raf蛋白磷酸化水平；8—ERK蛋白磷酸化水平；9一ACTIN蛋白表達(dá)水平；具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。〈實(shí)施例一〉:賴氨大黃酸的制備l將20mg大黃酸(購自南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司)加入到50ml茄形瓶中，并向茄形瓶中加入一個(gè)攪拌子和5ml雙蒸水，在磁力攪拌器上攪拌5分鐘，然后稱取30mg賴氨酸(購自北京科海軍舟生物科技中心)，分批緩慢加入到茄形瓶中，邊加入邊觀察大黃酸溶解情況，加入時(shí)間控制在30分鐘，加完30mg賴氨酸后，反應(yīng)液中的大黃酸全部溶解，攪拌4個(gè)小時(shí)，溫度控制在32'C。待溶液反應(yīng)4個(gè)小時(shí)后把茄形瓶放入冰浴中，緩慢地向反應(yīng)液中加入丙酮，大約6滴/分鐘，邊滴加邊觀察反應(yīng)液的變化。觀察到溶液出現(xiàn)紫色晶體析出，停止加入丙酮，此時(shí)加入丙酮為16.6ml，加入時(shí)間30分鐘，然后把茄形瓶放入4'C冰箱中過夜，次日觀察到瓶壁上析出了一層紫色晶體，倒出反應(yīng)液于一個(gè)新的茄形瓶中備用，將此反應(yīng)瓶真空干燥，用刮刀刮下結(jié)晶，并用無水乙醇清洗3次，每次采用離心的方法除去洗液，三次洗滌后，洗液幾乎無色。將產(chǎn)物在干燥器中干燥過夜，稱重得產(chǎn)物5.3mg。在干燥器中保存?zhèn)溆?。然后將保留的反?yīng)液放入一2(TC冰箱中過夜，次日同樣觀察到紫色晶體析出，按照上面分離純化的方法得產(chǎn)物2.6mg。繼續(xù)再將反應(yīng)液放入一4(TC冰箱中過夜，同樣得到產(chǎn)物1.8mg。最終共得到產(chǎn)物9.7mg，產(chǎn)率為48.5%?！磳?shí)施例二〉:賴氨大黃酸的制備2將20mg大黃酸加入到50ml茄形瓶中，并向茄形瓶中加入一個(gè)攪拌子和5ml雙蒸水，在磁力攪拌器上攪拌5分鐘，然后稱取30mg賴氨酸，分批緩慢加入到茄形瓶中，邊加邊觀察大黃酸溶解情況，加入時(shí)間控制在40分鐘，加完30mg賴氨酸后，反應(yīng)液中的大黃酸全部溶解，攪拌過夜，溫度控制在32'C。反應(yīng)24小時(shí)后緩慢的向反應(yīng)液中加入丙酮，大約6滴/分鐘，邊滴加邊觀察反應(yīng)液的變化，觀察到溶液出現(xiàn)紫色晶體析出，此時(shí)加入丙酮為16ml，加入時(shí)間30分鐘，再繼續(xù)向反應(yīng)液中緩慢加入丙酮，紫色晶體逐漸增多，加入20ml丙酮后停止加入，然后把茄形瓶放入一4(TC冰箱中過夜，次日觀察到瓶壁上析出了一層很厚的紫色晶體，倒出反應(yīng)8液，把反應(yīng)瓶真空干燥，用刮刀刮下結(jié)晶，并用無水乙醇清洗3次，每次采用離心的方法除去洗液，三次洗滌后，洗液幾乎無色。把產(chǎn)物置于干燥器中干燥過夜并保存?zhèn)溆?，稱重得產(chǎn)物16.8mg，產(chǎn)率為84%。<實(shí)施例三>:賴氨大黃酸的制備3將20mg大黃酸加入到50ml茄形瓶中，并向茄形瓶中加入一個(gè)攪拌子和5ml雙蒸水，在磁力攪拌器上攪拌5分鐘，然后稱取30mg賴氨酸，分批緩慢加入到茄形瓶中，邊加邊觀察大黃酸溶解情況，加入時(shí)間控制在30分鐘，加完30mg賴氨酸后，反應(yīng)液中的大黃酸全部溶解，攪拌過夜，溫度控制在30'C。反應(yīng)24小時(shí)后緩慢的向反應(yīng)液中加入無水乙醇，大約6滴/分鐘，邊滴加邊觀察反應(yīng)液的變化，觀察到溶液出現(xiàn)紫色晶體析出，此時(shí)加入無水乙醇為17.6ml，加入時(shí)間30分鐘，再繼續(xù)向反應(yīng)液中緩慢加入無水乙醇，紫色晶體逐漸增多，加入22ml無水乙醇后停止加入，然后把茄形瓶放入一40'C冰箱中過夜，次日觀察到瓶壁上析出了一層很厚的紫色晶體，倒出反應(yīng)液，把反應(yīng)瓶真空干燥，用刮刀刮下結(jié)晶，并用無水乙醇清洗3次，每次采用離心的方法除去洗液，三次洗滌后，洗液幾乎無色。置產(chǎn)物于干燥器中干燥過夜并保存?zhèn)溆茫Q重得產(chǎn)物14.8mg，產(chǎn)率為74%。<實(shí)施例四>:通過紫外分光光度計(jì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分別配制賴氨酸lmg/mL水溶液，產(chǎn)物100iig/n]L水溶液，大黃酸62.5wg/mL甲醇溶液，測定溶液在不同波長的吸光度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，賴氨酸在230nm和260nm處出現(xiàn)兩個(gè)尖峰，而產(chǎn)物的兩個(gè)尖峰變?yōu)閮蓚€(gè)很小的矮峰。此外，大黃酸在350rini500nm范圍內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)寬峰，而產(chǎn)物沒有此峰。從總體來看，產(chǎn)物吸光度曲線比較平滑，而大黃酸吸光度曲線比較陡峭(圖l)。從圖上觀察，產(chǎn)物的吸光度曲線與賴氨酸吸光度曲線差別明顯。通過三種物質(zhì)的吸光度結(jié)果來看，產(chǎn)物不是大黃酸也不是賴氨酸，而是新的化合物?！磳?shí)施例五〉:通過HPLC法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分別配制大黃酸lmg/mL甲醇溶液，賴氨酸lmg/mL水溶液，產(chǎn)物lmg/mL水溶液。在WatersDelta600高效液相色譜儀上，使用C,s100A5um4.6X250nmWaters色譜柱，流動(dòng)相為乙睛0.05%TFA(55:45)，流速O.8ml/min，檢測波長254nm。結(jié)果表明，產(chǎn)物在2.035分鐘時(shí)出現(xiàn)吸收峰，峰高為299760，曲線下面積為2686418，曲線下面積百分比為82.94%。賴氨酸在2.M7分鐘時(shí)出現(xiàn)吸收峰，峰高3190，曲線下面積36058，曲線下面積百分比為87.62%。可以看出，產(chǎn)物雖然與賴氨酸出峰時(shí)間比較接近，分別為2.035分鐘和2.147分鐘，但是產(chǎn)物的峰高和曲線下面積是賴氨酸的100倍左右。由此可以判斷，產(chǎn)物不是賴氨酸。由大黃酸的HPLC結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，大黃酸的出峰時(shí)間在14.727分鐘，峰高為127325，曲線下面積為2121370，曲線下面積百分比為97.63%，由此可以判斷，產(chǎn)物也不是大黃酸，而是新的化合物(圖2)。根據(jù)反應(yīng)物和反應(yīng)條件，初步推斷為賴氨大黃酸?！磳?shí)施例六〉:通過紅外色譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與大黃酸和賴氨酸的色譜圖相比，新產(chǎn)物不存在游離氨基峰(36003250cnf')，出現(xiàn)明顯的氨鹽峰(2937.0cnf1)，出現(xiàn)羧基離子強(qiáng)峰(1583.6cm—'和1398.9cnf1)，游離羧基峰(1693.2cm—"消失(圖3、4、5)。由此可以推斷，應(yīng)用此種方法所得結(jié)晶產(chǎn)物為賴氨大黃酸。〈實(shí)施例七〉:賴氨大黃酸的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)-采用MTT方法進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，賴氨大黃酸對MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，ICs。分別為95、80、11Oumol/L。這與用DMSO作為溶劑，采用MTT方法測得的大黃酸對上述細(xì)胞的IQ,值相同，說明賴氨大黃酸與大黃酸具有相同的體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用(圖6)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，賴氨大黃酸與紫杉醇或者諾維苯聯(lián)合應(yīng)用，可以抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞系增殖，二者的協(xié)同作用非常顯著CDI《0.70(表l、2)。另外，在SKBR-3乳腺癌細(xì)胞系，賴氨大黃酸與阿霉素或者甲氨喋呤聯(lián)合應(yīng)用，在某些劑量也出現(xiàn)了很好的協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用CDI〈0.85(表3、4)。表l賴氨大黃酸與諾維苯聯(lián)合應(yīng)用對MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。l(T7mol/Ll(T8mol/L10-9mol/Ll(rl()mol/L10—umol/L(CDI)(CDI)(CDI)(CDI)(CDI)80ymol/L0.52(1,03)0.42(0.76)0.52(0.90)0.50(0.87)0.48(0.87)0.5540umol/L0.83(0,79)0.69(0.60)0.85(0.70)0.85(0,70)0.93(0.81)1.1520umol/L0.69(0.73)0.85(0.82)0.87(0.80)0.93(0.85)0.72(0.69)1.04_2_^_____i.oo注表內(nèi)數(shù)值是用藥組與對照組比較的相對吸光度值，其中括號內(nèi)為CDI值。表2賴氨大黃酸與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。10°mo/L10.。mo/L10.'mol/Ll(Tsmol/L10"mol/L0(CDI)(CDI)(CDI)(CDI)(CDI)80umol/L0.11(1.11)0.12(0.41)0.16(0.38)0.27(0.54)0,37(0,76)0.5540umol/L0.22(1.10)0.39(0.75)0.47(0,63)0.63(0.71)0.81(0.92)1.0020umol/L0.17(0.97)0.51(0.96)0.64(0.82)0.80(0.87)1.04(1.14)1.03^___^_2^2_0.881.00注表內(nèi)數(shù)值是用藥組與對照組比較的相對吸光度值，其中括號內(nèi)為CDI值。表3賴氨大黃酸與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對SKBR-3乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>00.150.400.850.941.00注表內(nèi)數(shù)值是用藥組與對照組比較的相對吸光度值，其中括號內(nèi)為CDI值。表4賴氨大黃酸與甲氨喋呤聯(lián)合應(yīng)用對SKBR-3乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注表內(nèi)數(shù)值是用藥組與對照組比較的相對吸光度值，其中括號內(nèi)為CDI值。<實(shí)施例八>:賴氨大黃酸抑制EGFR家族酪氨酸激酶活性實(shí)驗(yàn)賴氨大黃酸能抑制表皮生長因子受體家族EGFR和HER-2的酪氨酸激酶活性，并且抑制HER-2蛋白的表達(dá)，而對EGFR蛋白表達(dá)沒有影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其通過抑制Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖(圖7)。賴氨大黃酸抑制由紫杉醇引起的表皮生長因子受體家族EGFR的酪氨酸激酶活性增加，以及引起的Ras-Raf-MEK-ERK信號通路激活，從而抑制耐藥細(xì)胞的產(chǎn)生(圖8)。〈實(shí)施例九〉:賴氨大黃酸的體內(nèi)抗腫瘤活性研究(一)、賴氨大黃酸抑制小鼠肝癌H22腫瘤生長1材料與方法l.l藥品與試劑98%的大黃酸，分子量284，棕黃色粉末，購自南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，常溫干燥保存，臨用時(shí)以氯化鈉注射液溶解與稀釋。賴氨酸(solarbio)，購自北京科海軍舟生物科技中心。1.2動(dòng)物昆明小鼠，體重1822g雌雄各半。購自北京維通利華公司。1.3賴氨大黃酸對小鼠肝癌&2腫瘤生長的抑制作用取小鼠腹腔懸液傳代的肝癌H22細(xì)胞，每只小鼠腋窩皮下接種200萬個(gè)細(xì)胞(0.2ml)。實(shí)驗(yàn)按照體重隨機(jī)分為6組，對照組、賴氨大黃酸50mg/kg組、賴氨大黃酸100mg/kg組、紫杉醇10rag/kg組、紫杉醇10mg/kg組+賴氨大黃酸50mg/kg組、紫杉醇10mg/kg組+賴氨大黃酸100mg/kg組，每組10只，雌雄各半。給藥方案從腋窩接種腫瘤后24小時(shí)開始腹腔給藥，紫杉醇每周給藥一次，共給予兩次，賴氨大黃酸隔天給藥一次，共給予10天，對照組每天腹腔注射等體積的生理鹽水，停藥一天，然后處死小鼠稱體重，分離腫瘤稱瘤重。2結(jié)果單獨(dú)腹腔注射賴氨大黃酸抑制小鼠肝癌H22模型腫瘤生長，50mg/kg、100mg/kg賴氨大黃酸的腫瘤生長抑制率分別為33%和39%，與紫杉醇聯(lián)用協(xié)同抑制腫瘤生長，50mg/kg、100mg/kg賴氨大黃酸與紫杉醇協(xié)同指數(shù)CDI值分別為0.68和0.83。(表5)_表5賴氨大黃酸對小鼠肝癌H22腫瘤生長抑制作用(f±s)_iij動(dòng)物數(shù)體重改變g~~平均瘤重g抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注求與對照組比較P〈0.01;A與紫杉醇組比較P〈0.01。用l.料與方法l.l藥品與試劑98%的大黃酸，分子量284，棕黃色粉末，購自南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，常溫干燥保存，臨用時(shí)以氯化鈉注射液溶解與稀釋。賴氨酸(solarbio)，購自北京科海軍舟生物科技中心。1.2動(dòng)物BALB/c小鼠，體重1822g雌性。購自北京維通利華公司。1.3賴氨大黃酸對MCF-7裸小鼠移植瘤模型腫瘤生長抑制作用體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，接種于BALB/c裸小鼠左側(cè)腋窩皮下，每只小鼠腋窩皮下接種500萬個(gè)細(xì)胞(0.2ml)。待腫瘤長到lXlXlcr^時(shí)取出，切成1X1X1咖3然后分別接種于小鼠左側(cè)腋窩皮下，接種1周后根據(jù)腫瘤大小隨機(jī)分組，生理鹽水組、紫杉醇10mg/kg組、賴氨大黃酸50mg/kg組、賴氨大黃酸100mg/kg組、紫杉醇10mg/kg十賴氨大黃酸50mg/kg組、紫杉醇10mg/kg+賴氨大黃酸100mg/kg組。給藥方案紫杉醇和賴氨大黃酸均采用腹腔注射給藥，紫杉醇每周給藥一次，共給藥2次，賴氨大黃酸每周給藥2次，共給藥4周，停藥1周，然后處死小鼠取出腫瘤，稱小鼠體重和瘤重，每周測量2次小鼠腫瘤體積，每周稱量一次小鼠體重。2結(jié)果單獨(dú)腹腔注射賴氨大黃酸抑制MCF-7裸鼠移植模型腫瘤生長，50mg/kg、100mg/kg賴氨大黃酸的腫瘤生長抑制率分別為31%和46%，100mg/kg賴氨大黃酸與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同抑制腫瘤生長，協(xié)同作用指數(shù)CDI值為0.67(表6)。表6賴氨大黃酸對小鼠移植性乳腺癌腫瘤生長抑制作用(7±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>05。權(quán)利要求1.一種賴氨大黃酸新化合物，其結(jié)構(gòu)如式(1)所示id="icf0001"file="S2008100890258C00011.gif"wi="81"he="24"top="61"left="68"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>式(1)其特征是，所述化合物為一種紫色結(jié)晶狀物質(zhì)，分子式為C21H22N2O8，分子量為430，系大黃酸的羧基與賴氨酸的氨基結(jié)合形成的穩(wěn)定鹽的結(jié)構(gòu)。2、制備如權(quán)利要求1所述賴氨大黃酸的方法，其歩驟是先向反應(yīng)瓶中加入一定量的水，再分別投入大黃酸、賴氨酸，根據(jù)大黃酸溶解情況，控制賴氨酸的加入量，反應(yīng)溫度2535'C，反應(yīng)時(shí)間448小時(shí)；將反應(yīng)瓶放入冰水混合物中攪拌，緩慢滴加丙酮或無水乙醇，滴加時(shí)間控制在2040分鐘，丙酮或無水乙醇占整個(gè)反應(yīng)體系的6090%;將反應(yīng)液置入一800'C冰箱析出晶體，析晶2448小時(shí)，收集結(jié)晶并用無水乙醇對結(jié)晶進(jìn)行反復(fù)洗滌，負(fù)壓干燥，陰涼，保存?zhèn)溆谩?、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，在水溶液中加入大黃酸與賴氨酸的摩爾比為1:21:4。4、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，反應(yīng)溫度為32'C，反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)，結(jié)晶析晶時(shí)，滴加丙酮或者無水乙醇的速度為6滴/分鐘，丙酮或者無水乙醇占整個(gè)反應(yīng)體系的80%,在賴氨大黃酸結(jié)晶析出時(shí)，溫度控制為一4(TC。5、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，通過抽慮或者離心的方法對結(jié)晶產(chǎn)物進(jìn)行分離，用丙酮或者無水乙醇對結(jié)品產(chǎn)物進(jìn)行反復(fù)洗滌純化，直至洗液無色，采用室溫負(fù)壓干燥或者室溫干燥器內(nèi)進(jìn)行干燥。6、權(quán)利要求1所述賴氨大黃酸鹽在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及賴氨大黃酸及其制備方法和在腫瘤治療中的應(yīng)用，其特征是，通過水溶液中大黃酸的羧基與賴氨酸的氨基形成鹽的結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)大黃酸在水溶液中的溶解度；應(yīng)用丙酮或無水乙醇，使賴氨大黃酸以結(jié)晶形式析出，通過分離、純化、干燥，得到穩(wěn)定的賴氨大黃酸結(jié)晶；經(jīng)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，賴氨大黃酸對腫瘤細(xì)胞增殖和生長具有明顯的抑制作用，有望成為一種比較理想的腫瘤治療候選藥物。文檔編號C07C66/00GK101255121SQ20081008902公開日2008年9月3日申請日期2008年4月15日優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日發(fā)明者劉秀均,吳淑英,林雅軍,甄永蘇,許先棟申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所