專利名稱：產l－賴氨酸的微生物和用其生產l－賴氨酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及產L-賴氨酸的微生物和用其生產L-賴氨酸的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及對抗生素莫能菌素具有抗性，并且能夠以高收率產生L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)CJM107(KCCM-10227)，并涉及通過用所述微生物發(fā)酵而生產L-賴氨酸的方法。
此前已用屬于棒桿菌的各種營養(yǎng)缺陷型菌株，或者抗藥性或敏感菌株生產L-賴氨酸。還用抗生素抗性菌株生產L-賴氨酸，例如桿菌肽抗性(日本專利1,765,413)、磺胺藥抗性(韓國專利公開81-1746)或伊枯草菌素(iturin)抗性(日本專利2,578,413)菌株，或者是對兩種或更多種抗生素，如鏈霉素和利福平具有抗性的菌株(美國專利4,623,623)。但是，尚沒有報導對抗生素莫能菌素具有抗性的菌株。

發(fā)明內容
本發(fā)明的發(fā)明人廣泛研究了以工業(yè)規(guī)模和經濟的方式生產L-賴氨酸的通過發(fā)酵生產L-賴氨酸的方法。結果，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過提供產L-賴氨酸的對莫能菌素具有抗性的棒桿菌，可以提高L-賴氨酸的生產率。
莫能菌素是產自放線菌之一，鏈霉菌的抗生素。已知其影響細菌細胞膜功能和質子原動力(Joumal of Natural Product，49，35-47，1986)。具體地說，擔當離子載體的莫能菌素改變細菌細胞膜和質子原動力，從而改變細菌的生理學性質。
為了有效生產L-賴氨酸，在細胞內生物合成的L-賴氨酸，應該由膜蛋白，L-賴氨酸輸出器(exporter)較好地分泌至細胞外。已知通過質子原動力跨細胞膜形成的膜電位與由L-賴氨酸的輸出器細胞外分泌L-賴氨酸有關(Eur.J.Biochem，220，137-143，1991)。根據莫能菌素的反應機理，本發(fā)明的發(fā)明人通過提供對莫能菌素具有抗性的棒桿菌而增加L-賴氨酸的生產率。
在本發(fā)明中，棒桿菌包括屬于棒桿菌屬或短桿菌屬的任何微生物。在本發(fā)明中，可以使用任何菌株作為親株，只要其能夠產生L-賴氨酸且屬于棒桿菌。它的一個具體實例是谷氨酸棒桿菌CH77。
本文以下將更詳細地解釋本發(fā)明。
莫能菌素抗性株可以如下獲得在30℃下用終濃度為500μg/ml的化學誘變劑，N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍處理107-108/ml的親株30分鐘，并分離在含有不允許親株生長的濃度的莫能菌素的基本瓊脂平板培養(yǎng)基中生長的菌株。通過進一步培養(yǎng)所獲得的莫能菌素抗性株，評價其產生L-賴氨酸的能力，并選擇具有改善的生產L-賴氨酸的能力的菌株，可以獲得本發(fā)明的突變株。
上述親株和從其衍生而來的莫能菌素抗性株具有如下特征親株谷氨酸棒桿菌CH77(KFCC-10881)是S-(2-氨基乙基)半胱氨酸抗性、氨基羥基戊酸抗性、甲基賴氨酸抗性、疊氮化鈉抗性、高絲氨酸滲漏且需亮氨酸的。
突變株谷氨酸棒桿菌CJM107(KCCM-10227)是S-(2-氨基乙基)半胱氨酸抗性、氨基羥基戊酸抗性、甲基賴氨酸抗性、疊氮化鈉抗性、高絲氨酸滲漏且需亮氨酸的，另外，其是莫能菌素抗性的。
莫能菌素抗性株，谷氨酸棒桿菌CJM107，根據布達佩斯條約，保藏于韓國微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)，361-21，Yurim B/D，Hongje-1-dong，Seodaemun-gu，漢城102-091，韓國，保藏日為2000年11月15日，保藏號為KCCM-10227。
通過以下方法測試親株CH77和突變株CJM107對莫能菌素的抗性。細胞在Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中生長16小時。然后，用消毒的生理鹽水將細胞洗滌兩次，接著，適當稀釋并在含7000μg/l莫能菌素的基本瓊脂平板培養(yǎng)基[每1升蒸餾水(pH7.0)含葡萄糖10g、(NH4)2SO42g、尿素2g、KH2PO41g、K2HPO43g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O10mg、MnSO4·7H2O10mg、生物素100μg、鹽酸硫胺素100μg、CaCl2·2H2O 100μg、Na2B4O7·10H2O 80μg、(NH4)6MoO27·4H2O 40μg、ZnSO4·7H2O 10μg、CuSO4·7H2O 10μg、MnCl2·4H2O 10μg、FeCl3·6H2O 1mg、瓊脂20g，如果需要，L-亮氨酸0.1g，如果需要，L-蘇氨酸0.1g，如果需要，L-甲硫氨酸0.1g]中培養(yǎng)4天。各菌株的生長如以下表1所示。表1谷氨酸棒桿菌CH77和CJM107對莫能菌素的抗性

+++充分生長，-不生長可以將常規(guī)用于氨基酸發(fā)酵的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)本發(fā)明中使用的微生物。也就是說，任何培養(yǎng)基，只要其含有可以被所用菌株同化的碳源、氮源、無機鹽、生長因子等，就可以用于本發(fā)明。糖類，如糖蜜、蔗糖、葡萄糖、果糖等，可以用作碳源。無機氮源，如氨、硫酸銨、尿素、氯化銨等，以及有機氮源，如酵母提取物、酵母水解產物、大豆餅粉酸水解產物、蛋白胨、玉米漿等，可以用作氮源。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、碳酸鈣等，可以用作無機化合物。另外，如果需要，可以使用維生素，如生物素和硫胺素，以及氨基酸，如亮氨酸、高絲氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸等。
培養(yǎng)在25-35℃下在有氧條件下進行，例如通過振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌深層培養(yǎng)進行。培養(yǎng)基的pH在6-8的范圍內，優(yōu)選保持在中性附近。可以用碳酸鈣、尿素或氨調節(jié)pH。通常，培養(yǎng)1-7天后，L-賴氨酸形成并積累在所得培養(yǎng)物肉湯中。培養(yǎng)完成后，用硫酸或鹽酸處理培養(yǎng)物肉湯，接著，通過使用離子交換樹脂處理、濃縮、鹽析以及等電聚焦組合，可以從培養(yǎng)物肉湯中回收L-賴氨酸。
離心完成結晶后獲得的漿液，獲得第一濕產物。通過分批法再次濃縮母液并結晶，獲得第二濕產物。合并第一和第二濕產物，并干燥，獲得46g含98.5％L-賴氨酸的干燥產物。實施例3在含預處理糖蜜和粗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)CJM107菌株。培養(yǎng)后，將硫酸加入1升L-賴氨酸發(fā)酵肉湯中，以將pH調節(jié)到2.0，從而將Ca2+轉化為CaSO4。接著，施加肉湯使其被逆流吸附于陽離子交換樹脂(Dianion SK-1B，SK-1BL)，所述陽離子交換樹脂以銨離子形式再生。隨后，用脫鹽的水洗滌之，以除去殘存在樹脂層中的細胞團塊，接著通過用2 N氫氧化銨洗脫而從其回收L-賴氨酸的濃縮部分。將回收的部分濃縮后，將濃縮液調節(jié)至pH5.0，并冷卻至20℃，從而形成L-賴氨酸晶體。
離心完成結晶后獲得的漿液，獲得第一濕產物。通過分批法再次濃縮母液并結晶，獲得第二濕產物。合并第一和第二濕產物，并干燥，獲得47g含99％L-賴氨酸的干燥產物。
工業(yè)實用性根據本發(fā)明，通過由人工誘變產生產L-賴氨酸的對莫能菌素有抗性的棒桿菌，可以增加L-賴氨酸的發(fā)酵濃度和收率。因此，對莫能菌素具有抗性，并且能夠產生L-賴氨酸的棒桿菌對于L-賴氨酸生產而言非常有用。
權利要求
1.對莫能菌素具有抗性且產生L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)CJM107(保藏號KCCM-10227)。
2.生產L-賴氨酸的方法，所述方法包括通過在有氧條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中在25-35℃下振蕩培養(yǎng)權利要求1的谷氨酸棒桿菌CJM10720小時而活化所述微生物，然后在25-35℃下在有氧條件下在發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)所述微生物1-7天。
全文摘要
本發(fā)明公開了對抗生素莫能菌素具有抗性，并且產生L－賴氨酸的棒桿菌，以及通過直接發(fā)酵生產L－賴氨酸的方法，所述方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，在所得培養(yǎng)物肉湯中積累L－賴氨酸，并從其回收L－賴氨酸。
文檔編號C12P13/00GK1406275SQ01805762
公開日2003年3月26日 申請日期2001年12月28日 優(yōu)先權日2000年12月30日
發(fā)明者金成俊, 李庚翰, 成珍錫, 林相曹, 張在佑 申請人:第一制糖株式會社