檢測載脂蛋白m基因敲除小鼠基因型的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測載脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的 方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因敲除技術(shù)是通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修 飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)，目前已成為 一種較理想的改造生物遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法?；蚯贸∈髣t是利用基因敲除技術(shù)使正常 實(shí)驗(yàn)小鼠的基因組特定位點(diǎn)上的目的基因失活，經(jīng)過繁殖篩選后所得到的目的基因表達(dá)的 缺陷小鼠，是研宄被敲除的目的基因的理想實(shí)驗(yàn)材料?；蚯贸夹g(shù)從載體構(gòu)建到細(xì)胞的 篩選再到動物模型的建立等各方面都得到了較大發(fā)展。
[0003]載脂蛋白M (Apolipoprotein M，ApoM)是由Xu和Dahlback等在1999年在餐后 血漿富甘油三酯脂蛋白中發(fā)現(xiàn)的。載脂蛋白M作為新近被發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白，其在脂蛋白代 謝中具有重要的生理功能。研宄表明，胰島素、瘦素、雌激素、高血糖以及許多細(xì)胞因子都可 調(diào)節(jié)載脂蛋白M的表達(dá)，載脂蛋白M也可能與肥胖、糖尿病及胎兒的生長發(fā)育等疾病的發(fā)生 發(fā)展有關(guān)，但其作用機(jī)制尚不明確。
[0004] 載脂蛋白M基因定位于人6號染色體上主要組織相容復(fù)合物（MHC- m)的高保守 區(qū)域，編碼一個約26kDa的蛋白。研宄表明，載脂蛋白M主要參與前0-HDL的形成，對HDL 代謝有重要的調(diào)節(jié)作用。因此，載脂蛋白M在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，特別是在膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)中以 及在預(yù)防動脈粥樣硬化方面起著重要作用。因此，載脂蛋白M基因敲除小鼠常用作疾病研 宄的動物模型。
[0005] 但是，基因敲除動物在用于研宄前必須進(jìn)行準(zhǔn)確、及時的基因型檢測，而建立快速 可靠的檢測方法尤其重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一在于解決上述問題，提供一種經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確以及靈敏度較高 的檢測載脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于解決上述問題，提供一種檢測載脂蛋白M基因敲除小鼠基 因型的試劑盒。
[0008] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的之一的技術(shù)方案是：一種檢測載脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的 方法，包括：設(shè)計(jì)并合成引物和探針；提取小鼠的DNA ;實(shí)時熒光定量PCR檢測；設(shè)計(jì)的引物 和探針序列如下： 野生純合型上游引物：5' -CGGAAGTGGACATACCGAITG-3'； 野生純合型下游引物：5' -AAACGGCTAAGGGAGACGAGA-3'； 野生純合型探針：5' -FAM-CTGAAGGITGGITCCCACCAGCCC-BHQ-1-3'； 敲除純合型上游引物：5' -GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC-3'； 敲除純合型下游引物：5'-CGATGTTTCGCTTGGTGGTC-3'； 敲除純合型探針：5' -CY5-TGCAATGCGGCGGCTGCATACGCT-BHQ-2-3'。
[0009] 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：DNA模板2yL;野生純合型上游引物（lOOyM) 0. lyL;野生純合型下游引物（100yM)0. lyL;野生純合型探針（100yM)0. lyL;敲除純 合型上游引物（100yM)0. lyL ;敲除純合型下游引物（100yM)0. lyL;敲除純合型探針 (100yM)0. 1 yL ；Taq *j^^S|(5U/y L)0. 125yL ；dNTP Mixture (2. 5mM) 2 y L；10XPCR 緩沖液2. 5 y L ;RNase-free水補(bǔ)足體積至25 y L〇
[0010] 實(shí)時熒光定量？〇?反應(yīng)條件如下：95°0預(yù)變性3!^11;951：108,601：108,40個循 環(huán)；40°C 30s。
[0011] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明另一目的的技術(shù)方案是：一種檢測載脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的 試劑盒，包括核酸提取試劑、PCR反應(yīng)試劑、RNase-free水以及引物和探針；所述引物和探 針序列如下： 野生純合型上游引物：5' -CGGAAGTGGACATACCGAITG-3' ； 野生純合型下游引物：5' -AAACGGCTAAGGGAGACGAGA-3' ； 野生純合型探針：5' -FAM-CTGAAGGITGGITCCCACCAGCCC-BHQ-1-3' ； 敲除純合型上游引物：5' -GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC-3' ； 敲除純合型下游引物：5'-CGATGTTTCGCTTGGTGGTC-3'； 敲除純合型探針：5' -CY5-TGCAATGCGGCGGCTGCATACGCT-BHQ-2-3'。
[0012] PCR反應(yīng)試劑包括10XPCR緩沖液、dNTP Mixture以及Taq熱啟動酶。
[0013] 本發(fā)明具有的積極效果：1)本發(fā)明的方法可在lh內(nèi)完成基因型檢測，而且成本較 低，操作簡單。（2)本發(fā)明的方法結(jié)果準(zhǔn)確、易判斷，且還具有較高的靈敏度。
【附圖說明】
[0014] 圖1為野生純合型小鼠PCR產(chǎn)物測序序列圖。
[0015] 圖2為敲除純合型小鼠PCR產(chǎn)物測序序列圖。
[0016] 圖3為野生純合型小鼠靈敏度檢測示意圖，圖中：橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光 信號強(qiáng)度，曲線 1 ~6 依次為 4X 106、4X 105、4X 104、4X 103、4X 102、4XlOkopies/y L。
[0017]圖4為敲除純合型小鼠靈敏度檢測示意圖，圖中：橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光 信號強(qiáng)度，曲線 1 ~6 依次為 4X 106、4X 105、4X 104、4X 103、4X 102、4XlOkopies/y L。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 1、材料與方法。
[0019] 1. 1、標(biāo)本來源：采用基因敲除技術(shù)將C57BL/6小鼠載脂蛋白M基因的第2外顯子 至第5外顯子的核酸片段用外源性載體序列Lox-Neo-LoxP替換掉，成功獲得了可穩(wěn)定遺傳 的載脂蛋白M基因敲除雜合型小鼠（以下均簡稱為敲除雜合型小鼠)，通過繁殖可獲得載脂 蛋白M基因敲除純合型小鼠（以下均簡稱為敲除純合型小鼠）。
[0020] 經(jīng)過飼養(yǎng)繁殖，敲除雜合型小鼠和敲除純合型小鼠均能正常生長繁殖，且毛色、進(jìn) 食、活動、體溫和質(zhì)量等方面均與（未進(jìn)行基因敲出的）野生純合型小鼠無明顯差異。
[0021] 1.2、主要試劑及儀器：Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒【生工生物工程(上 海）股份有限公司】，Taq熱啟動酶、dNTP Mixture、10XPCR緩沖液【TaKaRa公司】，Light Cycler 480 II型實(shí)時熒光定量PCR儀【Roche公司】。
[0022] 1. 3、設(shè)計(jì)并合成引物和探針：引物和探針的設(shè)計(jì)是整個檢測方法的關(guān)鍵。
[0023] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小鼠載脂蛋白M基因序列以及Lox-Neo-LoxP序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針。
[0024] 其中，野生純合型小鼠探針5'末端標(biāo)記熒光基團(tuán)6-羧基熒光素（FAM)，敲除純合 型小鼠探針5'末端標(biāo)記熒光基團(tuán)3H-吲哚菁染料（CY5)。具體序列如下： 野生純合型上游引物：5'-CGGAAGTGGACATACCGAITG-3'； 野生純合型下游引物：5'-AAACGGCTAAGGGAGACGAGA-3'； 野生純合型探針：5'-FAM-CTGAAGGITGGITCCCACCAGCCC-BHQ-1-3'； 敲除純合型上游引物：5'-GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC-3'； 敲除純合型下游引物：5'-CGATGTTTCGCTTGGTGGTC-3'； 敲除純合型探針：5' -CY5-TGCAATGCGGCGGCTGCATACGCT-BHQ-2-3'。
[0025] 以上引物和探針均委托生工生物工程(上海）股份有限公司合成。
[0026] 1. 4、提取小鼠的DNA:取小鼠尾尖段約5mm，按照Ezup柱式動物基因組DNA抽提試 劑盒說明書進(jìn)行操作，并于4°C保存。
[0027] 1. 5、實(shí)時熒光定量PCR檢測：所有反應(yīng)均在Light Cycler 480II型實(shí)時熒光定量 PCR儀上進(jìn)行。
[0028] 反應(yīng)總體系為25yL，具體見表1。
[0029]表1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測載脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法，包括：設(shè)計(jì)并合成引物和探針；提 取小鼠的DNA;實(shí)時熒光定量PCR檢測； 其特征在于：設(shè)計(jì)的引物和探針序列如下： 野生純合型上游引物：5' -CGGAAGTGGACATACCGAITG-3' ； 野生純合型下游引物：5' -AAACGGCTAAGGGAGACGAGA-3' ； 野生純合型探針：5' -FAM-CTGAAGGITGGITCCCACCAGCCC-BHQ-1-3' ； 敲除純合型上游引物：5' -GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC-3' ； 敲除純合型下游引物：5' -CGATGTTTCGCTTGGTGGTC-3' ； 敲除純合型探針：5' -CY5-TGCAATGCGGCGGCTGCATACGCT-BHQ-2-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測載脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法，其特征在于： 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系如下： DNA模板 2yL; 野生純合型上游引物（IOOyM)O.IyL; 野生純合型下游引物（IOOyM)O.IyL; 野生純合型探針（100yM) 0.IyL; 敲除純合型上游引物（IOOuM)O.IyL; 敲除純合型下游引物（IOOuM)O.IyL; 敲除純合型探針（100yM) 0.IyL; Taq熱啟動酶（5U/yL)0. 125yL;dNTPMixture(2. 5mM)2yL； 10父？〇?緩沖液2.51^; RNase-free水補(bǔ)足體積至25yL0
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測載脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法，其特征在 于：實(shí)時熒光定量？〇?反應(yīng)條件如下：951：預(yù)變性3111111 ;951：1〇8,6〇1：1〇8,40個循環(huán)； 40〇C30s〇
4. 一種檢測載脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的試劑盒，包括核酸提取試劑、PCR反應(yīng)試 劑、RNase-free水以及引物和探針；其特征在于所述引物和探針序列如下： 野生純合型上游引物：5' -CGGAAGTGGACATACCGAITG-3' ； 野生純合型下游引物：5' -AAACGGCTAAGGGAGACGAGA-3' ； 野生純合型探針：5' -FAM-CTGAAGGITGGITCCCACCAGCCC-BHQ-1-3' ； 敲除純合型上游引物：5' -GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC-3' ； 敲除純合型下游引物：5' -CGATGTTTCGCTTGGTGGTC-3' ； 敲除純合型探針：5' -CY5-TGCAATGCGGCGGCTGCATACGCT-BHQ-2-3'。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測載脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法及試劑盒，方法包括：設(shè)計(jì)并合成引物和探針；提取小鼠的DNA；實(shí)時熒光定量PCR檢測。試劑盒包括：核酸提取試劑、PCR反應(yīng)試劑、RNase-free水以及引物和探針。設(shè)計(jì)的引物包括野生純合型上游引物、野生純合型下游引物、野生純合型探針、敲除純合型上游引物、敲除純合型下游引物以及敲除純合型探針。本發(fā)明的方法可在1h內(nèi)完成基因型檢測，而且成本較低，操作簡單。本發(fā)明的方法結(jié)果準(zhǔn)確、易判斷，且還具有較高的靈敏度。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104694648
【申請?zhí)枴緾N201510101634
【發(fā)明人】羅光華, 鄭璐, 于洋
【申請人】常州市第一人民醫(yī)院
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月6日