一種用于骨質(zhì)疏松的診斷的血液檢測試劑盒的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請要求中國發(fā)明專利申請201410050513. 3的優(yōu)先權(quán)（申請日：2014年02月 14日，發(fā)明名稱：一種用于骨質(zhì)疏松的輔助診斷的血液檢測試劑盒）。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，尤其涉及可用于骨質(zhì)疏松的診斷的血液檢測試劑盒。 此外，本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增miR-214的引物在制備可用于骨質(zhì)疏松的診斷的血液檢測試 劑盒中的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 骨質(zhì)疏松癥是指以單位體積內(nèi)骨量低于正常為特征的骨胳疾病，骨質(zhì)有機(jī)成分生 成不足、繼發(fā)性鈣鹽減少及骨組織微隙結(jié)構(gòu)破壞是其主要表現(xiàn)。骨質(zhì)疏松癥目前已經(jīng)成為 世界性問題，是繼腫瘤、心血管疾病之后又一嚴(yán)重危害人類健康的一種疾病。有研宄顯示， 骨質(zhì)疏松癥其發(fā)病率居常見病、多發(fā)病的第7位。
[0004] 骨質(zhì)疏松發(fā)病現(xiàn)狀
[0005] 我國是世界上老年人口數(shù)量最多的國家，預(yù)測到2050年我國60歲以上的老年人 將占全國總?cè)丝诘?0%。隨著人口的日益老齡化，老年性疾病，特別是骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也 在同步增長。目前我國有骨質(zhì)疏松病人約9000萬。到2050年將增至2億多人，占人口的 13. 2%，但目前醫(yī)學(xué)上還未有安全而有效的根治方法幫助已疏松的骨胳恢復(fù)原狀。因此，正 確認(rèn)識、早期預(yù)防、早期干預(yù)、早期診斷顯得尤為重要。
[0006] 骨質(zhì)疏松的現(xiàn)行診斷方法
[0007] 骨質(zhì)疏松癥是一種發(fā)病隱匿、常見但又診斷不足的疾病，其早期準(zhǔn)確診治將有助 于為更好的防治骨質(zhì)疏松提供依據(jù)。目前骨質(zhì)疏松的診斷仍沿用1994年WHO頒布的以骨 礦含量（BMC)和骨密度（BMD)為基礎(chǔ)的骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)，即以雙能X線吸收法（DEXA)為 基本測量方法。BMC或BMD在青年成人平均值的1個標(biāo)準(zhǔn)差（s)以內(nèi)者為正常；若以T評 分（T值）表示，即多-1. 0為正常，-2. 5〈T值〈-1. 0為骨量減少，< -2. 5為骨質(zhì)疏松。但 目前集中于-2. 5的T評分閾值正在發(fā)生改變。利用該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷時，骨質(zhì)疏松組和正常 組有一定程度上的重疊，該標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步完善。除此之外，臨床上還結(jié)合血、尿生化檢測、 內(nèi)分泌功能測定、骨形成和骨吸收指標(biāo)、骨骼X射線、雙能X線骨密度吸收法（DEXA)及定量 CT(QCT)以及定量超聲（QUS)等檢測指標(biāo)，上述檢查指標(biāo)花費高，步驟繁瑣，結(jié)果不準(zhǔn)確，等 診斷為骨質(zhì)疏松時，病人已經(jīng)發(fā)生了骨量和結(jié)構(gòu)的改變，加之目前又缺乏真正有效的治療 藥物，因而亟需發(fā)現(xiàn)更加靈敏、特異、易于檢測、明確而有效的生物標(biāo)志物，對骨質(zhì)疏松作出 準(zhǔn)確、及時的診斷。
[0008] 另一方面，近來，人們越來越認(rèn)識到miRNA是在發(fā)育、病理與生理條件下發(fā)揮重要 作用的調(diào)控因子，參與腫瘤的發(fā)生、病毒的感染、細(xì)胞的分化與功能的發(fā)揮等一系列的生命 過程中。miRNA是單鏈的小RNA分子，大約21或22個核苷酸長。這些小RNA分子不編碼蛋 白，但是它們通過降低mRNA的水平或與mRNA 3'UTR相結(jié)合抑制翻譯，從而降低體內(nèi)的蛋白 水平。令人意想不到的是非編碼RNA分子占人類基因組總量的98%，非編碼RNA與蛋白編 碼RNA的比例與發(fā)育的復(fù)雜性密切相關(guān)。因此，如果篩選出在骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中血液中 異常表達(dá)的miRNA作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對骨質(zhì)疏松的診斷現(xiàn)狀必 將是一次有力的推動。
[0009]關(guān)于miR-214
[0010]miR-214最早發(fā)現(xiàn)在斑馬魚的慢肌發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。后來證實， miR-214可以與Ezh2的3' UTR相結(jié)合，降低細(xì)胞內(nèi)Ezh2的水平，從而促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞 的分化和胚胎干細(xì)胞中發(fā)育調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄。在未分化的骨胳肌細(xì)胞中，PcG蛋白抑制 miR-214的轉(zhuǎn)錄，隨著發(fā)育的進(jìn)行，伴隨著PcG的解離和MyoD以及myogenin的募集，從而激 活miR-214的轉(zhuǎn)錄。
[0011] 已有研宄表明，骨質(zhì)疏松病人骨組織中的miR-214的表達(dá)水平明顯升高，因此，骨 組織中的miR-214可作為骨質(zhì)疏松早期診斷及預(yù)防的生物標(biāo)志物（中國專利申請公開號 CN102335189A)。
[0012] 但是，骨組織中的miR-214來源于成骨細(xì)胞，而成骨細(xì)胞成分不能進(jìn)入到血液中， 因此，骨組織中的miR-214與血液中的miR-214并無關(guān)聯(lián)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明人長期從事miRNA相關(guān)的研宄工作，在深入的研宄中，我們通過大量的實 驗發(fā)現(xiàn)：
[0014] 血液中的miR-214 (5' -ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3'）是骨質(zhì)疏松發(fā)病的特異性 生物標(biāo)志物，從而完成了本發(fā)明。
[0015] SP，本發(fā)明包括：
[0016] 1. -種血液檢測試劑盒，其包括：
[0017] 用于擴(kuò)增miR-214的引物，以及
[0018] 用于從血液中提取miRNA的試劑；
[0019] 其中，所述用于擴(kuò)增miR-214的引物是miR-214的反轉(zhuǎn)錄引物和miR-214的cDNA 的擴(kuò)增引物。
[0020] 2.根據(jù)項1所述的血液檢測試劑盒，其用于骨質(zhì)疏松的診斷。
[0021] 3.根據(jù)項1或2所述的血液檢測試劑盒，其中，所述miR-214的反轉(zhuǎn)錄引物的核苷 酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0022] 4.根據(jù)項1~3中任一項所述的血液檢測試劑盒，其中，所述miR-214的cDNA的 擴(kuò)增引物是：
[0023] 上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；和/或
[0024] 下游引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示。
[0025] 5.用于擴(kuò)增miR-214的引物在制備血液檢測試劑盒中的用途，其中，所述血液檢 測試劑盒包括：
[0026] 用于擴(kuò)增miR-214的引物，以及
[0027] 用于從血液中提取miRNA的試劑；
[0028] 其中，所述用于擴(kuò)增miR-214的引物是miR-214的反轉(zhuǎn)錄引物和miR-214的cDNA 的擴(kuò)增引物。
[0029] 6.根據(jù)項5所述的用途，其中，所述血液檢測試劑盒用于骨質(zhì)疏松的診斷。
[0030] 7.根據(jù)項5或6所述的用途，其中，所述miR-214的反轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列如 SEQIDNO:l 所示。
[0031] 8.根據(jù)項5~7中任一項所述的用途，其中，所述miR-214的cDNA的擴(kuò)增引物是：
[0032] 上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
[0033] 下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0034] 需要說明的是，在本說明書中，血液包括血漿、血清和全血，優(yōu)選為血漿、血清，更 優(yōu)選為血清。
[0035] 本發(fā)明通過控制年齡等對骨質(zhì)疏松發(fā)展的影響因素，研宄血液miRNA在骨質(zhì)疏松 診斷中的應(yīng)用前景，闡述異常表達(dá)的miRNAs對骨質(zhì)疏松進(jìn)展的影響，揭示其篩查和早期診 斷的價值。因此，本發(fā)明獲得了骨質(zhì)疏松發(fā)病特異性的血液miRNAs表達(dá)的特異性標(biāo)志物。 通過對血液生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制與應(yīng)用，僅僅需要病人的血清或血漿而不需要 任何其他組織，通過最精簡的引物庫來檢測血清miRNA水平能擴(kuò)展骨質(zhì)疏松的檢測指標(biāo)， 提高檢測的靈敏度，可使得骨質(zhì)疏松的診斷和治療更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌 握患者病情，為臨床治療效果的評價奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0036] 圖1顯示骨組織中miR-214水平與血清中miR-214水平之間的關(guān)系的圖。
[0037] 圖2顯示臨床骨質(zhì)疏松病人血清中miR-214的水平與腰椎T值相關(guān)性的圖。
[0038] 圖3顯示臨床骨質(zhì)疏松病人血清中miR-214的水平與血清中骨吸收速率的敏感指 標(biāo)I型膠原羧基端肽（CTX)的相關(guān)性的圖。
【具體實施方式】
[0039] 在一個方面中，本發(fā)明提供一種血液檢測試劑盒（本發(fā)明的血液檢測試劑盒），其 包括：
[0040] 用于擴(kuò)增miR-214的引物，以及
[0041] 用于從血液中提取miRNA的試劑；
[0042] 其中，所述用于擴(kuò)增miR-214的引物是miR-214的反轉(zhuǎn)錄引物和miR-214的cDNA 的擴(kuò)增引物。
[0043] 本發(fā)明的血液檢測試劑盒可用于骨質(zhì)疏松的診斷。本說明書中，"診斷"可以是確 診，也可以是為確診提供參考信息。
[0044] miR-214的核苷酸序列為5' -ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3'，針對已知核苷酸序列 的miRNA設(shè)計其擴(kuò)增引物（包括反轉(zhuǎn)錄引物和cDNA擴(kuò)增引物）是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的， 例如可以按照《分子克隆實驗指南》（J.薩姆布魯克（SambrooLJ.)等著，黃培堂等譯，第 3版，2005)的教導(dǎo)來進(jìn)行設(shè)計，或者利用計算機(jī)軟件（例如Premier公司開發(fā)的Premier 6.0)來進(jìn)行設(shè)計。
[0045] 特別是，在使用SEQ ID NO: 1所示的miR-214的反轉(zhuǎn)錄引物、SEQ ID NO: 2所示擴(kuò) 增miR-214的cDNA的上游引物、以及SEQ ID NO: 3所示擴(kuò)增miR-214的cDNA的下游引物 時，本發(fā)明的血液檢測試劑盒的檢出率（靈敏度）可達(dá)（94.