專(zhuān)利名稱(chēng)::一種載脂蛋白e檢測(cè)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及一種測(cè)定血清成分試劑的制備方法及試劑盒,特別是測(cè)定血清中APOE的試劑,可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域:
。
背景技術(shù):
:載脂蛋白E(APOE)是一個(gè)含有299個(gè)氨基酸結(jié)合有磷脂的糖蛋白.其分子量為34kD。ApoE可以在各種組織中合成,但以肝臟為主,首先合成的是含有317個(gè)氨基酸的前肽,這個(gè)前肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過(guò)蛋白水解作用除去18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽,再經(jīng)過(guò)糖基化作用和細(xì)胞外液的脫唾液酸作用形成成熟的ApoE;ApoE分泌入血后即轉(zhuǎn)移到脂蛋白中。APOE是脂蛋白所必須的結(jié)構(gòu)蛋白,可通過(guò)與各組織細(xì)胞的受體結(jié)合,參于脂蛋白代謝,調(diào)節(jié)膽固醇水平,激活卵磷脂腿固醇脂舫蘸轉(zhuǎn)移酶(LCAT),并具有某種免疫調(diào)節(jié)作用。測(cè)定ApoE對(duì)診斷和治療高脂血癥動(dòng)脈粥樣硬化等疾病提供了重要理論依據(jù)。已知測(cè)定APOE的方法有層析法、電泳法、免疫分析法、其中層析法和電泳法操作繁瑣,不能進(jìn)行批量樣本分析和直接上全自動(dòng)生化分析儀等缺點(diǎn),而免疫分析法中的免疫擴(kuò)散法、放射免疫分析法、熒光標(biāo)記免疫分析法、酶標(biāo)記免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法也存在諸多不足之處;如需要特殊的設(shè)備,樣品需要預(yù)處理,不能上全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行批量檢測(cè)分析等。臨床上常用的免疫透射比濁法因其樣本用量少,可直接在全自動(dòng)上進(jìn)行批量樣本分析、操作簡(jiǎn)單受其歡迎;但目前建立的方法及試劑都存在一些缺點(diǎn)和/或不足,主要表現(xiàn)在一是抗體效價(jià)不高,特異性、親合力、親和力不好;二是校準(zhǔn)血清是以人血清為基質(zhì),雖然乙肝表面抗原陰性、HIV檢測(cè)陰性、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常的人血清,但這也很難排除沒(méi)有其他傳染病的可能,給操作者帶來(lái)很大的危險(xiǎn)性;而且校準(zhǔn)血清為凍干品,每批的定值不一,使用前需用水復(fù)溶,操作極其不便;另外,不同的復(fù)溶者復(fù)溶后瓶間差異大,復(fù)溶后必須冰凍保存,特別是不能反復(fù)解凍使用,不但造成試劑浪費(fèi),而且質(zhì)量也得不到保證,測(cè)定結(jié)果差異大,其穩(wěn)定性也不好;三是對(duì)高脂、黃疸、溶血樣本抗干擾能力差;四是采用單點(diǎn)校準(zhǔn)液定標(biāo),不符合曲線回歸方程計(jì)算,導(dǎo)致出現(xiàn)高值偏低,低值偏高的現(xiàn)象,所測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確;五是抗血清在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)沉淀,使上機(jī)操作困難,影響檢測(cè)效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種樣本無(wú)需稀釋、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、抗干擾能力強(qiáng),采用優(yōu)質(zhì)新生牛血清代替人血清作為基質(zhì)制備的穩(wěn)定的以液體血清型恒定值校準(zhǔn)液聯(lián)合檢測(cè)載脂蛋白E的試劑,來(lái)解決上述
背景技術(shù):
的不足之處。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種載脂蛋白E檢測(cè)試劑,包括a、試劑Rl—種使樣品中APOE抗原位點(diǎn)充分暴露,有利于與抗APOE抗體充分結(jié)合的反應(yīng)劑,包括5-200mmol/L緩沖液、0.1_10%的表面活性劑、0.1_40%電解質(zhì)、20%-80%高分子加速劑、0.1%-0.5%反應(yīng)促進(jìn)劑、0.1%-1%的穩(wěn)定劑以及適量防腐劑,其余為純化水。b、試劑R2—種與人血清中的APOE抗原有高度特異反應(yīng)性的抗APOE抗體溶液,在一定量的試劑Rl中加入體積比為20-50%的抗人APOE抗血清以及0.001%-5%的抗氧化劑;C、恒定值校準(zhǔn)液一種用來(lái)與樣品比較,進(jìn)行結(jié)果計(jì)算的液體血清型溶液,包括:20-100mmol/L的緩沖液、80_160mg/L的APOE抗原、0.01-20mmol/L的抗氧化劑、0.01-15mmol/L的增效劑、0.l-50mmol/L的穩(wěn)定劑、適量防腐劑,其余為純化水。恒定值校準(zhǔn)液的濃度可以是高濃度單點(diǎn)參考校準(zhǔn)品,在使用時(shí)用生理鹽水稀釋成多個(gè)不同濃度的參考校準(zhǔn)品,也可以直接制備成多個(gè)不同濃度的參考校準(zhǔn)品,這里沒(méi)有特別的限制,只要制得的APOE恒定值校準(zhǔn)液能與樣本比較,能夠測(cè)定樣本中恒定值校準(zhǔn)液的含量即可。進(jìn)一步,試劑R2中還加入反應(yīng)促進(jìn)劑聚凝胺,以縮短整個(gè)反應(yīng)時(shí)間。增效劑可選用檸檬酸、灑石酸、抗壞血酸中的一種或多種??寡趸瘎┛梢韵热芙庠贗O-IOOml丙二醇或乙醇中,然后加入試劑R2中。本發(fā)明的檢測(cè)原理是利用抗原抗體反應(yīng),加入試劑Rl(反應(yīng)劑)解除樣本中抗原周?chē)碾娮訉雍退瘜?,使抗原位點(diǎn)充分暴露,然后加入試劑R2(抗APOE抗體溶液)使有高度特異反應(yīng)性的抗APOE抗體與樣本中相應(yīng)的抗原反應(yīng),形成不溶性的抗原_抗體復(fù)合物,產(chǎn)生一定的濁度,其濁度高低與樣本中的APOE含量成正比;在規(guī)定波長(zhǎng)下測(cè)定該不溶性抗原-抗體復(fù)合物的吸光度值,與已知恒定的校準(zhǔn)液(ΑΡ0Ε抗原濃度相同的校準(zhǔn)液)比較,則可計(jì)算出樣本中APOE的含量。本發(fā)明的有益效果是由于首次采用抗氧化劑的再生技術(shù)(加入增效劑)來(lái)穩(wěn)定載脂蛋白E參考校準(zhǔn)品,提高了抗干擾能力,使校準(zhǔn)液的值在2-8°C—年幾乎保持不變,這就顯著提高了檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性(與放射免疫分析法的檢測(cè)數(shù)據(jù)基本一致),并且重復(fù)性好;另外,檢測(cè)樣本無(wú)需稀釋、能夠直接采用全自動(dòng)生化分析儀,操作方法和步驟得到了大幅度的簡(jiǎn)化,檢測(cè)效率顯著提高。圖1是本發(fā)明實(shí)施例1進(jìn)行檢測(cè)所得的APOE的測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的APOE測(cè)得值的相互關(guān)系示意圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例2進(jìn)行檢測(cè)所得的APOE的測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的APOE測(cè)得值的相互關(guān)系示意圖。圖3是本發(fā)明實(shí)施例3進(jìn)行檢測(cè)所得的APOE的測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的APOE測(cè)得值的相互關(guān)系示意圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒,其中主要包括一種與APOE抗原有高度特異反應(yīng)活性的抗體和使樣品中APOE抗原位點(diǎn)充分暴露的反應(yīng)劑(或稱(chēng)樣品稀釋液)以及液體血清型恒定值校準(zhǔn)液。本發(fā)明的有關(guān)細(xì)節(jié)描述如下緩沖液可以是磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、PIPES、HEPES、TAPS、甘氨酸、硼酸,或者硼酸鹽中的一種或多種;本發(fā)明優(yōu)選磷酸鹽緩沖液,緩沖液的PH值為5-10,優(yōu)選7.4-8.1。表面活性劑可選用是非離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑,這里優(yōu)選非離子表面活性劑,作為實(shí)例有Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等,這些表面活性劑可以單獨(dú)使用,也可以?xún)煞N或兩種以上混合使用,這里不作限制。電解質(zhì)可選用陰離子電解質(zhì)或陽(yáng)離子電解質(zhì),本發(fā)明優(yōu)選陽(yáng)離子中的氯化鈉(NaCl)。高分子加速劑可選用聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一種或多種,優(yōu)選聚乙二醇6000。防腐劑可選用疊氮鈉、乙基汞硫代硫酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、苯酚、廣譜殺菌劑中的一種或多種混合;從環(huán)保角度考慮,本發(fā)明優(yōu)選廣譜殺菌劑。防霉劑可選用丙酸鈉、脫氧乙酸中的一種或多種。穩(wěn)定劑可選用乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、牛(人)血清白蛋白乙二醇、甘露糖醇、海藻糖中的一種或多種混合??谷薃POE抗血清可以是羊抗人APOE抗血清、兔抗人APOE抗血清、鼠抗人APOE抗血清、??谷薃POE抗血清中的一種??寡趸瘎┛蛇x用丁基羥基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羥基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂中的一種或多種混合。反應(yīng)促進(jìn)劑可選用聚凝胺。恒定值校準(zhǔn)液是決定試劑準(zhǔn)確度的重要因素之一;載脂蛋白APOE在液體狀態(tài)下,能自發(fā)氧化,使校準(zhǔn)液的值在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生很大的下降,所以必須使用抗氧化劑來(lái)減緩或阻止載脂蛋白APOE的氧化速度;但是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或某些客觀的因素,抗氧化劑本身也發(fā)生了還原,其抗氧化效果下降。為了提高校準(zhǔn)液在液體狀態(tài)下的穩(wěn)定性,發(fā)明人進(jìn)行了長(zhǎng)期研究后發(fā)現(xiàn)抗氧化劑被還原的同時(shí),產(chǎn)生了一定量的自由基,在其中加入適量的增效劑,使增效劑與抗氧化劑還原產(chǎn)生的自由基作用,使抗氧化劑得以再生.從而達(dá)到提高了校準(zhǔn)液的穩(wěn)定性。本發(fā)明首次采用抗氧化劑的再生技術(shù)(加入增效劑)來(lái)穩(wěn)定載脂蛋白E參考校準(zhǔn)品,使校準(zhǔn)液的值在2-8°C—年幾乎保持不變。本發(fā)明所用生化原料可全部外購(gòu)。以下通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1試劑Rl(反應(yīng)劑)磷酸鹽(緩沖液)25mmol/L(5-200mmol/L)聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑)5%(0.1-10%)NaCL(電解質(zhì))4.5%(0.1%-0.5%)PEG-6000(高分子加速劑)40%(20%-80%)廣譜殺菌劑(防腐劑)3%(0.-5%)聚凝胺(反應(yīng)促進(jìn)劑)0.3%(0.1%-0.5%)乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5%(0.-1%)牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)1%(0.1%-1%)APOE抗體試劑其余為純化水試劑R2(抗APOE抗體溶液)反應(yīng)劑稀釋液(或樣本稀釋液)IOOOml羊抗人APOE抗血清400ml丁基羥基茴香醚0.03%恒定值校準(zhǔn)液(血清型溶液):CAPSO(緩沖液)20mmol/L丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)6mmol/L檸檬酸(增效劑)lOmmol/L廣譜殺菌劑(防腐劑)2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)2mmol/L牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)3mmol/L丙酸鈉(防霉劑)2mmol/LAPOE抗原120mg/L其余為純化水按照需要的恒定值校準(zhǔn)液濃度將相應(yīng)量的APOE抗原加入上述溶液中,制備得APOE恒定值校準(zhǔn)液。APOE恒定值校準(zhǔn)液的濃度可以是高濃度單點(diǎn)參考校準(zhǔn)品,在使用時(shí)用生理鹽水稀釋成多個(gè)不同濃度參考校準(zhǔn)品,也可以直接制備成多個(gè)不同濃度的參考校準(zhǔn)品。然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌,放2-8°C保存。采用本實(shí)施例獲得的APOE測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的APOE測(cè)得值進(jìn)行比較(如圖1所示;并進(jìn)行回歸分析),獲知相關(guān)性r=0.9795(y=0.9758X-0.5125);顯示出本實(shí)施例與放射免疫分析法具有良好的相關(guān)性。實(shí)施例2試劑Rl(反應(yīng)劑)磷酸鹽(緩沖液)30mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑)5%NaCL(電解質(zhì))4.5%PEG-6000(高分子加速劑)40%廣譜殺菌劑(防腐劑)3%聚凝胺(反應(yīng)促進(jìn)劑)0.3%乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5%牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)1%其余為純化水試劑R2(抗APOE抗體溶液)反應(yīng)劑稀釋液(樣本稀釋液)IOOOml羊抗人APOE抗血清250ml丁基羥基茴香醚0.03%恒定值校準(zhǔn)液(血清型溶液)CAPSO(緩沖液)50mmol/L丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)6mmol/L檸檬酸(增效劑)lOmmol/L廣譜殺菌劑(防腐劑)2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)2mmol/L牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)3mmol/L丙酸鈉(防霉劑)2mmol/LAPOE抗原150mg/L其余為純化水按照需要的恒定值校準(zhǔn)液濃度將相應(yīng)量的APOE抗原上述溶液中,制備得APOE恒定值校準(zhǔn)液。APOE恒定值校準(zhǔn)液的濃度可以是高濃度單點(diǎn)參考校準(zhǔn)品,在使用時(shí)用生理鹽水稀釋成多個(gè)不同濃度參考校準(zhǔn)品,也可以直接制備成多個(gè)不同濃度的參考校準(zhǔn)品。然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌,放2-8°C保存。采用本實(shí)施例獲得的APOE測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的APOE測(cè)得值進(jìn)行比較(如圖2所示;并進(jìn)行回歸分析),獲知相關(guān)性r=0.9889(y=1.0076X-1.3128);顯示出本實(shí)施例與放射免疫分析法具有良好的相關(guān)性。實(shí)施例3試劑Rl(反應(yīng)劑)磷酸鹽(緩沖液)200mmol/L(5-200mmol/L)聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑)5%(0.1-10%)NaCL(電解質(zhì))4.5%(0.1%-0.5%)PEG-6000(高分子加速劑)40%(20%-80%)廣譜殺菌劑(防腐劑)3%(0.-5%)聚凝胺(反應(yīng)促進(jìn)劑)0.3%(0.1%-0.5%)乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5%(0.-1%)牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)1%(0.1%-1%)其余為純化水試劑R2(抗APOE抗體溶液)反應(yīng)劑(樣品稀釋液)IOOOml羊抗人APOE抗血清300ml丁基羥基茴香醚0.03%恒定值校準(zhǔn)液(血清型溶液)CAPSO緩沖液100mmol/L丁基羥基茴香醚抗氧化劑6mmol/L檸檬酸增效劑IOmmol/L廣譜殺菌劑防腐劑2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉穩(wěn)定劑2mmol/L牛血清白蛋白穩(wěn)定劑3mmol/L丙酸鈉防霉劑2mmol/LAPOE抗原100mg/L其余為純化水按照需要的恒定值校準(zhǔn)液濃度將相應(yīng)量的APOE抗原上述溶液中,制備得APOE恒定值校準(zhǔn)液。APOE恒定值校準(zhǔn)液的濃度可以是高濃度單點(diǎn)參考校準(zhǔn)品,在使用時(shí)用生理鹽水稀釋成多個(gè)不同濃度參考校準(zhǔn)品,也可以直接制備成多個(gè)不同濃度的參考校準(zhǔn)品。然后用0.22μm的濾膜抽濾除菌,放2-8°C保存。采用本實(shí)施例獲得的APOE測(cè)定值與通過(guò)放射免疫分析法所得的APOE測(cè)得值進(jìn)行比較(如圖3所示;并進(jìn)行回歸分析),獲知相關(guān)性r=0.9967(y=0.9994X-0.9826;顯示出本實(shí)施例與放射免疫分析法具有良好的相關(guān)性。本發(fā)明的測(cè)定步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果的計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式中ΔΑΤ以空白管吸光度作對(duì)照的樣品管吸光度值A(chǔ)AS以空白管吸光度作對(duì)照的校準(zhǔn)管吸光度值CS校準(zhǔn)液中ApoE的濃度尚需說(shuō)明的是本文中未特別標(biāo)明的比例均為重量比。權(quán)利要求一種載脂蛋白E檢測(cè)試劑,包括a、試劑R1一種使樣品中APOE抗原位點(diǎn)充分暴露,有利于與抗APOE抗體充分結(jié)合的反應(yīng)劑,包括5-200mmol/L緩沖液、0.1-10%的表面活性劑、0.1-40%電解質(zhì)、20%-80%高分子加速劑、0.1%-0.5%反應(yīng)促進(jìn)劑、0.1%-1%的穩(wěn)定劑以及適量防腐劑,其余為純化水。b、試劑R2一種與人血清中的APOE抗原有高度特異反應(yīng)性的抗APOE抗體溶液,在一定量的試劑R1中加入體積比為20-50%的抗人APOE抗血清以及0.001%-5%的抗氧化劑;c、恒定值校準(zhǔn)液一種用來(lái)與樣品比較,進(jìn)行結(jié)果計(jì)算的液體血清型溶液,包括20-100mmol/L的緩沖液、80-160mg/L的APOE抗原、0.01-20mmol/L的抗氧化劑、0.01-15mmol/L的增效劑、0.1-50mmol/L的穩(wěn)定劑、適量防腐劑,其余為純化水。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種載脂蛋白E檢測(cè)試劑,其特征在于試劑R2中還加入反應(yīng)促進(jìn)劑聚凝胺。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種載脂蛋白E檢測(cè)試劑,其特征在于所述的增效劑可選用檸檬酸、灑石酸、抗壞血酸中的一種或多種。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種載脂蛋白E檢測(cè)試劑,其特征在于所述抗氧化劑先溶解在IO-IOOml丙二醇或乙醇中,然后加入試劑R2中。全文摘要本發(fā)明涉及一種測(cè)定血清中APOE的試劑。目的是提供一種樣本無(wú)需稀釋、操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、抗干擾能力強(qiáng),采用優(yōu)質(zhì)新生牛血清代替人血清作為基質(zhì)制備的穩(wěn)定的以液體血清型恒定值校準(zhǔn)液聯(lián)合檢測(cè)載脂蛋白E的試劑。技術(shù)方案是一種載脂蛋白E檢測(cè)試劑包括a、試劑R1緩沖液、表面活性劑、電解質(zhì)、高分子加速劑、反應(yīng)促進(jìn)劑、穩(wěn)定劑以及適量防腐劑,其余為純化水。b、試劑R2在一定量的試劑R1中加入體積比為20-50%的抗人APOE抗血清以及抗氧化劑;c、恒定值校準(zhǔn)液包括緩沖液、APOE抗原、抗氧化劑、增效劑、穩(wěn)定劑、適量防腐劑,其余為純化水。文檔編號(hào)G01N33/96GK101799475SQ20101013941公開(kāi)日2010年8月11日申請(qǐng)日期2010年3月31日優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日發(fā)明者王賢理,蒙凱,蔡其浩申請(qǐng)人:浙江伊利康生物技術(shù)有限公司