一種晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽及其衍生物與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽 及其衍生物與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE)是一種多配體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，其配體包括晚期 糖基化終產(chǎn)物（AGE)、0-淀粉樣蛋白（0-amyloid protein，A|3)等。RAGE通過(guò)介導(dǎo)AGE、 A 0等配體在細(xì)胞表面結(jié)合，激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、細(xì)胞功能異常，在神經(jīng) 退行性疾病如阿爾茨海默?。ˋD)和帕金森?。≒D)等疾病的發(fā)病機(jī)制中起著舉足輕重的作 用。
[0003] 阿爾茨海默?。ˋD)又稱老年性癡呆，是發(fā)生于老年前期，已進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙 和行為損傷為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，是一種慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，老年癡呆 是最常見(jiàn)的類型。臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶障礙，失語(yǔ)，失用，失認(rèn)，視空間能力損失，抽象思 維和計(jì)算能力損失，人格和行為改變，阿爾茨海默病國(guó)際發(fā)布年度報(bào)表顯示，2010全球癡呆 人數(shù)3560萬(wàn)，2030年將達(dá)到6570萬(wàn)，2050可能有1. 1540億人，但是迄今為止對(duì)AD尚無(wú)特 效治療的方法，因此，尋找新型特效藥物，是目前全球的迫切追求，研制AD特效藥物不僅對(duì) 個(gè)人和家庭產(chǎn)生極其深遠(yuǎn)的影響，對(duì)社會(huì)也有不可估量的貢獻(xiàn)。
[0004] 阿爾茨海默病（AD)，其發(fā)病機(jī)制主要是腦內(nèi)|3 -淀粉樣蛋白（|3 -amyloid protein，A|3 )在腦內(nèi)沉積形成老年斑造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥病理 變化（Ellis et al，1996)越來(lái)越多的證據(jù)表明AD患者外周血中的Af3損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞， 破壞血腦屏障，使得血腦屏障通透性改變，進(jìn)一步加大外周血A 0通過(guò)血腦屏障，沉積在腦 內(nèi)，加重 AD 病理癥狀（Biron K E et al，PI0S ONE 20116(8) :e23789)。RAGE 是血腦屏障 上（BBB)參與A 轉(zhuǎn)運(yùn)的重要載體，主要負(fù)責(zé)將外周血A 轉(zhuǎn)運(yùn)到腦。正常生理?xiàng)l件下，在 BBB上RAGE可在納摩爾水平結(jié)合外周血循環(huán)中的Af3將其轉(zhuǎn)運(yùn)入腦。阻斷Af3外向轉(zhuǎn)運(yùn)， 經(jīng)RAGE內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)40min后腦內(nèi)可溶性A0全部由外周循環(huán)中的A0充滿，在AD中的BBB 上 RAGE 表達(dá)明顯上調(diào)（Slowi A，et al，M0L NERURODEGENER 20127:55)。而 RAGE 表達(dá)上 調(diào)能增加Af3入腦，促進(jìn)腦內(nèi)Af3的沉積，可見(jiàn)RAGE對(duì)Af3轉(zhuǎn)運(yùn)在AD中的作用極其重要。
[0005] A 0 -RAGE信號(hào)通路與BBB損傷：在BBB上RAGE與A 0相互作用，引起 微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并通過(guò)NF-kB正反饋RAGE表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)Af3入腦沉 積及引起細(xì)胞損傷，破壞血腦屏障的緊密連接系統(tǒng)（BBB-TJ) (Origlia N et al， ANN N YACID SCI，200B，1126:147-151)主要通過(guò)以下三種途徑破壞血腦屏障：⑴ A0 -RAGE-Ca2+-Calcineurin信號(hào)通路：TJ信號(hào)主要是通過(guò)Ca2+調(diào)節(jié)的，Ca 2+參與了各種細(xì) 胞間連接的形成，對(duì)TJ正常功能的維持有重要作用。Af3 -RAGE能直接和間接的引起Ca2+ 向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)流，而Ca2+濃度的改變會(huì)進(jìn)一步影響TJ的形成，導(dǎo)致TJ結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的破壞。 另外，鈣調(diào)磷酸酶是唯一受Ca 2/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶，體外實(shí)驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)A -RAGE損傷TJ蛋白，增加BBB的通透性并能增加內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+濃度，抑制RAGE和 媽調(diào)磷酸酶能夠阻斷A0誘導(dǎo)的TJ損傷，改善BBB的通透性（KOO SY，et al J Neurosci 2012,32(26) :8845-8854)。綜上可知Ca2+參與了 BBB的損傷，CaNZ作為Ca2+/CaM通路的重 要磷酸化酶，其活性受A 0 -RAGE的調(diào)節(jié)。（2) A 0 -RAGE-MMPs信號(hào)通路：BBB通透性增強(qiáng)與 MMPs增加有關(guān)，抑制MMPs基因后表現(xiàn)出對(duì)大腦有保護(hù)作用，且主要降低了 BBB通透性（Hu Q, et al Exp neurol，2009, 216 (1) 35-46)。AD患者 BBB 通透性增加，ECsMMP-2, MMP-9 表 達(dá)顯著增高，claudine-1，claudin-5表達(dá)減少，A0-RAGE相互作用增加內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2， MMP-9的表達(dá)，減少claudin-1，claudin-5的含量，損傷TJ結(jié)構(gòu)，而阻斷A 0與RAGE結(jié)合 能夠抑制A 0誘導(dǎo)的大腦內(nèi)皮細(xì)胞MMPs的表達(dá)。可見(jiàn)，A 0損傷BBB與RAGE誘導(dǎo)MMP-2， MMP-9表達(dá)增加有關(guān)。（3)Af3-RAGE-內(nèi)皮細(xì)胞炎癥：Af3與RAG E相互作用觸發(fā)R0S的生成 并激活炎癥通路，激活NF-kB，NF-kB作為一種正反饋促進(jìn)RAGE的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)R0S的生 成也會(huì)放大加重炎癥過(guò)程，造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷凋亡，最終破壞BBB的完整性，造成BBB的 損傷。
[0006] A0能上調(diào)腦內(nèi)RAGE水平，并能通過(guò)RAGE活化神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)通路，引起氧化應(yīng)激， 炎癥損傷。因此RAGE不僅能通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)A 0入腦促進(jìn)A 0的沉積，還能激活炎癥反應(yīng)損傷 腦組織進(jìn)而促進(jìn)AD發(fā)病。在正常健康人腦組織中RAGE表達(dá)量很少，在AD患者中RAGE分 布廣泛并且表達(dá)明顯上調(diào)。而且在Af3沉積多的組織中RAGE表達(dá)量明顯增高，Af3沉積少 的組織RAGE表達(dá)量低。RAGE表達(dá)量高的組織炎癥損傷嚴(yán)重，A 0與RAGE結(jié)合引起氧化應(yīng) 激，激活炎癥反應(yīng)，造成線粒體損傷，改變線粒體膜電位，增加線粒體通透性，線粒體可以介 導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路的發(fā)生，釋放細(xì)胞色素C導(dǎo)致caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加強(qiáng)PI3K/AKT通 路，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，并且能夠顯著激活核轉(zhuǎn)錄因子_kB形成正反饋促進(jìn)更多的RAGE表達(dá)，進(jìn) 一步加重神經(jīng)元損傷。AI3通過(guò)線粒體引起的氧化應(yīng)激的具體機(jī)制：（1)導(dǎo)致的線粒體功 能障礙，在APP轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C的活力減弱，Af3同時(shí)也是復(fù)合體IV的強(qiáng)效 抑制劑，AD患者中Af3通過(guò)對(duì)線粒體內(nèi)能量產(chǎn)生過(guò)程中的不同酶的抑制影響線粒體功能， 造成線粒體功能障礙。（2)導(dǎo)致氧化應(yīng)激以及R0S的產(chǎn)生：在正常機(jī)體細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生少量的 R0S，少量的R0S對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯影響，但是在AD患者中神經(jīng)元細(xì)胞會(huì)大量產(chǎn)生R0S。少量 的R0S起著信號(hào)傳導(dǎo)的作用，過(guò)多的R0S會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷，擾亂線粒體膜電位穩(wěn)定，繼而 產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)因子，激活細(xì)胞凋亡，最終引起細(xì)胞死亡。而線粒體是細(xì)胞的能量產(chǎn)生部位， 線粒體功能異常，造成能量代謝障礙，從而進(jìn)一步影響細(xì)胞功能。研宄還發(fā)現(xiàn)AD患者細(xì)胞 內(nèi)線粒體明顯減少（51^〇1^]7,6七31，？1'〇111:13；[08(3；[，2008 718-736)。（3)氧化應(yīng)激可導(dǎo)致 線粒體蛋白結(jié)構(gòu)異常：R0S損傷線粒體的另一種重要方式一線粒體蛋白損傷。線粒體蛋白 錯(cuò)誤折疊和聚集可導(dǎo)致嚴(yán)重的線粒體功能異常，甚至導(dǎo)致線粒體自噬。（4)R0S可損傷線粒 體DNA :人類線粒體DNA是雙鏈，環(huán)形結(jié)構(gòu)，大小約16. 5kb，包括蛋白質(zhì)合成基因和氧化磷酸 化成分合成基因，在AD患者中無(wú)論是核DNA還是線粒體DNA氧化修飾都有升高。事實(shí)上呼 吸鏈復(fù)合體有13個(gè)亞單位中的3個(gè)是有線粒體DNA編碼的，因此線粒體DNA氧化損傷可導(dǎo) 致線粒體復(fù)合體結(jié)構(gòu)的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能異常（Valavanidis A et al，JESHCECER 2009, 120-139)0
[0007] 在腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞是最主要的免疫細(xì)胞，在正常狀態(tài)下，RAGE和CD47等膜表面受 體在Af3的內(nèi)吞過(guò)程中其主要作用，是腦內(nèi)Af3自身清楚的主要途徑，對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞有很 好的保護(hù)作用，但是在AD患者中由于腦內(nèi)Af3大量積累，超出了小膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)吞能力，過(guò) 多的A 0與小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面受體RAGE結(jié)合相互作用激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，小膠質(zhì)細(xì)胞釋 放大量的促炎癥因子損傷神經(jīng)細(xì)胞，破壞腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。和神經(jīng)元一樣，小膠質(zhì)細(xì)胞同樣 能通過(guò)A 0 -RAGE激活NF-kB，上調(diào)RAGE，形成一個(gè)正反饋。
[0008] 隨著我國(guó)社會(huì)老齡化的加快，神經(jīng)退行性病變的發(fā)生率及患病率逐年升高，65歲 以后的老人中，每增加5歲AD的發(fā)病率提高一倍，而85歲以上的老人中20% -50 %患有不 同程度的AD。AD給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，給病患個(gè)人及家庭帶來(lái)了不可估量的負(fù)擔(dān)， 因此研宄治療AD的特效藥具有重要的社會(huì)現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種晚期糖基化終 產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽，該拮抗肽其能夠與RAGE專一結(jié)合，抑制RAGE作用。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽的衍生 物，該衍生物能夠與RAGE專一結(jié)合，抑制RAGE作用。
[0011] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽及其衍 生物的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0013] -種晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽，其氨基酸殘基序列為：Ala-Pro-Asp -Thr-Lys-Thr-Gln(APDTKTQ)；
[0014] 所述的晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽的衍生物為晚期糖基化終產(chǎn)物受 體的特異性拮抗肽氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)上、晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽片段的氨基 端或羧基端進(jìn)行常規(guī)修飾得到的產(chǎn)物，或者為晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽上連 接用于多肽或蛋白檢測(cè)或純化的標(biāo)簽所得到的產(chǎn)物；
[0015] 所述的常規(guī)修飾優(yōu)選為氨基化、酰胺化、羥基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙?；?磷酸化、酯化、糖基化、環(huán)化、生物素化、熒光基團(tuán)修飾、聚乙二醇PEG修飾或固定化修飾等；
[0016] 所述的標(biāo)簽為把86、65!'46??、]\??、恥8、擬、1§6、？1^6、(3-]\^(3或？1'〇打11行7 6父&(^ 等；
[0017] 所述的晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽的衍生物優(yōu)選為上述晚期糖基化 終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽第二個(gè)氨基酸殘基為D構(gòu)型脯氨酸，末端進(jìn)行酰胺化修飾，即 為 Ala- (d) Pr〇-Asp-Thr-Lys-Th;r-Gln-NH2;
[0018] 所述的晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽及其衍生物的制備，采用現(xiàn)有技術(shù) 中的公知方法進(jìn)行，既可以用多肽自動(dòng)合成儀進(jìn)行化學(xué)合成，也可以通過(guò)將短肽序列推導(dǎo) 出核苷酸序列，然后克隆到表達(dá)載體中進(jìn)行生物合成；
[0019] 所述的晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽及其衍生物可以應(yīng)用于制備治療 神經(jīng)退行性疾病的藥物；
[0020] 一種治療神經(jīng)退行性疾病的藥物，包含上述晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗 肽和晚期糖基化終產(chǎn)物受體的特異性拮抗肽的衍生物中的至少一種；
[0021] 所述的治療神經(jīng)退行性疾病的藥物還可以含有一種或者是至少兩種藥學(xué)上可以 接受的載體；
[0022] 所述的載體優(yōu)先為緩釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、 吸附載體、表面活性劑或潤(rùn)滑劑等；
[0023] 所述的治療神經(jīng)退行性疾病的藥物可以進(jìn)一步制成注射劑，片劑，粒劑，膠囊等多 種形式，各種劑型的藥物可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備；
[0024] 所述的神經(jīng)退行性