專利名稱：用于治療rage相關(guān)病癥的組合物和方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/404,205的提交日期的益處，該申請(qǐng)的提交日為2002年8月16日，且該申請(qǐng)被命名為“Methods andCompositions for Treating Rage Associated Diseases(用于治療RAGE相關(guān)疾病的方法和組合物)”。該參考臨時(shí)申請(qǐng)的完整內(nèi)容被引入此處，作為參考。
背景技術(shù)：
許多嚴(yán)重的人類病癥均與高級(jí)糖基化終產(chǎn)物受體配體(RAGE配體)生成增加或與RAGE本身生成增加相關(guān)。這些病癥中的大部分，包括例如多種癌癥、慢性炎性疾病、糖尿病、淀粉樣變性和心血管疾病，尚無(wú)始終有效的治療方法。因此，獲得RAGE相關(guān)病癥的療法是有益的。
發(fā)明概述在某些方面，本申請(qǐng)涉及一種融合蛋白，該融合蛋白含有高級(jí)糖基化終產(chǎn)物配體結(jié)合元件受體(RAGE-LBE)和免疫球蛋白元件。在某些實(shí)施方案中，該RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分。在某些方面，該RAGE-LBE含有圖7所示氨基酸序列中的氨基酸殘基1-344、1-330、1-321、1-230或1-118。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)融合蛋白包含具有圖7所示氨基酸序列中的Ig1、Ig2和Ig3區(qū)；Ig1和Ig2區(qū)；或Ig1區(qū)的RAGE-LBE。在另一些實(shí)施方案中，RAGE-LBE具有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，其中該點(diǎn)突變提高了RAGE-LBE對(duì)高級(jí)糖基化終產(chǎn)物結(jié)合配偶體受體(RAGE-BP)的結(jié)合親和力。
在某些方面，本申請(qǐng)涉及含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件的融合蛋白，其中該免疫球蛋白元件包括免疫球蛋白重鏈。在某些實(shí)施方案中，該免疫球蛋白元件包括Fc區(qū)。在某些情況中，該免疫球蛋白重鏈選自IgM、IgD、IgE和IgA重鏈。在進(jìn)一步的方面中，該免疫球蛋白重鏈選自IgG1、IgG2β、IgG2α和IgG3重鏈。在某些實(shí)施方案中，該免疫球蛋白元件可包括CH1和Fc區(qū)。在某些情況中，該免疫球蛋白元件包括第一類免疫球蛋白的CH1區(qū)，和第二類免疫球蛋白的CH1區(qū)，其中該第一類免疫球蛋白與第二類免疫球蛋白不同。
在另一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及一種融合蛋白，該融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件，進(jìn)一步包括二聚化多肽。
在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)也涉及一種包含本發(fā)明融合蛋白和藥學(xué)可接受載體的組合物。
本申請(qǐng)還涉及一種融合蛋白，該融合蛋白含有RAGE-LBE和第二區(qū)，該第二區(qū)選自二聚化多肽、純化多肽、穩(wěn)定化多肽和導(dǎo)向多肽。在某些實(shí)施方案中，二聚化多肽包括兩親性多肽。該兩親性多肽可包含最多達(dá)50個(gè)氨基酸、最多達(dá)30個(gè)氨基酸、最多達(dá)20個(gè)氨基酸或最多達(dá)10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該二聚化多肽具有肽螺旋束。在某些實(shí)施方案中，該二聚化多肽具有亮氨酸拉鏈。該亮氨酸拉鏈可以是jun拉鏈或fos拉鏈。在某些實(shí)施方案中，該二聚化多肽包括具有帶正電或負(fù)電荷殘基的多肽，其中該多肽可與帶相反電荷的另一個(gè)肽結(jié)合。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及一種具有特定氨基酸序列的融合蛋白，該氨基酸序列與圖3A所示氨基酸序列存在至少90％的同一性。在某些方面，本申請(qǐng)涉及編碼特定多肽融合體的核酸序列，該多肽融合體包含RAGE-LBE和免疫球蛋白元件。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及編碼一種多肽的核酸序列，該多肽與圖3A所示氨基酸序列存在至少90％的同一性。在某些實(shí)施方案中，該核酸序列編碼可通過C-或N-末端氨基或羧基與免疫球蛋白元件融合的RAGE-LBE。該RAGE-LBE可包括RAGE的胞外部分。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)核酸序列編碼RAGE-LBE，包含圖7所示氨基酸序列中的氨基酸殘基1-344、1-330、1-321、1-230或1-118。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該RAGE-LBE具有Ig1、Ig2和Ig3區(qū)；Ig1和Ig2區(qū)；或Ig1區(qū)。在另一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及編碼RAGE-LBE多肽的核酸序列，該RAGE-LBE多肽具有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，其中該點(diǎn)突變提高了RAGE-LBE對(duì)RAGE-BP的結(jié)合親和力。在某些實(shí)施方案中，該核酸序列編碼具有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變的RAGE-LBE，其中該點(diǎn)突變提高了RAGE-LBE對(duì)RAGE-BP的結(jié)合親和力。
在某些方面，本申請(qǐng)涉及編碼特定融合蛋白的核酸序列，該融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件，其中免疫球蛋白元件包括免疫球蛋白重鏈。在某些實(shí)施方案中，該免疫球蛋白元件包括Fc區(qū)。在某些情況中，該免疫球蛋白重鏈選自IgM、IgD、IgE和IgA重鏈。在進(jìn)一步的方面中，該免疫球蛋白重鏈選自IgG1、IgG2β、IgG2α和IgG3重鏈。在某些實(shí)施方案中，該免疫球蛋白元件可包括CH1和Fc區(qū)。在某些情況中，該免疫球蛋白元件包括第一類免疫球蛋白的CH1區(qū)，和第二類免疫球蛋白的CH1區(qū)，其中該第一類免疫球蛋白與第二類免疫球蛋白不同。
在另一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及編碼特定融合蛋白的核酸序列，該融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件，進(jìn)一步包括第二區(qū)，該第二區(qū)選自二聚化多肽、穩(wěn)定化多肽、純化多肽或?qū)蚨嚯摹?br> 在一種進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)核酸進(jìn)一步含有被可操作性地連接至特定核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，從而使本申請(qǐng)核酸適合被用作表達(dá)載體。在某些實(shí)施方案中，該核酸進(jìn)一步含有啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子增強(qiáng)了該核酸分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。本申請(qǐng)還涉及含有本申請(qǐng)核酸的表達(dá)載體。在某些實(shí)施方案中，該表達(dá)載體可在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的至少一種細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。本申請(qǐng)進(jìn)一步涉及由本申請(qǐng)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。此外，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N制備RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白的方法，該方法包括在適合表達(dá)該融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)本申請(qǐng)宿主細(xì)胞，任選地，該方法可進(jìn)一步包括純化程序，以提高融合蛋白的純度。
在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N分離的抗體或其片段，該分離抗體或其片段可與圖3A所示氨基酸序列的表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，該抗體可與圖7所示氨基酸序列中氨基酸殘基1-330、1-321、1-230或1-118的表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，該抗體抑制RAGE與一個(gè)或多個(gè)RAGE-BP的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N分離的抗體或其片段，該分離抗體或其片段可與圖3A所示氨基酸序列的表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)，其中該抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體、Fab片段和單鏈抗體。任選地，該抗體標(biāo)記有可檢測(cè)標(biāo)記。本申請(qǐng)還涉及本申請(qǐng)多克隆抗體的純化制劑。
在一種進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及一種蛋白質(zhì)復(fù)合體，該蛋白質(zhì)復(fù)合體含有一種或多種融合蛋白，其中該融合蛋白選自a)含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件的融合蛋白；和b)含有RAGE-LBE和第二區(qū)的融合蛋白，該第二區(qū)選自二聚化區(qū)、穩(wěn)定化區(qū)、純化區(qū)和導(dǎo)向區(qū)。
本申請(qǐng)還涉及含有RAGE-LBE和TNF-α抑制劑的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及含有融合蛋白和TNF-α抑制劑的藥物組合物，其中該融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件。本申請(qǐng)進(jìn)一步涉及含有融合蛋白的藥物組合物，其中該融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件。在某些方面，該RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分。在某些實(shí)施方案中，該RAGE-LBE含有圖7所示氨基酸序列的氨基酸殘基1-344、1-330、1-321、1-230或1-118。在某些實(shí)施方案中，該RAGE-LBE具有Ig1、Ig2和Ig3區(qū)、Ig1和Ig2區(qū)；或Ig1區(qū)。
在某些方面，本申請(qǐng)藥物組合物中的RAGE-LBE具有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，其中該點(diǎn)突變提高了RAGE-LBE對(duì)RAGE-BP的結(jié)合親和力。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)藥物組合物含有TNF-α抑制劑，其中該TNF-α抑制劑選自小分子、抗體、肽模擬物和TNFRII-Fc融合蛋白。
在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)藥物組合物含有免疫球蛋白元件，其中該免疫球蛋白元件包括免疫球蛋白重鏈。在某些實(shí)施方案中，該免疫球蛋白元件包括Fc區(qū)。在某些情況中，該免疫球蛋白重鏈選自IgM、IgD、IgE和IgA重鏈。在進(jìn)一步的方面中，該免疫球蛋白重鏈選自IgG1、IgG2β、IgG2α和IgG3重鏈。在某些實(shí)施方案中，該免疫球蛋白元件可包括CH1和Fc區(qū)。在某些情況中，該免疫球蛋白元件包括第一類免疫球蛋白的CH1區(qū)，和第二類免疫球蛋白的CH1區(qū)，其中該第一類免疫球蛋白和第二類免疫球蛋白不同。在另一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及一種藥物組合物，該藥物組合物含有RAGE-LBB，進(jìn)一步包括二聚化多肽。
在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及一種鑒定化合物的方法，該化合物可抑制RAGE-BP多肽與受體多肽之間的相互作用，其中RAGE-BP多肽選自S100和兩性蛋白(amphoterin)，受體多肽選自RAGE、RAGE-LBE和RAGE-LBE-免疫球蛋白融合體，該方法包括a)在特定條件，即不存在試驗(yàn)化合物，且RAGE-BP多肽與受體多肽相互作用的條件下，形成反應(yīng)混合物，該混合物包括i)RAGE-BP多肽，為S100或兩性蛋白；ii)受體多肽，為RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合體；和iii)試驗(yàn)化合物；并b)檢測(cè)RAGE-BP多肽與受體多肽之間的相互作用，其中與無(wú)試驗(yàn)化合物條件下RAGE-BP多肽與受體多肽之間的相互作用水平相比，試驗(yàn)化合物存在條件下RAGE-BP多肽與受體多肽之間的相互作用減弱，說明該試驗(yàn)化合物具有抑制活性。在某些實(shí)施方案中，該RAGE-BP為S100(諸如S100B或S100a12)或兩性蛋白。
本申請(qǐng)進(jìn)一步涉及一種鑒定化合物的方法，該化合物可抑制RAGE-BP多肽誘導(dǎo)的RAGE信號(hào)傳遞活性，該RAGE-BP多肽選自S100和兩性蛋白，該方法包括a)使細(xì)胞接觸RAGE-BP多肽，即S100或兩性蛋白；b)在特定條件，即不存在試驗(yàn)化合物，且RAGE信號(hào)傳遞活性正常發(fā)生的條件下，使細(xì)胞接觸試驗(yàn)化合物；并c)檢測(cè)該RAGE-BP誘導(dǎo)的RAGE信號(hào)傳遞活性，其中與無(wú)試驗(yàn)化合物條件下的信號(hào)傳遞活性的水平相比，該試驗(yàn)化合物存在條件下RAGE-BP所誘導(dǎo)的RAGE信號(hào)傳遞活性降低，說明該試驗(yàn)化合物具有抑制活性。在某些實(shí)施方案中，該RAGE-BP為S100(諸如S100B或S100a12)或兩性蛋白。在某些方面，抑制RAGE-BP所誘導(dǎo)RAGE信號(hào)傳遞活性的化合物可抑制NF-kB轉(zhuǎn)錄活性的活化，或促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)活性的活化。
在另一種實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N抑制RAGE與RAGE-BP之間相互作用的方法，該方法包括施用含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。在另一種實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及一種抑制RAGE與RAGE-BP之間相互作用的方法，該方法包括施用可與圖3A所示氨基酸序列中的表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的抗體或其片段。本申請(qǐng)進(jìn)一步涉及一種抑制RAGE和RAGE-BP之間相互作用的方法，該方法包括施用可通過本申請(qǐng)方法鑒定的化合物。
在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N降低內(nèi)源RAGE活性的方法，該方法包括施用含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。在某些方面，本申請(qǐng)涉及一種降低內(nèi)源RAGE活性的方法，該方法包括施用可與圖3A所示氨基酸序列中的表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的抗體或其片段。在另一種實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及一種降低內(nèi)源RAGE活性的方法，該方法包括施用可通過本申請(qǐng)方法鑒定的化合物。
在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及一種治療RAGE相關(guān)病癥的方法，該方法包括施用含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及一種治療RAGE相關(guān)病癥的方法，該方法包括施用可與圖3A所示氨基酸序列中的表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的抗體或其片段。還有另一種實(shí)施方案，本申請(qǐng)涉及一種治療RAGE相關(guān)病癥的方法，該方法包括施用可通過本申請(qǐng)方法鑒定的化合物。在某些方面，本申請(qǐng)組合物與一種或多種藥劑聯(lián)合施用，其中該藥劑用于治療選自下列的一種或多種狀況，即淀粉樣變性、癌癥、關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、朊病毒相關(guān)病癥、脈管炎、腎病、視網(wǎng)膜病和神經(jīng)病。任選地，該藥劑選自抗炎劑、抗氧化劑、β阻斷劑、抗血小板劑、ACE抑制劑、降脂劑、抗血管發(fā)生劑和化學(xué)療法。一種實(shí)施方案中，該藥劑為氨甲蝶呤。另一種實(shí)施方案中，急性炎性疾病為膿毒癥。還有一種實(shí)施方案中，心血管疾病為再狹窄。
在某些方面，上述方法中的RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分。在某些實(shí)施方案中，該RAGE-LBE含有圖7所示氨基酸序列中的氨基酸殘基1-344、1-330、1-321、1-230或1-118。在某些實(shí)施方案中，該RAGE-LBE具有Ig1、Ig2和Ig3區(qū)；Ig1和Ig2區(qū)；或Ig1區(qū)。在某些實(shí)施方案中，該RAGE-LBE具有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，其中該點(diǎn)突變可提高RAGE-LBE對(duì)RAGE-BP的結(jié)合親和力。
在某些實(shí)施方案中，上述方法中的免疫球蛋白元件包括免疫球蛋白重鏈。在某些實(shí)施方案中，該免疫球蛋白元件包括Fc區(qū)。在某些方面，該免疫球蛋白重鏈選自IgM、IgD、IgE和IgA重鏈。在進(jìn)一步的方面中，該免疫球蛋白重鏈選自IgG1、IgG2β、IgG2α和IgG3重鏈。在某些實(shí)施方案中，該免疫球蛋白元件可包括CH1和Fc區(qū)。在某些情況中，該免疫球蛋白元件包括第一類免疫球蛋白的CH1區(qū)，和第二類免疫球蛋白的CH1區(qū)，其中該第一類免疫球蛋白與第二類免疫球蛋白不同。
在另一種實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N治療RAGE相關(guān)病癥的方法，該方法包括施用一種組合物，該組合物含有TNF-α抑制劑和至少一種RAGE-LBE，或一種含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。本申請(qǐng)還涉及一種治療RAGE相關(guān)病癥的方法，該方法包括施用一種組合物，該組合物包含至少一種含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。
可通過本申請(qǐng)方法治療的RAGE相關(guān)病癥包括淀粉樣變性、癌癥、關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、朊病毒相關(guān)病癥、脈管炎、腎病、視網(wǎng)膜病和神經(jīng)病。在某些方面，該RAGE相關(guān)病癥為阿爾茨海默氏病?？赏ㄟ^本申請(qǐng)方法治療的慢性炎性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、腸易激疾病、多發(fā)性硬化、銀屑病、狼瘡或任意其它自身免疫病?？赏ㄟ^本申請(qǐng)方法治療的急性炎性疾病包括膿毒癥?？赏ㄟ^本申請(qǐng)方法治療的心血管疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A顯示了鼠可溶性RAGE-Fc融合蛋白的核苷酸序列。
圖1B顯示了鼠可溶性RAGE-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
圖2A顯示了鼠可溶性TNFRII的核苷酸序列。
圖2B顯示了鼠可溶性TNFRII的氨基酸序列。
圖3A顯示了與突變IgG1重鏈的CH2、CH3和鉸鏈區(qū)融合的人RAGE的氨基酸序列。
圖3B顯示了與突變IgG1重鏈的CH2、CH3和鉸鏈區(qū)融合的人RAGE的核苷酸序列。
圖4顯示了對(duì)特定小鼠的軀體評(píng)分，這些小鼠被誘導(dǎo)出現(xiàn)了CIA，并在誘導(dǎo)CIA后的不同時(shí)期分別接受了RAGE-LBE融合蛋白、sTNFRII或空載體治療。
圖5為示意圖，顯示了RAGE-LBE融合蛋白的多個(gè)實(shí)例。
圖6顯示RAGE-LBE-Fc融合蛋白與RAGE配體結(jié)合。
圖7顯示了人RAGE的氨基酸序列。
圖8顯示了人RAGE的核酸序列。
圖9顯示RAGE-LBE-Fc由CHO細(xì)胞分泌。將溫育過夜+/-N-聚糖酶(以除去N連接的寡糖)的條件培養(yǎng)基上樣至SDS-PAGE(還原的)。利用對(duì)Fc區(qū)具有特異性的抗體檢測(cè)RAGE-LBE-Fc。分子量偏移說明存在N連接的寡糖。多個(gè)hRAGE-LBE-Fc種類說明可能存在其它翻譯后修飾。
圖10顯示了對(duì)人RAGE的序列分析結(jié)果。對(duì)人RAGE-Fc的分析結(jié)果顯示1)N末端殘基為已環(huán)化并形成焦谷氨酸的谷氨酰胺(Q)；且2)成熟肽2位上的天冬酰胺(N)存在N連接的修飾。
發(fā)明詳述1.定義為方便起見，此處集中了本說明書、實(shí)施例及所附權(quán)利要求中所應(yīng)用的某些術(shù)語(yǔ)。如無(wú)另外指明，此處所用的所有技術(shù)和學(xué)術(shù)術(shù)語(yǔ)均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域任一普通技術(shù)人員通常理解的意義相同。
冠詞“一個(gè)”和“一種”在此文中被用于指該冠詞在語(yǔ)法上的一個(gè)或一個(gè)以上(即至少一個(gè))賓語(yǔ)。例如，“一個(gè)元件”意為一個(gè)元件或一個(gè)以上的元件。
術(shù)語(yǔ)“二聚化多肽”或“二聚化區(qū)”包括任何可與另一個(gè)多肽形成二聚體(或高級(jí)復(fù)合體，諸如三聚體、四聚體等)的多肽。任選地，該二聚化多肽與其它相同二聚化多肽相連，可形成同多聚體。IgG Fc元件是一個(gè)可形成同多聚體的二聚化區(qū)實(shí)例。任選地，該二聚化多肽與其它不同二聚化多肽相連時(shí)，可形成異多聚體。Jun亮氨酸拉鏈區(qū)可與Fos亮氨酸拉鏈區(qū)形成二聚體，這也是一個(gè)可形成異多聚體的二聚化區(qū)實(shí)例。二聚化區(qū)既可形成異多聚體，也可形成同多聚體。
“表達(dá)構(gòu)建體”指任意重組核酸，包括足以介導(dǎo)在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)的可表達(dá)核酸和調(diào)節(jié)元件。
術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”和“嵌合蛋白”可互換使用，指具有特定氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽，該氨基酸序列含有與來源自兩種或兩種以上蛋白質(zhì)的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的部分。來源自兩種或兩種以上蛋白質(zhì)的序列可以是這些蛋白質(zhì)的整體或部分(即片段)。融合蛋白也可含有位于特定部分之間的氨基酸連接區(qū)域，該特定部分與上述蛋白質(zhì)來源序列部分對(duì)應(yīng)。這種融合蛋白可通過重組法制備，其中通過核酸酶和連接酶的處理，將相應(yīng)核酸連接，并整合進(jìn)表達(dá)載體中。融合蛋白的制備已普遍被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解。
術(shù)語(yǔ)“核酸”指多核苷酸，諸如脫氧核糖核酸(DNA)，并在合適的地方指核糖核酸(RNA)。該術(shù)語(yǔ)也應(yīng)被理解為包括等同物，即由核苷酸類似物形成的RNA或DNA類似物，并且當(dāng)該術(shù)語(yǔ)應(yīng)用于本文所描述的實(shí)施方案時(shí)，還包括單(有義或反義)和雙鏈多核苷酸。
如上下文未另外指明，術(shù)語(yǔ)“或”在此文中意為術(shù)語(yǔ)“和/或”，并可與其互換使用。
術(shù)語(yǔ)“同一性百分率”兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性。通過比較各序列中的一個(gè)位置便可確定同一百分率，其中出于比較的目的，序列可以被比對(duì)。同一性百分率表達(dá)式指被比較序列共有位置上相同氨基酸或核酸的數(shù)量的函數(shù)?？刹捎枚喾N比對(duì)算法和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST可作為GCG序列分析程序包(University of Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分被提供，并可利用例如，默認(rèn)設(shè)置。ENTREZ可通過NationalCenter for Biotechnology Information(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)、National Library of Medicine(美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館)、National Institutes of Health(美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院)，Bethesda，Md.獲得。一種實(shí)施方案中，兩個(gè)序列的同一性百分率可由GCG程序確定，該程序所用空位權(quán)重為1，例如，每個(gè)氨基酸空位被加權(quán)為兩個(gè)序列之間單個(gè)氨基酸或核苷酸錯(cuò)配。
在由Harcourt Brace & Co.，San Diego，California，USA的一個(gè)部門，即Doolittle，Academic Press，Inc.所編輯的Methods inEnzymology，vol.266Computer Methods for MacromolecularSequence Analysis(酶學(xué)方法，266卷用于大分子序列分析的計(jì)算機(jī)方法)(1996)中，描述了其它序列比對(duì)技術(shù)。優(yōu)選采用允許序列中存在空位的序列比對(duì)程序?qū)π蛄羞M(jìn)行比對(duì)。Smith-Waterman是一種允許序列比對(duì)中存在空位的算法。參見Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)。同樣，利用Needleman和Wunsch序列比對(duì)法的GAP程序也可被用于比對(duì)序列。一種可選的研究方案采用了可在MASPAR計(jì)算機(jī)上運(yùn)行的MPSRCH軟件。MPSRCH采用了Smith-Waterman算法，可在大規(guī)模并行計(jì)算機(jī)上對(duì)序列評(píng)分。該方法提高了選取遠(yuǎn)距離相關(guān)匹配的能力，并且尤其能夠容許小空位和核苷酸序列誤差的存在。編碼氨基酸序列的核酸可被用于搜尋蛋白質(zhì)和DNA數(shù)據(jù)庫(kù)。
術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”在此文中可互換使用。
“高級(jí)糖基化終產(chǎn)物配體結(jié)合元件受體”或“AGE-LBE”包括跨膜RAGE多肽(例如，可溶性RAGE)的任意胞外部分，及其保留了結(jié)合RAGE配體能力的片段。
“高級(jí)糖基化終產(chǎn)物結(jié)合配偶體的受體”或“RAGE-BP”包括任何可在生理學(xué)環(huán)境中與RAGE蛋白(受體多肽，諸如，RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)的胞外部分結(jié)合的物質(zhì)(例如多肽、小分子、糖類結(jié)構(gòu)等)。
“RAGE相關(guān)病癥”或“RAGE關(guān)聯(lián)病癥”包括被感染細(xì)胞或組織表現(xiàn)為RAGE或一個(gè)或多個(gè)RAGE配體的表達(dá)和/或活性提高或降低的任何病癥。RAGE相關(guān)病癥也包括任何可通過削弱RAGE功能(包括例如，施用可破壞RAGE∶RAGE-BP之間相互關(guān)系的藥劑)而得以治療(即一種或多種癥狀可被消除或改善)的病癥。
術(shù)語(yǔ)“重組核酸”包括任何含有至少兩個(gè)序列的核酸，而且這兩個(gè)序列并不一起存在于自然中。重組核酸可體外生成，例如，通過利用分子生物學(xué)方法生成，或體內(nèi)生成，例如，通過同源或非同源重組將核酸插入在新的染色體位置上。
與被試者相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“治療”指改善了該被試者所患疾病或病癥的至少一種癥狀。該治療可使上述疾病或病癥痊愈或使其改善。
術(shù)語(yǔ)“載體”指一種核酸分子，該核酸分子可轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一個(gè)核酸。一種類型的載體是附加體，即能夠在染色體外復(fù)制的核酸。另一種類型的載體是被設(shè)計(jì)為與宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)重組的整合載體。載體既可自發(fā)復(fù)制，也可自發(fā)整合，該特性根據(jù)細(xì)胞環(huán)境的不同而不同(即載體可在一種宿主細(xì)胞類型中自發(fā)復(fù)制，而在另一種宿主細(xì)胞類型中則僅僅是整合)。能夠引導(dǎo)特定可表達(dá)核酸的表達(dá)的載體在此文中被稱為“表達(dá)載體”，其中該可表達(dá)核酸與該載體被可操作性地連接在一起。
2.融合蛋白在某些方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝撕懈呒?jí)糖基化終產(chǎn)物配體結(jié)合元件受體(RAGE-LBE)的融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝撕蠷AGE-LBE和免疫球蛋白元件的融合蛋白(例如，如圖1B或3A所示)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該融合蛋白含有RAGE-LBE和第二區(qū)，該第二區(qū)選自二聚化區(qū)、導(dǎo)向區(qū)、穩(wěn)定化區(qū)和純化區(qū)。
RAGE-LBE可以是RAGE蛋白中保留了結(jié)合RAGE配體能力的任意胞外部分。在許多生物體中，該RAGE蛋白為跨膜蛋白，具有該蛋白質(zhì)位于細(xì)胞內(nèi)的一部分(胞內(nèi)部分)和該蛋白質(zhì)位于細(xì)胞外的一部分(胞外部分)。術(shù)語(yǔ)“RAGE配體”涵蓋了在生理學(xué)環(huán)境中可與RAGE或RAGE-LBE結(jié)合的任何物質(zhì)。典型的RAGE配體包括非酶促糖基化加合物(高級(jí)糖基化終產(chǎn)物)、S100/鈣粒蛋白家族的促炎細(xì)胞因子樣分子、兩性蛋白(也被稱為HMG-1或HMGB-1)和諸如那些在淀粉樣結(jié)構(gòu)中被發(fā)現(xiàn)的β折疊原纖維。
在某些實(shí)施方案中，RAGE-LBE含有保留了結(jié)合RAGE配體能力的RAGE片段。在某些方面，本發(fā)明融合蛋白含有保留了結(jié)合RAGE配體能力的RAGE片段和免疫球蛋白元件。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該融合蛋白含有保留了結(jié)合RAGE配體能力的RAGE片段和選自二聚化區(qū)、導(dǎo)向區(qū)、穩(wěn)定化區(qū)和純化區(qū)的第二區(qū)。
如上所述，在某些實(shí)施方案中，RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分，該胞外部分保留了RAGE結(jié)合RAGE配體的能力。在一個(gè)方面中，該RAGE-LBE具有Ig1、Ig2和Ig3區(qū)。在另一個(gè)方面中，該RAGE-LBE具有Ig1和Ig2區(qū)。在另一些方面中，該RAGE-LBE具有RAGE的Ig1區(qū)。還有一個(gè)方面中，該RAGE-LBE具有圖7所示氨基酸序列中的氨基酸殘基1-344、1-330、1-321、1-230或1-118。
還有一種實(shí)施方案中，本發(fā)明包括了RAGE-LBE的氨基酸序列變體。制備這些RAGE-LBE變體具有多個(gè)目的，諸如提高該RAGE-LBE對(duì)其配體的親和力，有助于該結(jié)合配偶體的穩(wěn)定、純化和制備，改善其血漿半衰期，提高療效，并減輕利用此處所描述組合物治療期間所產(chǎn)生副作用的嚴(yán)重程度或減少其發(fā)生。在一種例證性的實(shí)施方案中，該變體RAGE-LBE融合蛋白含有與圖3A所示氨基酸序列存在至少90％同一性的氨基酸序列。
RAGE-LBE的氨基酸序列變體可屬于三類變體中的一種或幾種，這三類變體是插入、置換或缺失變體。這些變體可通過熟練技術(shù)人員所熟知的方法制備，諸如在編碼RAGE-LBE的DNA中進(jìn)行核苷酸位點(diǎn)特異性誘變，通過該方法可獲得編碼該變體的DNA，并隨后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)該DNA。但通過體外合成可方便地制備出具有最多達(dá)大約100-150個(gè)氨基酸殘基的片段。
RAGE-LBE的氨基酸序列變體可以是自然中未發(fā)現(xiàn)的預(yù)定變體，或者是天然存在的等位基因。該RAGE-LBE變體典型地表現(xiàn)出與天然存在內(nèi)源RAGE相同的定性生物學(xué)特性，例如配體結(jié)合活性。
雖然導(dǎo)入氨基酸序列變異的位點(diǎn)可預(yù)先設(shè)定，但突變本身無(wú)需被預(yù)先設(shè)定。例如，為最優(yōu)化特定位點(diǎn)上的突變表現(xiàn)，在目標(biāo)密碼子上進(jìn)行隨機(jī)或飽和誘變(插入全部20個(gè)可能的殘基)，并篩選出具有最佳理想活性組合的表達(dá)RAGE-LBE變體。該篩選法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。
氨基酸插入通常在大約1～10個(gè)氨基酸殘基的數(shù)量級(jí)上；置換典型地導(dǎo)入單個(gè)殘基；而缺失范圍則為大約1～30個(gè)殘基。缺失或插入優(yōu)選地在相鄰殘基對(duì)中發(fā)生，即缺失2個(gè)殘基或插入2個(gè)殘基。從下文論述中可充分理解的是，為獲得最終構(gòu)建體，置換、缺失、插入或這幾種方式的任意組合均可被導(dǎo)入或組合。
RAGE-LBE的插入型氨基酸序列變體指將與RAGE-LBE無(wú)關(guān)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基導(dǎo)入目標(biāo)RAGE-LBE中的預(yù)定位點(diǎn)，并取代已存殘基，從而形成的變體。
對(duì)功能的大體改變可通過選擇較少保守性的置換而得以實(shí)現(xiàn)，即選擇在影響某些特性的維持方面存在更顯著差異的殘基，其中上述特性為a)置換區(qū)域中的多肽主鏈結(jié)構(gòu)，例如折疊片或螺旋構(gòu)象；b)目標(biāo)位點(diǎn)上分子的電荷或疏水性；或c)側(cè)鏈的體積。通常，被認(rèn)為最大程度改變了RAGE-LBE特性的置換是(a)親水殘基，例如絲氨?；蛱K氨?；恢脫Q為疏水殘基，例如亮氨酰基、異亮氨酰基、苯丙氨?；?、纈氨?；虮滨；?；(b)半胱氨酸或脯氨酸被置換為其它任意殘基；(c)具有正電性側(cè)鏈的殘基，例如賴氨酰基、精氨酰基或組氨?；恢脫Q為負(fù)電性殘基，例如谷氨?；蛱於滨；?；或(d)具有龐大側(cè)鏈的殘基，例如苯丙氨酸被置換為無(wú)側(cè)鏈的殘基，例如甘氨酸。
通常，可合理地預(yù)期將例如，亮氨酸單獨(dú)置換為異亮氨酸或纈氨酸，天冬氨酸單獨(dú)置換為谷氨酸，蘇氨酸單獨(dú)置換為絲氨酸，或類似地將一種氨基酸置換為一種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸(即保守突變)，對(duì)所獲分子的生物學(xué)活性將不會(huì)有較大影響。保守性置換指在某一氨基酸家族范圍內(nèi)發(fā)生的置換，該氨基酸家族成員在側(cè)鏈上相關(guān)。遺傳編碼氨基酸可被劃分為四個(gè)家族(1)酸性＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性＝丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)無(wú)電荷極性＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)被共同劃分為芳香族氨基酸。以類似方式可將氨基酸所有成員分為(1)酸性類＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性類＝賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)脂肪族類＝甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸，絲氨酸和蘇氨酸可被任選地單獨(dú)劃分為脂肪族羥基類；(4)芳香族類＝苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)酰胺類＝天冬酰胺、谷氨酰胺；和(6)含硫類＝半胱氨酸和蛋氨酸(參見例如，由L.Stryer，W.H.Freeman and Co.，1981年編輯的Biochemistry，2nded.)。多肽的氨基酸序列中的變化是否導(dǎo)致了功能同系物的產(chǎn)生，可通過評(píng)估該變體多肽以特定方式在細(xì)胞中產(chǎn)生應(yīng)答的能力而得以輕松確定，該方式與野生型蛋白質(zhì)的應(yīng)答方式類似。例如，可評(píng)估該RAGE-LBE變體形式的，例如與RAGE配體結(jié)合的能力。以相同方式可輕松檢驗(yàn)發(fā)生了一個(gè)以上置換的多肽。
如上所述，有些缺失、插入和置換不會(huì)從根本上改變RAGE-LBE分子的特性。不過，當(dāng)難以在實(shí)施置換、缺失或插入之前預(yù)測(cè)其確切作用時(shí)，例如當(dāng)修飾免疫表位時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解該作用可通過常規(guī)篩選實(shí)驗(yàn)評(píng)估。例如，典型地通過下述方法制備變體，即對(duì)RAGE-LBE編碼核酸進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變，在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)該變體核酸，并任選地，從該細(xì)胞培養(yǎng)物中純化該變體核酸，例如，通過在多克隆抗RAGE-LBE柱上進(jìn)行免疫親和吸附(以通過至少一個(gè)殘留的免疫表位吸附該變體)。隨后，在合適的篩選實(shí)驗(yàn)中篩選出具有理想特征的細(xì)胞溶解產(chǎn)物或已純化RAGE-LBE變體的活性。
RAGE-LBE的置換變體也包括通過常規(guī)方法將其它蛋白質(zhì)的功能同源區(qū)置換為一個(gè)或多個(gè)如上已確定RAGE-LBE區(qū)所獲得的變體。當(dāng)該變體為RAGE-LBE特定區(qū)域的一個(gè)片段時(shí)，優(yōu)選但并非必須地與相應(yīng)的RAGE-LBE區(qū)具有至少大約70％的同源性。類似的置換也可理想地適用于信號(hào)序列、Ig1、Ig2或Ig3區(qū)。
如上所述，本發(fā)明提供了含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件的融合蛋白。免疫球蛋白元件可以是免疫球蛋白的任意部分。在某些實(shí)施方案中，該免疫球蛋白元件包括IgG重鏈的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域。例如，免疫球蛋白元件可包括來源自IgG、IgD、IgA或IgM的重鏈或其部分。免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)包括任意種類免疫球蛋白重鏈的CH1、CH2、CH3和CH4，這些免疫球蛋白重鏈種類包括γ、α、ε、μ和δ類。尤其優(yōu)選的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)是人CH1。免疫球蛋白可變區(qū)包括VH、Vκ或Vγ。
一種實(shí)施方案中，RAGE-LBE在C末端與免疫球蛋白恒定區(qū)的N末端融合，以取代其可變區(qū)，但該結(jié)合配偶體的N末端融合也可被構(gòu)建。該融合典型地至少保留了免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中具有功能活性的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。恒定區(qū)Fc部分的C末端也可被融合，或是N末端直接與重鏈的CH1或輕鏈的相應(yīng)區(qū)域融合。通過構(gòu)建合適的DNA序列，并于重組細(xì)胞培養(yǎng)物中將其表達(dá)，通常便可實(shí)現(xiàn)該融合。但可選地，可根據(jù)已知方法合成本發(fā)明多肽。
在某些實(shí)施方案中，雜種免疫球蛋白被裝配為單體、或異源或同多聚體，尤其是二聚體或四聚體。通常，這些裝配免疫球蛋白應(yīng)具有如下圖所示的已知單位結(jié)構(gòu)。基礎(chǔ)四鏈結(jié)構(gòu)單位是IgG、IgD和IgE存在的形式。四鏈單位在較高分子量的免疫球蛋白中被重復(fù)；IgM通常以五聚體形式存在，該五聚體是由基礎(chǔ)四鏈單位通過二硫鍵結(jié)合在一起形成的。IgA球蛋白，有時(shí)和IgG球蛋白，也可以多聚體形式存在于血清中。在多聚體的情況中，各四鏈單位可相同或不同。
在某些實(shí)施方案中，RAGE-LBE與二聚化區(qū)融合。二聚化區(qū)基本上可以是任何與另一個(gè)多肽形成二聚體(或更高級(jí)復(fù)合體，諸如三聚體、四聚體等)的多肽。任選地，二聚化多肽與其它相同二聚化多肽相連，可形成同多聚體。IgG Fc元件是一個(gè)傾向于形成同多聚體的二聚化區(qū)實(shí)例。任選地，二聚化多肽與其它不同二聚化多肽相連，則形成異多聚體。Jun亮氨酸拉鏈區(qū)可與Fos亮氨酸拉鏈區(qū)形成二聚體，這是一個(gè)傾向于形成異多聚體的二聚化區(qū)實(shí)例。二聚化區(qū)既可形成異多聚體，也可形成同多聚體。
融合蛋白的不同元件可以與預(yù)期功能性一致的任意方式排列。例如，RAGE-LBE可被置于免疫球蛋白元件的C末端，或可選地，免疫球蛋白元件被置于RAGE-LBE的C末端。在融合蛋白中，RAGE-LBE和免疫球蛋白元件或二聚化多肽無(wú)需相鄰，且在任一區(qū)域的C或N末端，或兩個(gè)區(qū)域之間均可包括其它區(qū)域或氨基酸序列。
應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明RAGE-LBE蛋白或RAGE-LBE融合蛋白可通過天然加工方法，諸如加工和其它翻譯后修飾，或通過本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)而獲得修飾?？沙霈F(xiàn)在本發(fā)明蛋白中的已知修飾包括，但不僅限于，乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、核黃素的共價(jià)附著、血紅素部分的共價(jià)附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附著、磷脂酰肌醇的共價(jià)附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價(jià)交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；ⅵ敏然?、糖基化、GPI錨定形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆寇?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、由轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸加成，諸如精氨?；约氨樵诘鞍谆?。這些修飾是技術(shù)人員所熟知的，并已被詳盡描述于學(xué)術(shù)文獻(xiàn)中。包括糖基化、脂質(zhì)附著、硫酸化、羥基化和ADP-核糖基化的幾個(gè)尤其常見的修飾在大部分基礎(chǔ)課本中均有描述，諸如T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993的Proteins-Structure And Molecular Properties，2ndEd.。也可參考與該主題相關(guān)的詳細(xì)評(píng)論。見，例如Wold，F(xiàn).，在AcademicPress，New York，1983年出版，B.C.Johnson編輯的Posttranslational Covalent Modification Of Proteins(蛋白質(zhì)的翻譯后共價(jià)修飾)一書中第1-12頁(yè)的Posttranslational ProteinModificationsPerspectives and Prospects(翻譯后蛋白質(zhì)修飾前景與展望)；Seifter等人在Meth.Enzymol.，1990，182626-646中的“Analysis for protein modifications and nonproteincofactors，(對(duì)蛋白質(zhì)修飾和非蛋白質(zhì)輔因子的分析)”和Rattan等人在Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，66348-62中的“ProteinSynthesisPosttranslational Modifications and Aging，(蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和老化)”。
3.核酸在某些方面，本發(fā)明提供了編碼此處所公開融合蛋白的核酸，諸如RAGE-LBE-免疫球蛋白元件融合蛋白和RAGE-LBE-二聚化區(qū)融合蛋白，包括上述所有典型融合蛋白。一種實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸包括圖8所示編碼人RAGE的核酸或該核酸的一個(gè)部分。
編碼融合蛋白的核酸也可包括編碼RAGE-LBE變體、免疫球蛋白元件或二聚化區(qū)的核酸(例如圖1A或3B所示的核酸序列)。變體核苷酸序列包括相差一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、插入或缺失的序列，諸如等位變體；并因此包括與RAGE、免疫球蛋白或二聚化區(qū)的核苷酸序列不同的編碼序列。任選地，變體應(yīng)與基準(zhǔn)序列存在至少80％、90％、95％或99％的同一性(例如圖3B所示序列)。變體也應(yīng)包含在嚴(yán)格條件(即相當(dāng)于比大約1M鹽中形成的DNA雙螺旋的解鏈溫度(Tm)低20-27℃)下可與相關(guān)基準(zhǔn)核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在一種例證性的實(shí)施方案中，變體核酸編碼的RAGE-LBE融合蛋白含有與圖3A所示氨基酸序列存在至少901％同一性的氨基酸序列。
本領(lǐng)域任一普通技術(shù)人員均易于理解的是，可促進(jìn)DNA雜交的合適嚴(yán)格條件是可以改變的。例如，可在大約45℃，6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中進(jìn)行雜交，并隨后于50℃，在2.0xSSC中進(jìn)行洗滌。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可從低嚴(yán)格條件，即50℃、大約2.0xSSC，到高嚴(yán)格條件，即50℃、大約0.2xSSC中選擇。此外，該洗滌步驟中的溫度可從室溫，大約22℃的低嚴(yán)格條件提高至大約65℃的高嚴(yán)格條件。溫度和鹽濃度可被同時(shí)改變，或者在改變二者中一個(gè)變量的同時(shí)，保持另一變量不變。一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可在低嚴(yán)格條件下雜交的核酸，該低嚴(yán)格條件即為于室溫、6xSSC中進(jìn)行雜交，并隨后于室溫、2xSSC中進(jìn)行洗滌。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明核酸被提供在含有特定核苷酸序列的表達(dá)載體中，并與至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列可操作性地連接，其中上述特定核苷酸序列編碼本發(fā)明融合多肽?？刹僮餍缘剡B接意指核苷酸序列以特定方式被連接至調(diào)節(jié)序列，該方式可實(shí)現(xiàn)上述核苷酸序列的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域所公認(rèn)的，并被選擇用于引導(dǎo)本發(fā)明融合多肽的表達(dá)。相應(yīng)地，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其它表達(dá)控制元件。在Academic Press，San Diego，CA(1990)出版的Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology(基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法)中描述了典型的調(diào)節(jié)序列。例如，廣泛多種特定表達(dá)控制序列中的任意一種均可應(yīng)用于上述載體，以表達(dá)編碼融合蛋白的DNA序列，其中上述特定表達(dá)控制序列與DNA序列可操作性地連接時(shí)，便可控制該DNA序列的表達(dá)。這些有用的表達(dá)控制序列包括，例如，SV40的早期和晚期啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、腺病毒或巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、由T7RNA聚合酶引導(dǎo)表達(dá)的T7啟動(dòng)子、噬菌體λ的主要操縱基因和啟動(dòng)子區(qū)域、針對(duì)fd外殼蛋白的控制區(qū)、針對(duì)3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子，例如Pho5、酵母a-交配因子的啟動(dòng)子、桿狀病毒系統(tǒng)及其它特定序列的多面體啟動(dòng)子，該特定序列是已知可調(diào)控原核或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的序列，及上述表達(dá)控制序列的多種組合。應(yīng)當(dāng)理解的是，可根據(jù)特定因素設(shè)計(jì)表達(dá)載體，這些特定因素即對(duì)待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和/或希望被表達(dá)的蛋白質(zhì)類型的選擇。此外，也應(yīng)考慮該載體的拷貝數(shù)量、控制拷貝數(shù)量的能力，以及控制該載體所編碼其它任意蛋白質(zhì)，諸如抗生素標(biāo)記的表達(dá)的能力。
顯而易見，可采用本發(fā)明基因構(gòu)建體，以使本發(fā)明融合多肽在培養(yǎng)中增殖的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，例如，生成可用于純化的蛋白質(zhì)或多肽，包括融合蛋白或多肽。
本發(fā)明也涉及經(jīng)由特定重組基因轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，該重組基因包括與一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明融合蛋白對(duì)應(yīng)的編碼序列。該宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞，但本發(fā)明并不涵蓋屬于人體部分的細(xì)胞。例如，本發(fā)明多肽可在細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌，昆蟲細(xì)胞(例如，采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得以表達(dá)。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)。其它合適的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
相應(yīng)地，本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備本發(fā)明融合多肽的方法。例如，可在合適條件下培養(yǎng)經(jīng)由特定表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體編碼融合多肽，上述合適條件是可使該融合多肽實(shí)現(xiàn)表達(dá)的條件。該多肽可被分泌，并可從含有該多肽的細(xì)胞與培養(yǎng)基的混合物中分離獲得?？蛇x地，該多肽可被保留在胞質(zhì)中，這時(shí)便需收獲細(xì)胞，將其溶解，并分離目標(biāo)蛋白。細(xì)胞培養(yǎng)物包括宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基及其它副產(chǎn)品。用于細(xì)胞培養(yǎng)的合適培養(yǎng)基是本領(lǐng)域熟知的。采用本領(lǐng)域已知用于純化蛋白質(zhì)的技術(shù)，包括離子交換色譜、凝膠過濾色譜、超濾、電泳，以及利用對(duì)本發(fā)明多肽的特定表位具有特異性的抗體所進(jìn)行的免疫親和純化，均可從細(xì)胞培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞或二者混合物中分離獲得本發(fā)明多肽。在某些實(shí)施方案中，該融合蛋白含有有助于其純化的區(qū)域，諸如GST部分或六組氨酸部分。優(yōu)選的純化部分可以容易地與該融合蛋白的其余部分裂解。
本發(fā)明融合蛋白可通過下述方法制備，即將相關(guān)克隆基因或其部分連接進(jìn)特定載體中，該載體適合在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)，或者在二者中均可表達(dá)。用于制備重組融合蛋白的表達(dá)載體包括質(zhì)粒及其它載體。例如，適用于表達(dá)融合蛋白的合適載體包括下述類型的質(zhì)粒pBR322-衍生質(zhì)粒、pEMBL-衍生質(zhì)粒、pEX-衍生質(zhì)粒、pBTac-衍生質(zhì)粒以及用于在原核細(xì)胞，諸如大腸桿菌中表達(dá)的pUC衍生質(zhì)粒。
有大量載體可被用于在酵母中表達(dá)重組蛋白。例如，YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2和YRP17均是有助于將遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入釀酒酵母的克隆和表達(dá)載體(見例如，Broach等人(1983)在M.InouyeAcademic Press出版的Experimental Manipulation of GeneExxpression(基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)操作)第83頁(yè)，將其引入此處作為參考)。這些載體之所以能在大腸桿菌中復(fù)制，要?dú)w因于pBR322 ori的存在，之所以能在釀酒酵母中復(fù)制，則歸因于酵母2微米質(zhì)粒中復(fù)制決定子的存在。此外，也可采用抗藥性標(biāo)記，諸如氨芐青霉素。
優(yōu)選的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體既含有有助于該載體在細(xì)菌內(nèi)增殖的原核序列，也含有一個(gè)或多個(gè)可于真核細(xì)胞中表達(dá)的真核轉(zhuǎn)錄單元。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生載體均為適用于轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體實(shí)例。在這些載體中，若干載體被修飾后具有來源自細(xì)菌質(zhì)粒，諸如pBR322的序列，有助于原核和真核細(xì)胞中的復(fù)制和抗藥性篩選?？蛇x地，在真核細(xì)胞中，可采用病毒衍生物，諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)或埃-巴二氏病毒(pHEBo、pREP來源和p205)，以瞬時(shí)表達(dá)蛋白質(zhì)。其它病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例可參見下文對(duì)基因治療送遞系統(tǒng)的描述。制備質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化宿主生物體所應(yīng)用的多種方法均是本領(lǐng)域熟知的。即可用于原核細(xì)胞，又可用于真核細(xì)胞的其它合適表達(dá)系統(tǒng)，以及通用重組操作方法，可參見由Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)編輯的Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd Ed.，(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版)，第16和17章。在某些情況中，通過利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)以表達(dá)融合蛋白的方法是理想的。這種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括pVL-衍生載體(諸如pVL1392，pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生載體(諸如pAcUW1)，和pBlueBac衍生載體(諸如含β-ga1的pBlueBac III)。
在另一種實(shí)施方案中，編碼純化前導(dǎo)序列，諸如位于重組蛋白指定部分N末端的poly-(His)/腸激酶裂解位點(diǎn)序列，的融合基因有助于通過采用Ni2+金屬樹脂的親和色譜法對(duì)已表達(dá)融合蛋白的純化。隨后，可通過利用腸激酶進(jìn)行處理，將該純化前導(dǎo)序列除去，從而獲得已純化的融合蛋白(例如，參見Hochuli et al.，(1987)J.Chromatography 411177；和Janknecht et al.，(1991)PNAS USA888972)。
制備融合基因的技術(shù)是人們熟知的。編碼不同多肽序列的多個(gè)DNA片段的連接基本上是根據(jù)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行的，即采用用于連接的鈍頭或交錯(cuò)頭末端、限制酶消化以提供合適末端、恰當(dāng)補(bǔ)平粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免不需要的連接，以及酶連接。在另一種實(shí)施方案中，可通過包括自動(dòng)化DNA合成儀在內(nèi)的常規(guī)技術(shù)合成本發(fā)明融合基因。可選地，可采用特定錨定引物對(duì)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該錨定引物可在兩個(gè)連續(xù)基因片段之間形成互補(bǔ)突出端，其中上述兩個(gè)連續(xù)基因片段可隨后被退火，從而形成嵌合基因序列(見，例如Ausubel et al.，John Wiley & Sons1992編輯的Current Protocolsin MolecularBiology。
通過本領(lǐng)域已知的多種方法，包括電穿孔、脂染和磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，均可將克隆的DNA序列導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。
4.抗體及其用途本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及分離的抗體，該抗體可與圖3A所示RAGE氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，可與該抗體進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的表位選自圖7所示RAGE氨基酸序列中的氨基酸殘基1-330、1-321、1-230和1-118。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體、Fab片段和單鏈抗體。例如，可通過標(biāo)準(zhǔn)操作方法制備抗-蛋白質(zhì)/抗-肽抗血清或單克隆抗體(見，例如由Harlow和Lane(Cold SpringHarbor Press1988)編輯的AntibodiesA Laboratory Manual(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)))。任選地，該抗體被標(biāo)記有可檢測(cè)標(biāo)記。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體抑制RAGE與一個(gè)或多個(gè)RAGE-BP的結(jié)合。例如，可與圖7所示RAGE氨基酸序列中氨基酸殘基1-330的表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的抗體可破壞RAGE與其至少一個(gè)配體，諸如高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs)、成淀粉樣肽/多肽、兩性蛋白及S100/鈣粒蛋白的結(jié)合。
本發(fā)明也設(shè)想了多克隆抗體的純化制劑，該多克隆抗體可與圖3A所示RAGE氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)。
采用免疫原性形式的本發(fā)明肽(例如，圖7所示RAGE氨基酸序列的氨基酸殘基1-330，或可激發(fā)抗體應(yīng)答的抗原片段，或上述融合蛋白)可使哺乳動(dòng)物，諸如小鼠、倉(cāng)鼠或兔免疫。可使蛋白質(zhì)或肽具有免疫原性的技術(shù)包括，使該蛋白質(zhì)或肽與載體結(jié)合，或本領(lǐng)域熟知的其它技術(shù)。多肽的免疫原性部分可在佐劑的存在條件下被施用。通過檢測(cè)血漿或血清中的抗體滴度，可監(jiān)測(cè)免疫作用的進(jìn)展。標(biāo)準(zhǔn)ELISA或其它免疫測(cè)定可采用免疫原作為抗原，以評(píng)估抗體水平。
在采用本發(fā)明多肽的抗原制劑使動(dòng)物免疫之后，可獲得抗血清，并且如果需要，可從該血清中分離獲得多克隆抗體。為制備單克隆抗體，可從已免疫動(dòng)物收獲抗體生成細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，并采用標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞融合操作，使其與無(wú)限增殖化細(xì)胞，諸如骨髓瘤細(xì)胞融合，以獲得雜交瘤細(xì)胞。這些技術(shù)均是本領(lǐng)域熟知的，包括例如，雜交瘤技術(shù)(最初由Kohler和Milstein研發(fā)(1975)Nature，256495-497)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbar et al.，(1983)Immunology Today，472)以及可制備人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)。對(duì)雜交瘤細(xì)胞可進(jìn)行免疫化學(xué)篩選，以生成可與RAGE多肽的一個(gè)表位特異性反應(yīng)的抗體，并從含有上述雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離獲得單克隆抗體。
術(shù)語(yǔ)“抗體”在此文中意指包括其片段，該片段也可與RAGE多肽的一個(gè)表位特異性反應(yīng)。利用常規(guī)技術(shù)可將抗體片段化，并可篩選出可以特定方式應(yīng)用的片段，該方式與上文針對(duì)完整抗體所描述的方式相同。例如，通過采用胃蛋白酶對(duì)抗體進(jìn)行處理，可生成F(ab)2片段。對(duì)所獲F(ab)2片段進(jìn)行處理，以還原二硫鍵，便可獲得Fab片段。
本發(fā)明抗體進(jìn)一步意指包括對(duì)本發(fā)明任意一種多肽具有親和力的雙特異性、單鏈、嵌合和人源化分子，其中親和力由本發(fā)明抗體的至少一個(gè)CDR區(qū)賦予。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體進(jìn)一步包括與其附著并可被檢測(cè)的標(biāo)記(例如，該標(biāo)記可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體可作為聯(lián)合治療的一部分，與其它藥劑結(jié)合施用。例如，在炎癥情況中，本發(fā)明抗體可與一種或多種用于治療炎性疾病或病癥的其它藥劑結(jié)合施用。在心血管疾病情況中，尤其是由動(dòng)脈粥樣硬化斑引發(fā)，并被認(rèn)為存在實(shí)際炎性成分的心血管疾病情況中，本發(fā)明抗體可與一種或多種用于治療心血管疾病的其它藥劑結(jié)合施用。在癌癥的情況中，本發(fā)明抗體可與一種或多種抗血管生成因子、化學(xué)治療結(jié)合施用，或者作為放射治療的佐劑施用。本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)想的是，本發(fā)明抗體的施用應(yīng)作為癌癥治療方案的一部分，該癌癥治療方案可結(jié)合多種不同的癌癥治療劑。在I BD的情況中，本發(fā)明抗體可與一種或多種抗炎劑結(jié)合施用，并可另外結(jié)合改良的飲食方案。
本發(fā)明抗體的施用可被用于治療RAGE-相關(guān)病癥，或者可與其它藥劑和治療方案結(jié)合應(yīng)用，以治療RAGE-相關(guān)病癥。
5.抑制RAGE-LBE與RAGE-BP之間相互作用的方法本發(fā)明的某些方面涉及抑制RAGE-LBE與RAGE-BP之間相互作用的方法。優(yōu)選地，該方法被用于治療RAGE-相關(guān)病癥。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括施用此處公開的RAGE-LBE融合蛋白。在另一種實(shí)施方案中，該方法包括施用上述可與圖3A所示RAGE氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的抗體。還有一種實(shí)施方案，該方法包括施用可抑制RAGE與一個(gè)或多個(gè)RAGE-BP結(jié)合的化合物。下文分項(xiàng)6中論述了鑒定該化合物的典型方法。
在某些實(shí)施方案中，是在體外抑制該相互作用，諸如在含有已純化蛋白、細(xì)胞、生物樣品、組織、人工組織等的反應(yīng)混合物中。在某些實(shí)施方案中，是在體內(nèi)抑制該相互作用，例如，通過施用RAGE-LBE融合蛋白，或者在體內(nèi)引發(fā)生成RAGE-LBE融合蛋白。
在某些方面，本發(fā)明涉及通過抑制RAGE-LBE與RAGE-BP之間相互作用，以治療RAGE相關(guān)病癥的方法。該方法包括施用上述RAGE-LBE融合蛋白、抗RAGE抗體，或者施用已被鑒定可抑制RAGE與一個(gè)或多個(gè)RAGE-BP結(jié)合的化合物。
6.抑制RAGE或RAGE-BP表達(dá)的方法本發(fā)明的某些方面設(shè)想了抑制RAGE或RAGE-BP(例如S 100或兩性蛋白)表達(dá)或二者表達(dá)均被抑制的方法。優(yōu)選地，該方法可被用于治療RAGE相關(guān)病癥。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及利用反義核酸以減少RAGE或RAGE-BP的表達(dá)。該反義核酸可以例如，作為表達(dá)質(zhì)粒被送遞，當(dāng)其在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄時(shí)，可生成與特定細(xì)胞mRNA的至少一個(gè)獨(dú)特部分互補(bǔ)的RNA，其中特定細(xì)胞mRNA編碼RAGE或RAGE-BP多肽?？蛇x地，該構(gòu)建體是體外生成的寡核苷酸，且當(dāng)其被導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，可通過與mRNA和/或編碼生物標(biāo)記多肽的基因組序列雜交，從而抑制表達(dá)。這種寡核苷酸探針是經(jīng)過任意修飾的寡核苷酸，該寡核苷酸對(duì)內(nèi)源核酸酶，例如外切核酸酶和/或內(nèi)切核酸酶具有抗性，因此在體內(nèi)是穩(wěn)定的?？勺鳛榉戳x寡核苷酸應(yīng)用的典型核酸分子是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯類似物(也可參見美國(guó)專利Nos.5,176,996；5,264,564和5,256,775)。另外，構(gòu)建可用于核酸治療的寡聚體的通用方法已由例如，van der Krol等人在Biotechniques 6958-976(1988)；和Stein等人在Cancer Res 482659-2668(1988)中進(jìn)行了論述。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及利用RNA干擾(RNAi)以影響RAGE或RAGE-BP基因的拆卸。RNAi構(gòu)建體包括可特異性阻斷目標(biāo)基因表達(dá)的雙鏈RNA。“RNA干擾”或“RNAi”是一個(gè)術(shù)語(yǔ)，最初被用于指在植物和蠕蟲中觀測(cè)到的一種現(xiàn)象，在該現(xiàn)象中，雙鏈RNA(dsRNA)以一種特異性和轉(zhuǎn)錄后方式阻斷了基因表達(dá)。RNAi提供了一種抑制體外或體內(nèi)基因表達(dá)的有效方法。RNAi構(gòu)建體可包含dsRNA的長(zhǎng)序列或短序列，其中長(zhǎng)序列與目標(biāo)核酸序列一致或基本一致，短序列則僅與目標(biāo)核酸序列的一個(gè)區(qū)域一致或基本一致。
任選地，該RNAi構(gòu)建體含有特定核苷酸序列，該核苷酸序列可在細(xì)胞的生理?xiàng)l件下，與待抑制基因(例如“目標(biāo)”基因)mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的至少一個(gè)部分的核苷酸序列雜交。該雙鏈RNA僅需與具有介導(dǎo)RNAi能力的天然RNA充分相似。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，能夠耐受可能是由于遺傳突變、菌株多態(tài)性或進(jìn)化趨異而產(chǎn)生的序列變異。目標(biāo)序列與該RNAi構(gòu)建體序列之間的容許核苷酸錯(cuò)配數(shù)目為5個(gè)堿基對(duì)中不超過1對(duì)，或10個(gè)堿基對(duì)中不超過1對(duì)，或20個(gè)堿基對(duì)中不超過1對(duì)，或50個(gè)堿基對(duì)中不超過1對(duì)。在siRNA雙螺旋中心的錯(cuò)配最為關(guān)鍵，并且基本上可以破壞目標(biāo)RNA的裂解。與之相比，位于特定siRNA鏈3’末端的核苷酸對(duì)目標(biāo)識(shí)別特異性無(wú)顯著影響，其中該特定siRNA鏈與目標(biāo)RNA互補(bǔ)。序列同一性可通過本領(lǐng)域已知的序列比較和排列算法最優(yōu)化(參見Gribskov和Devereux，Sequence AnalysisPrimer，Stockton Press，1991，將其引入此處作為參考)，并且可通過例如，在BESTFIT軟件程序中執(zhí)行的Smith-Waterman算法，并利用默認(rèn)參數(shù)，計(jì)算核苷酸序列之間的差異百分比(例如Universityof Wisconsin Genetic Computing Group)。在抑制性RNA與目標(biāo)基因的特定部分之間，大于90％的序列同一性，或者甚至100％的序列同一性是優(yōu)選的?？蛇x地，該RNA的雙螺旋區(qū)可在功能上被定義為能夠與目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的一部分雜交(例如，400mM NaCl、40mM PIPESpH6.4、1mM EDTA、50℃或70℃雜交12-16小時(shí)；隨后進(jìn)行洗滌)的核苷酸序列。
該雙鏈結(jié)構(gòu)可由單條自體互補(bǔ)RNA鏈或兩條互補(bǔ)RNA鏈形成。RNA雙螺旋的形成可在細(xì)胞內(nèi)或外部啟動(dòng)。該RNA可以特定數(shù)量被導(dǎo)入，該數(shù)量可實(shí)現(xiàn)每個(gè)細(xì)胞至少一個(gè)拷貝的送遞。雙鏈物質(zhì)的較高劑量(例如每個(gè)細(xì)胞至少5、10、100、500或1000個(gè)拷貝)可獲得更為有效的抑制，而較低劑量也可被用于特定用途。抑制作用是序列特異性的，其中與RNA雙螺旋區(qū)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列是遺傳抑制的目標(biāo)。
本發(fā)明RNAi構(gòu)建體可以是“小干擾RNAs”或“siRNAs”。這些核酸的長(zhǎng)度大約為19-30個(gè)核苷酸，還要更為優(yōu)選的長(zhǎng)度大約為21-23個(gè)核苷酸。siRNAs被認(rèn)為可結(jié)合核酸酶復(fù)合體，并通過與特定序列配對(duì)，將該復(fù)合體引導(dǎo)至目標(biāo)mRNA。結(jié)果是目標(biāo)mRNA被該蛋白質(zhì)復(fù)合體中的核酸酶降解。在一種特定實(shí)施方案中，含21-23個(gè)核苷酸的siRNA分子具有3’羥基。在某些實(shí)施方案中，通過在例如，dicer酶的存在條件下，加工較長(zhǎng)的雙鏈RNA，便可生成該s iRNA構(gòu)建體。該組合可在特定條件下被維持，在該條件下，dsRNA被加工為含有大約21～大約23個(gè)核苷酸的RNA分子。該siRNA分子可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)純化。例如，可采用凝膠電泳純化siRNAs?？蛇x地，可采用非變性方法，諸如非變性柱層析，以純化siRNA。另外，可采用色譜(例如尺寸排阻色譜)、甘油梯度離心、利用抗體進(jìn)行的親和純化，以純化siRNA。
RNAi構(gòu)建體的制備可通過化學(xué)合成法，或通過重組核酸技術(shù)實(shí)現(xiàn)。經(jīng)處理細(xì)胞的內(nèi)源RNA聚合酶可介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，或者可采用克隆的RNA聚合酶用于體外轉(zhuǎn)錄。該RNAi構(gòu)建體可以包括對(duì)磷酸-糖主鏈或核苷的修飾，例如，以降低對(duì)細(xì)胞核酸酶的易感性、提高生物利用率、改善配方特性和/或改變其它藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。例如，天然RNA的磷酸二酯鍵可以被修飾，從而包括至少一個(gè)氮或硫雜原子。RNA結(jié)構(gòu)中的修飾可以被特制，從而允許特異性的遺傳抑制，并同時(shí)避免了對(duì)dsRNA的一般性應(yīng)答。同樣，堿基也可以被修飾，從而阻斷腺苷脫氨酶的活性。該RNAi構(gòu)建體可通過酶促法或部分/全有機(jī)合成法制備，并且，通過體外酶促或有機(jī)合成法，可導(dǎo)入任何已修飾核糖核苷酸。化學(xué)修飾RNA分子的方法可被調(diào)整用于修飾RNAi構(gòu)建體(見，例如Heidenreich et al.(1997)Nucleic Acids Res.25776-780；Wilson et al.(1994)J Mol Recog789-98；Chen et al.(1995)Nucleic Acids Res232661-2668；Hirschbein et al.(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev755-61)。僅為例證起見，可采用硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合磷酸甲酯-磷酸二酯、肽核酸、含有寡聚體或糖修飾的5-丙炔基-嘧啶(例如，2’被置換的核糖核苷，a-構(gòu)型)修飾RNAi構(gòu)建體的主鏈。
該RNAi構(gòu)建體也可為長(zhǎng)雙鏈RNA形式。在某些實(shí)施方案中，該RNAi構(gòu)建體具有至少25、50、100、200、300或400個(gè)堿基。在某些實(shí)施方案中，該RNAi構(gòu)建體的長(zhǎng)度為400-800個(gè)堿基。該雙鏈RNAs被細(xì)胞內(nèi)消化后，例如，可在細(xì)胞內(nèi)生成siRNA序列。但體內(nèi)利用長(zhǎng)雙鏈RNAs并不總是可行，可能是有害效應(yīng)所致，該有害效應(yīng)可能是不依賴序列的dsRNA應(yīng)答所引起的。在這些實(shí)施方案中，利用可減弱干擾素或PKR作用的局部送遞系統(tǒng)和/或藥劑是優(yōu)選的。
可選地，該RNAi構(gòu)建體為發(fā)夾結(jié)構(gòu)形式(被稱為發(fā)夾RNA)。該發(fā)夾RNAs可以被外源合成，或者可以通過在體內(nèi)由RNA聚合酶III啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄形成。制備并采用該發(fā)夾RNAs用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的基因沉默的實(shí)例被描述于，例如Paddison et al.，Genes Dev.2002，16948-58；McCaffrey et al.，Nature，2002，41838-9；McManuset al.，RNA，2002，8842-50；Yu et al.，Proc Natl Acad Sci US A，2002，996047-52)中。優(yōu)選地，在細(xì)胞或動(dòng)物中工程改造該發(fā)夾RNAs，以確保對(duì)所需基因的連續(xù)和穩(wěn)定抑制。本領(lǐng)域已知的是，可于細(xì)胞內(nèi)加工發(fā)夾RNA，從而獲得siRNAs。
PCT申請(qǐng)WO01/77350描述了一種典型載體，該載體可被用于雙向轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)基因，從而在真核細(xì)胞內(nèi)獲得同一轉(zhuǎn)基因的有義和反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。相應(yīng)地，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種具有下述獨(dú)特特征的重組載體，這些特征是它含有一種病毒復(fù)制子，該復(fù)制子具有兩個(gè)以相反方向排列，并位于與目標(biāo)RNAi構(gòu)建體對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因兩側(cè)的重疊轉(zhuǎn)錄單位，其中這兩個(gè)重疊轉(zhuǎn)錄單位可在宿主細(xì)胞內(nèi)，由同一轉(zhuǎn)基因獲得有義和反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
在另一種實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及利用智能配體以影響(例如，抑制)RAGE多肽或RAGE-BP的活性。智能配體是被選擇用于特異性結(jié)合指定分子結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。智能配體典型地是RNA，但也可以是DNA或其類似物或衍生物，諸如，不僅限于，肽核酸(PNAs)和硫代磷酸酯核酸。此處所用術(shù)語(yǔ)“智能配體”，例如RNA智能配體或DNA智能配體，包括可與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的單鏈寡核苷酸。智能配體可與目標(biāo)分子緊密且特異性結(jié)合；大部分智能配體與蛋白質(zhì)結(jié)合的Kd(平衡解離常數(shù))值范圍是1pM～1nM。
智能配體典型地是親和選擇過程的產(chǎn)物，該親和選擇過程與噬菌體展示的親和選擇相似(也被稱為體外分子進(jìn)化)。該過程包括進(jìn)行若干串聯(lián)重復(fù)的親和分離，例如，采用可與所需免疫原結(jié)合的固體支持體，隨后通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以擴(kuò)增與該免疫原結(jié)合的核酸。因此，每一循環(huán)的親和分離均可將富集與所需免疫原成功結(jié)合的分子的核酸群體。以該方式，可“訓(xùn)練”隨機(jī)核酸庫(kù)，以獲得可與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的智能配體。智能配體序列可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法生成，包括，例如下述參考文獻(xiàn)中所描述的SELEX法美國(guó)專利Nos.5,475,096；5,595,877；5,670,637；5,696,249；5,773,598；5,817,785。智能配體及其制備方法在例如，E.N.Brody et al.(1999)Mol.Diagn.4381-388中也有所描述，其內(nèi)容被引入此處作為參考。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及利用核酶分子，該核酶分子經(jīng)設(shè)計(jì)后可催化裂解mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而阻止mRNA的翻譯(見，例如1990年10月4日出版的PCT國(guó)際申請(qǐng)WO90/11364；Sarver et al.，1990，Science 2471222-1225；和美國(guó)專利No.5,093,246)。雖然可采用在位點(diǎn)特異性識(shí)別序列上裂解mRNA的核酶，以破壞特定mRNAs，優(yōu)選的仍然是采用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶裂解mRNAs的位置受側(cè)翼區(qū)支配，其中該側(cè)翼區(qū)可與目標(biāo)mRNA形成互補(bǔ)堿基對(duì)。唯一要求是該目標(biāo)mRNA具有含兩個(gè)堿基的下述序列5’-UG-3’。錘頭狀核酶的構(gòu)建和制備方法是本領(lǐng)域熟知的，Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334585-591更為詳盡地描述了這些方法。本發(fā)明核酶也包括RNA核糖核酸內(nèi)切酶(下文參見“Cech型核酶”)，諸如天然存在于嗜熱四膜蟲中，并已被大量描述的RNA核糖核酸內(nèi)切酶(被稱為IVS或L-19IVS RNA)(見，例如Zaug，et al.，1984，Science，224574-578；Zaug和Cech，1986，Science，231470-475；Zaug，et al.，1986，Nature，324429-433；由University Patents Inc.出版的國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO88/04300；Been和Cech，1986，Cell，47207-216)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及利用DNA酶抑制RAGE或RAGE-BP基因的表達(dá)。DNA酶合并了反義與核酶技術(shù)二者的某些機(jī)制特征。DNA酶經(jīng)設(shè)計(jì)后，與反義寡核苷酸很相似，可識(shí)別特定的目標(biāo)核酸序列，但也與核酶類似，因?yàn)樗梢源呋⑻禺愋粤呀庠撃繕?biāo)核酸。簡(jiǎn)言之，為設(shè)計(jì)一種可特異性識(shí)別并裂解目標(biāo)核酸的理想DNA酶，本領(lǐng)域任一技術(shù)人員均應(yīng)首先鑒定獨(dú)特的目標(biāo)序列。優(yōu)選地，該獨(dú)特或基本獨(dú)特的序列是富含G/C、且含大約18～22個(gè)核苷酸的序列。高G/C含量幫助確保了DNA酶與目標(biāo)序列之間較強(qiáng)的相互作用。合成該DNA酶時(shí)，可將酶定位至識(shí)別信息的反義識(shí)別序列被分開，使其含有DNA酶的兩個(gè)臂，并將該DNA酶環(huán)置于兩個(gè)特定的臂之間。制備并施用DNA酶的方法可參見，例如美國(guó)專利No.6,110,462。
7.治療方法本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及治療RAGE相關(guān)病癥的方法。RAGE相關(guān)病癥通常可以被表征為包括，被感染細(xì)胞表現(xiàn)出RAGE或一個(gè)或多個(gè)RAGE配體表達(dá)升高的任何病癥。RAGE相關(guān)病癥也可被表征為，可通過削弱RAGE功能而得以治療(即可消除或改善一種或多種癥狀)的任何病癥。例如，通過施用可破壞RAGE與RAGE-BP之間相互作用的藥劑，可削弱RAGE功能?？蛇x地，通過施用可抑制上述RAGE或RAGE-BP基因表達(dá)的藥劑(例如反義核酸或RNAi構(gòu)建體)，也可削弱RAGE功能。
RAGE的表達(dá)提高與若干病變有關(guān)，諸如糖尿病血管病、腎病、視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病及其它病癥，包括阿爾茨海默氏病和血管壁的免疫/炎性反應(yīng)。在感染了多種炎癥的組織中均可生成RAGE配體，這些炎癥包括關(guān)節(jié)炎(諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)。在受糖尿病影響的組織中，RAGE的生成被認(rèn)為是高級(jí)糖基化終產(chǎn)物過度產(chǎn)生所導(dǎo)致的。結(jié)果導(dǎo)致了氧化應(yīng)力和內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，而這些結(jié)果在糖尿病情況中可引起血管疾病。
淀粉狀蛋白在組織中的沉積導(dǎo)致了對(duì)細(xì)胞的多種毒性作用，且其特征是一系列均可被稱為淀粉樣變性的疾病。RAGE結(jié)合β折疊片狀原纖維物質(zhì)，這種物質(zhì)可出現(xiàn)在諸如，淀粉狀蛋白-β肽、Abeta、支鏈淀粉、血清淀粉狀蛋白A和朊病毒衍生肽中。RAGE在具有淀粉狀蛋白結(jié)構(gòu)的組織中也可以上升水平被表達(dá)。因此，RAGE與淀粉樣變性癥有關(guān)。RAGE與淀粉狀蛋白的相互作用被認(rèn)為導(dǎo)致了氧化應(yīng)力，而該氧化應(yīng)力可引起神經(jīng)元變性。
在發(fā)炎組織中可生成多種RAGE配體，尤其是S100/鈣粒蛋白家族成員。該觀測(cè)結(jié)果的確存在于急性炎性疾病和慢性炎性疾病中，對(duì)急性炎性疾病而言，例如，可在對(duì)脂多糖激發(fā)的應(yīng)答中發(fā)現(xiàn)(如在膿毒癥情況中)，對(duì)慢性炎性疾病而言，例如，可在多種形式的關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸病等疾病中發(fā)現(xiàn)。心血管疾病，尤其是由動(dòng)脈粥樣硬化斑引發(fā)的心血管疾病也被認(rèn)為存在實(shí)際炎性成分。這些疾病包括閉塞、血栓形成和內(nèi)陷病，分別例如咽峽炎、脆性噬菌斑病癥和血栓性中風(fēng)。上述所有疾病均被認(rèn)為是RAGE相關(guān)病癥。
腫瘤細(xì)胞也顯示存在RAGE配體，尤其是兩性蛋白的上升表達(dá)，說明癌癥也是RAGE相關(guān)病癥。此外，慢性炎性疾病的氧化效應(yīng)及其它方面對(duì)某些腫瘤的發(fā)生可能起了促進(jìn)作用。
因此，可采用本發(fā)明組合物治療的RAGE相關(guān)病癥包括淀粉樣變性(諸如阿爾茨海默氏病)、關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、慢性炎性疾病(諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激疾病、多發(fā)性硬化、銀屑病、狼瘡及其它自身免疫病)、急性炎性疾病(諸如膿毒癥)，休克(例如敗血癥性休克、出血性休克)、心血管疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、脆性噬菌斑病癥、咽峽炎和再狹窄)、糖尿病(尤其是糖尿病情況中出現(xiàn)的心血管疾病)、糖尿病并發(fā)癥、朊病毒相關(guān)病癥、癌癥、脈管炎及其它脈管炎癥狀，諸如壞死性脈管炎、腎病、視網(wǎng)膜病和神經(jīng)病。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括施用RAGE-LBE融合蛋白。任選地，該融合蛋白可作為多肽施用，例如作為藥物組合物的一部分。在一種尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，該融合蛋白可通過施用特定核酸而得以施用，該核酸編碼該融合蛋白，并被設(shè)計(jì)為可在被試者細(xì)胞中表達(dá)該融合蛋白。
在某些方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明融合蛋白的施用方法。該融合蛋白可于體外或體內(nèi)施用，且其表達(dá)可通過施用本發(fā)明融合蛋白本身，或通過施用編碼該融合蛋白的核酸而得以實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白或核酸被作為藥物組合物施用。在若干其它實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白或核酸與一種或多種其它藥劑一起被施用。本發(fā)明還有另一個(gè)方面，即本發(fā)明融合蛋白的施用是治療特定病癥的治療方案的一部分。可通過單獨(dú)施用本發(fā)明蛋白/核酸，或者通過與其它藥劑一起結(jié)合施用本發(fā)明蛋白/核酸，而得以治療的病癥包括RAGE相關(guān)病癥。例如，RAGE相關(guān)病癥包括，但不僅限于，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、動(dòng)脈粥樣硬化、脈管炎及其它脈管炎癥狀，諸如壞死性脈管炎，阿爾茨海默氏病，癌癥，糖尿病并發(fā)癥，諸如糖尿病視網(wǎng)膜病，自身免疫病，諸如銀屑病和狼瘡。RAGE相關(guān)病癥進(jìn)一步包括急性炎性疾病(例如膿毒癥)、慢性炎性疾病及其它因炎癥而加劇的病癥(即其癥狀可通過減少炎癥而得以緩解)。
廣泛多種可被用于送遞編碼特定蛋白的核酸(例如編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸)的方法均是本領(lǐng)域熟知的?？审w外或體內(nèi)施用的表達(dá)構(gòu)建體可以被配制在任何生物學(xué)有效載體(例如，任何能夠有效送遞該表達(dá)構(gòu)建體的配方或組合物)中，而一起被施用。方法包括將本發(fā)明基因插入特定的病毒載體中，該病毒載體可通過直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞而發(fā)揮作用。典型的病毒載體包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、單純皰疹病毒-1和慢病毒。其它方法包括利用重組細(xì)菌或真核質(zhì)粒。通過利用例如，陽(yáng)離子脂質(zhì)體(lipofectin)或其衍生物(例如，結(jié)合了抗體)、聚賴氨酸偶聯(lián)物、短桿菌素S、人工病毒被膜或其它類似的細(xì)胞內(nèi)載體，以及CaPO4沉淀，均可幫助送遞質(zhì)粒DNA。在某些情況中，表達(dá)構(gòu)建體可通過被注射至需要該表達(dá)的特定細(xì)胞或組織中而得以直接送遞。本領(lǐng)域任一技術(shù)人員均可根據(jù)需要該表達(dá)的細(xì)胞或組織的不同、給藥是全身性還是局部，以及表達(dá)的理想劑量，而輕松地在上述送遞系統(tǒng)中進(jìn)行選擇。
一種被用于施用可表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的核酸(表達(dá)構(gòu)建體)的特定方法是通過利用含有特定核酸的病毒載體，其中該特定核酸編碼本發(fā)明融合蛋白。采用病毒載體感染細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于，大部分目標(biāo)細(xì)胞均可接受該核酸。此外，在該病毒載體內(nèi)，由例如，該病毒載體所含cDNA編碼的分子均可在接收該載體的細(xì)胞內(nèi)被有效表達(dá)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺伴隨病毒載體通常被認(rèn)為是可被選擇用于將外源基因轉(zhuǎn)移進(jìn)體內(nèi)，尤其是人體內(nèi)的重組基因送遞系統(tǒng)。這些載體可將基因有效送遞進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，并可將被轉(zhuǎn)移的核酸穩(wěn)定地整合進(jìn)宿主染色體DNA中。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的應(yīng)用而言，一個(gè)主要前提是需確保其應(yīng)用的安全性，尤其是野生型病毒可能在該細(xì)胞群體中擴(kuò)散時(shí)的情況下。僅可生成復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒的專用細(xì)胞系(被稱為“包裝細(xì)胞系”)的發(fā)展提高了基因治療所用逆轉(zhuǎn)錄病毒的效用，并且對(duì)基因治療用途而言，該缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒在基因轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用已獲得很好的表征(參見Miller，A.D.(1990)Blood 76271中的論述)。因此，可構(gòu)建特定的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，在該逆轉(zhuǎn)錄病毒中，逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼序列部分(gag，pol，env)已被編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸替代，從而造成了該逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制缺陷。該復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒隨后被包裝進(jìn)特定的病毒體中，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)并利用輔助病毒，可將該病毒體用于感染目標(biāo)細(xì)胞。制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和利用該病毒體外或體內(nèi)感染細(xì)胞的方法可參見Greene Publishing Associates，(1989)出版Ausubel，F(xiàn).M.等人(編輯)的Current Protocols in MolecularBiology中的9.10-9.14節(jié)及其它標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒實(shí)例包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。可用于制備親宅性和兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的合適包裝病毒系實(shí)例包括ψCrip、ψCre、ψ2和ψAm。逆轉(zhuǎn)錄病毒已被用于將多種基因?qū)朐S多不同的細(xì)胞類型中，包括體外和/或體內(nèi)的上皮細(xì)胞(見例如Eglitis，et al.(1985)Science 2301395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853014-3018；Armentano et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876141-6145；Huber et al.(1991)Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 888039-8043；Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888377-8381；Chowdhury etal.(1991)Science 2541802-1805；van Beusechem et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897640-7644；Kay et al.(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai et al.(1992)P roc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu et al.(1993)J.Immunol.1504104-4115；美國(guó)專利No4,868,116；美國(guó)專利No4,980,286；PCT公開物W089/07136；PCT公開物WO89/02468；PCT公開物WO89/05345；和PCT公開物WO 92/07573)。
此外，已有研究顯示，通過修飾病毒顆粒表面上的病毒包裝蛋白，便可能限制逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染譜，并從而限制以逆轉(zhuǎn)錄病毒為基礎(chǔ)的載體的感染譜(見例如，PCT公開物WO93/25234和WO94/06920)。例如，修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染譜的方法包括將特異于細(xì)胞表面抗原的抗體偶聯(lián)至該病毒env蛋白(Roux et al.(1989)PNAS869079-9083；Julan et al.(1992)J.Gen Virol 733251-3255；和Goud et al.(1983)Virology 163251-254)；或者將細(xì)胞表面受體配體偶聯(lián)至該病毒env蛋白(Neda et al.(1991)JBiol Chem26614143-14146)。偶聯(lián)的形式可以是與一個(gè)蛋白質(zhì)或其它多種受體-配體藥物化學(xué)交聯(lián)，也可通過生成融合蛋白(例如單鏈抗體/env融合蛋白)實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。
可應(yīng)用于本發(fā)明的另一種病毒基因送遞系統(tǒng)利用了腺病毒衍生載體。腺病毒的基因組可以被操縱，從而編碼并表達(dá)目標(biāo)基因產(chǎn)物，但其在正常裂解病毒生活周期中的復(fù)制能力被鈍化了。參見，例如Berkner et al.(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld et al.(1991)Science 252431-434；和Rosenfeld et al.(1992)Cell68143-155。由腺病毒菌株Ad型5d1324或其它腺病毒菌株衍生的合適腺病毒載體(例如，Ad2、Ad3、Adz等)均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。該病毒顆粒相對(duì)穩(wěn)定，并易于純化和濃縮，并且如上所述，可以被修飾，從而影響感染譜。另外，被導(dǎo)入的腺病毒DNA(及其所含外源DNA)未被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，仍保持了游離狀態(tài)，從而避免了在將導(dǎo)入DNA整合進(jìn)宿主基因組內(nèi)(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA)時(shí)，因插入誘變所導(dǎo)致出現(xiàn)的潛在難題。此外，對(duì)外源DNA而言，該腺病毒基因組的負(fù)載力比其它基因送遞載體大(高達(dá)8千堿基對(duì))(Berkneret al.出處同上；Haj-Ahmand and Graham(1986)J.Virol.57267)。目前通用并因而被本發(fā)明所偏愛的大部分復(fù)制缺陷腺病毒載體均缺失了全部或部分病毒E1和E 3基因，但仍保留了最多達(dá)80％的腺病毒遺傳物質(zhì)(見，例如Jones et al.(1979)Cell 16683；Berkner et al.，同上；和Graham et al.在Methods in MolecularBiology，E.J.Murray，Ed.(Humana，Clifton，NJ，1991)vol.7.pp.109-127)。插入基因的表達(dá)可以受例如，E1A啟動(dòng)子、主要晚期啟動(dòng)子(MLP)和相關(guān)前導(dǎo)序列、E3啟動(dòng)子，或外源插入啟動(dòng)子序列的控制。
另一種有助于送遞本發(fā)明基因和編碼本發(fā)明融合蛋白的基因的病毒載體系統(tǒng)是腺伴隨病毒(AAV)。腺伴隨病毒是天然存在的缺陷病毒，該缺陷病毒需要以另一種病毒，諸如腺病毒或皰疹病毒作為輔助病毒，才可進(jìn)行有效復(fù)制，并具有生產(chǎn)性生活周期。(相關(guān)論述可參見Muzyczka et al.Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)15897-129)。它也是少數(shù)幾種可將其自身DNA整合進(jìn)非分裂細(xì)胞，并顯示高頻率穩(wěn)定整合的病毒中的一種(參見，例如Flotte et al.(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulskietal.(1989)J.Virol.633822-3828；和McLaughlin et al.(1989)J.Virol.621963-1973)。含有少至300個(gè)堿基對(duì)AAV的載體可以被包裝，也可被整合。與外源DNA對(duì)應(yīng)的空間被限定為大約4.5kb。AAV載體，諸如Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.53251-3260所描述的AAV載體，可被用于將本發(fā)明基因或編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中。已有多種核酸通過AAV載體被導(dǎo)入不同的細(xì)胞類型中(參見例如Hermonat et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816466-6470；Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford et al.(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin et al.(1984)J.Virol.51611-619；和Flotte et al.(1993)J.Biol.Chem.2683781-3790)。
從皰疹病毒、牛痘病毒、慢病毒及若干RNA病毒已衍生獲得了可被用于施用表達(dá)構(gòu)建體的其它病毒載體系統(tǒng)。
除了諸如上述方法的病毒轉(zhuǎn)移法外，也可采用非病毒方法施用包括細(xì)菌和真核表達(dá)構(gòu)建體在內(nèi)的表達(dá)構(gòu)建體。基因轉(zhuǎn)移的大部分非病毒方法依賴于哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝取并細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)大分子的正常機(jī)制。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的非病毒基因送遞系統(tǒng)依賴于內(nèi)吞途徑，以通過被錨定細(xì)胞攝取本發(fā)明基因或編碼本發(fā)明融合蛋白的基因。該類型的典型基因送遞系統(tǒng)包括脂質(zhì)體衍生系統(tǒng)、聚賴氨酸偶聯(lián)物和人工病毒包膜。
在一種代表性的實(shí)施方案中，本發(fā)明基因或編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸可被包埋進(jìn)特定脂質(zhì)體中，該脂質(zhì)體表面帶有正電荷(例如lipofectins)，并(任選地)標(biāo)記有與細(xì)胞表面抗原對(duì)應(yīng)的抗體或配體(Mizuno et al.(1992)No Shinkei Geka 20547-551；PCT公開物WO91/06309；日本專利申請(qǐng)1047381；和歐洲專利申請(qǐng)EP-A-43075)。在另一個(gè)實(shí)例中，該脂質(zhì)體可被標(biāo)記有特定的單克隆抗體，該單克隆抗體對(duì)關(guān)節(jié)中存在的抗原具有特異性(例如，對(duì)治療關(guān)節(jié)炎及軟骨和/或關(guān)節(jié)的其它病癥而言)。類似地，該方法可被改良用于將本發(fā)明蛋白特異性地錨定任意組織，以更為特異性地治療影響該組織的病癥(例如特定組織的癌癥、IBD、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脈管炎等)。
上述任意一種基因送遞系統(tǒng)的實(shí)際給藥均可通過本領(lǐng)域熟知的大量方法中的任意一種而得以實(shí)現(xiàn)。例如，該基因送遞系統(tǒng)的藥物制劑可被全身性導(dǎo)入，例如，通過靜脈內(nèi)注射，且因轉(zhuǎn)染特異性由基因送遞載體、細(xì)胞型或組織型表達(dá)，或這幾種情況的組合所提供，使得本發(fā)明蛋白質(zhì)在目標(biāo)細(xì)胞中主要發(fā)生特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中上述細(xì)胞型或組織型表達(dá)取決于控制受體基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。在另一些實(shí)施方案中，該重組基因被完全定位地導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，從而使該重組基因的初期送遞更為有限。例如，通過導(dǎo)管(參見美國(guó)專利5,328,470)、立體定位注射(例如Chen et al.(1994)PNAS 913054-3057)或電穿孔(Dev et al.(1994)Cancer Treat Rev 20105-115)，均可將該基因送遞載體導(dǎo)入特定組織中。
基因治療構(gòu)建體的藥物制劑可以基本上由被稀釋在可接受稀釋劑中的基因送遞系統(tǒng)組成，或者可以包括緩釋基質(zhì)，從而將基因送遞載體包埋其中?？蛇x地，當(dāng)重組細(xì)胞可完整地生成整個(gè)基因送遞系統(tǒng)，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，該藥物制劑可包含一種或多種可生成該基因送遞系統(tǒng)的細(xì)胞。
施用以核酸為基礎(chǔ)或以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的組合物的方法可通過本領(lǐng)域熟知的諸多方法中的任意一種而得以實(shí)現(xiàn)。這些方法包括局部或全身性給藥，并進(jìn)一步包括真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口和鼻內(nèi)的給藥途徑。另外，通過任意合適途徑，包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射，將本發(fā)明藥物組合物導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能是理想的。心室內(nèi)注射可通過心室內(nèi)導(dǎo)管，例如，將該導(dǎo)管與儲(chǔ)存器，諸如Ommaya儲(chǔ)存器相連。導(dǎo)入方法也可由可再充電或生物可降解裝置提供。此外，預(yù)期可通過包被裝置、植入物、支架或假體從而實(shí)現(xiàn)給藥。
例如，可將被關(guān)節(jié)疾病，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重?fù)p害的軟骨完全或部分地置換為多種假體。有多種合適的可移植材料存在，包括那些以膠原-糖胺聚糖模板為基礎(chǔ)的可移植材料(Stone et al.(1990)Clin Orthorp Relat Red 252129)、以分離的軟骨細(xì)胞為基礎(chǔ)的可移植材料(Grande et al.(1989)J Orthop Res 7208；和Takigawa et al.(1987)Bone Miner 2449)，和以附著在天然或合成聚合物上的軟骨細(xì)胞為基礎(chǔ)的可移植材料(Walitani et al.(1989)J Bone Jt Surg 71B74；Vacanti et al.(1991)PlastReconstr Surg 88753；von Schroeder et al.(1991)J BiomedMater Res 25329；Freed et al.(1993)J Biomed Mater Res 2711；和Vacanti et al.的美國(guó)專利No.5,041,138)。例如，軟骨細(xì)胞可在生物可降解、生物相容高度多孔支架上的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，這些支架由諸如聚乙醇酸、聚乳酸、瓊脂糖凝膠的聚合物，或其它聚合物形成，該些聚合物可隨時(shí)間，按照多聚物主鏈水解函數(shù)，降解為無(wú)害單體。上述基質(zhì)被設(shè)計(jì)為在移植進(jìn)行前一直能夠與細(xì)胞進(jìn)行充分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體交換。該細(xì)胞可被體外培養(yǎng)，直至具有對(duì)可移植細(xì)胞而言足夠的細(xì)胞體積和密度為止。上述基質(zhì)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于它們可以根據(jù)個(gè)體的不同而被澆鑄或定型為指定形狀，從而使最終產(chǎn)物近似于患者自身的耳或鼻(舉例來說)，或者可以采用柔性基質(zhì)，有助于移植時(shí)的操作，例如在關(guān)節(jié)中的情況。
上述及其它植入物和假體均可經(jīng)由本發(fā)明融合蛋白或含特定核酸的表達(dá)構(gòu)建體處理，該特定核酸可表達(dá)本發(fā)明融合蛋白。這樣，便可將本發(fā)明融合蛋白直接施用于特定的感染組織處(例如，受損關(guān)節(jié)處)。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白或抗體可作為聯(lián)合治療的一部分，與其它藥劑一起被施用。聯(lián)合治療指結(jié)合了兩種或兩種以上不同治療性化合物的任何給藥形式，從而在施用第二種化合物時(shí)，預(yù)先被施用的治療性化合物在體內(nèi)仍然有效(例如，兩種化合物在患者體內(nèi)同時(shí)有效，這可能包括兩種化合物的協(xié)同作用)。例如，不同的治療性化合物可在同一配方或不同配方中，被伴隨或相繼施用。因此，接受該治療的個(gè)體可獲得不同治療性化合物的聯(lián)合(協(xié)同)效果。
例如，在炎癥情況中，本發(fā)明蛋白或抗體可結(jié)合一種或多種用于治療炎性疾病或病癥的藥劑一起被施用。用于治療炎性疾病或病癥的藥劑包括，但不僅限于，抗炎劑或消炎劑。消炎劑包括，例如糖皮質(zhì)激素，諸如可的松、氫化可的松、強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍、氟可龍、氟羥脫氫皮甾醇、甲基強(qiáng)的松龍、潑尼立定、帕拉米松、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、氟潑尼定、去氧米松、膚輕松、氟米松、二氟米松、氯可托龍、氯倍他索和氟考丁酯；免疫抑制劑，諸如抗TNF劑(例如依那西普、英利西單抗)和IL-1抑制劑；青霉胺；非甾族抗炎劑(NSAIDs)，包括抗炎、鎮(zhèn)痛和退熱藥，諸如水楊酸、塞來昔布、difunisal，也包括來自于取代苯乙酸鹽或2苯基丙酸鹽的非甾族抗炎劑，諸如阿氯芬酸、異丁芬酸、布洛芬、clindanac、苯克洛酸、酮洛芬、非諾洛芬、吲哚洛芬、芬氯酸、環(huán)氟拉嗪、氟比洛芬、吡洛芬、萘普生、苯惡洛芬、卡洛芬和環(huán)洛芬；昔康衍生物，諸如吡羅昔康；鄰氨基苯甲酸衍生物，諸如甲滅酸、氟滅酸、托滅酸和甲氯滅酸、苯胺基取代煙酸衍生物，諸如fenamates miflumic acid、氯尼辛和氟尼辛；雜芳基乙酸，其中雜芳基為2-吲哚-3-基或.吡咯-2-基團(tuán)，諸如茚甲新、oxmetacin、intrazol、阿西美辛、桂美辛、佐美酸、托美汀、氯吡酸和噻洛芬酸；蘇靈大型茚基乙酸；具有止痛活性的雜芳氧基乙酸，諸如benzadac；苯丁唑酮；依托度酸；萘丁美酮；和改善病情抗風(fēng)濕藥(DMARD)，諸如氨甲蝶呤、金制劑、羥化氯喹、柳氮磺胺吡啶、環(huán)孢霉素、硫唑嘌呤和來氟米特。
用于治療炎性疾病或病癥的其它療法包括抗氧化劑?？寡趸瘎┛梢允翘烊换蚝铣傻摹？寡趸瘎┲T如超氧化物歧化酶(SOD)、21-氨基類固醇/氨基色滿、維生素C或E等。其它的許多抗氧化劑也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
本發(fā)明蛋白或抗體可充當(dāng)炎癥治療方案的一部分，該方案可結(jié)合多種不同的抗炎劑。例如，本發(fā)明融合蛋白或抗體可結(jié)合一種或多種NSAID、DMARD或免疫抑制劑一起被施用。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白可與氨甲蝶呤一起被施用。在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白可與TNF-α抑制劑一起被施用。
在被認(rèn)為存在實(shí)際炎性成分的心血管疾病，尤其是由動(dòng)脈粥樣硬化斑引發(fā)的心血管疾病情況中，本發(fā)明蛋白或抗體可結(jié)合一種或多種其它用于治療心血管疾病的藥劑一起被施用。用于治療心血管疾病的藥劑包括，但不僅限于β阻斷劑，諸如卡維地洛、美多心安、布新洛爾、比索洛爾、氨酰心安、心得安、萘羥心安、噻嗎心安、心得靜和柳胺芐心定；抗血小板劑，諸如阿司匹林和噻氯匹定；血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制劑，諸如卡托普利、依那普利、賴諾普利、貝那普利、福辛普利、喹那普利、雷米普利、螺普利和莫昔普利.；和降脂劑，諸如美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀和羅素他汀。
在癌癥的情況中，本發(fā)明蛋白或抗體可結(jié)合一種或多種抗血管生成因子、化學(xué)療法，或者作為放射療法的佐劑被施用。進(jìn)一步展望本發(fā)明蛋白或抗體的施用可作為癌癥治療方案的一部分，該癌癥治療方案可結(jié)合多種不同的癌癥治療劑。在IBD的情況中，本發(fā)明融合蛋白或抗體可結(jié)合一種或多種抗炎劑一起被施用，并可另外結(jié)合改良的飲食制度。
本發(fā)明融合蛋白的施用(或作為蛋白組合物，或作為編碼本發(fā)明蛋白的核酸組合物)可被用于治療RAGE相關(guān)病癥，或者可結(jié)合其它藥劑和治療方案一起被用于治療RAGE相關(guān)病癥。
8.藥物篩選實(shí)驗(yàn)在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定特定試驗(yàn)化合物的實(shí)驗(yàn)方法，該試驗(yàn)化合物可抑制RAGE-BP(例如S100或兩性蛋白)與受體多肽(例如上述RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)的結(jié)合。
在某些實(shí)施方案中，該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了可調(diào)節(jié)RAGE受體信號(hào)傳遞活性的試驗(yàn)化合物，該信號(hào)傳遞活性由選自S100和兩性蛋白的RAGE-BP誘導(dǎo)。該信號(hào)傳遞活性包括，但不僅限于，與其它細(xì)胞組成結(jié)合、活化酶，諸如促分裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)，活化NF-kB轉(zhuǎn)錄活性等。
有多種實(shí)驗(yàn)形式均滿足需要，并且根據(jù)本公開內(nèi)容，此處未詳述的實(shí)驗(yàn)形式仍可被本領(lǐng)域任意一位普通技術(shù)人員理解。實(shí)驗(yàn)形式大致為諸如蛋白質(zhì)復(fù)合體形成、酶活性的條件，且該實(shí)驗(yàn)形式可以多種不同形式產(chǎn)生，并包括以無(wú)細(xì)胞體系，例如已純化的蛋白或細(xì)胞溶解產(chǎn)物為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)，以及以細(xì)胞為基礎(chǔ)，即利用完整細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)單結(jié)合實(shí)驗(yàn)可被用于檢測(cè)抑制RAGE-BP(例如S100或兩性蛋白)與受體多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)之間相互作用的化合物。待檢化合物可由，例如細(xì)菌、酵母或其它生物體生成(例如天然產(chǎn)物)，也可通過化學(xué)法或重組法制備(例如小分子，包括肽模擬體)。
在許多實(shí)施方案中，采用候選化合物溫育細(xì)胞后，操縱并測(cè)定細(xì)胞的RAGE受體信號(hào)傳遞活性，該活性由RAGE-BP(例如S100或兩性蛋白)誘導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，對(duì)該活性的生物測(cè)定可以包括NF-kB活性測(cè)定(例如NF-kB熒光素酶或GFP報(bào)道基因測(cè)定)。
典型的NF-kB熒光素酶或GFP報(bào)道基因測(cè)定可參照Shona et al.(2002)FEBS Letters.515119-126所述方法進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，采用NF-kB-熒光素酶報(bào)道基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。隨后，采用候選化合物溫育該轉(zhuǎn)染細(xì)胞。接著，在經(jīng)由該化合物處理，或未經(jīng)該化合物處理的細(xì)胞中測(cè)定NF-kB激發(fā)的熒光素酶活性。可選地，采用NF-kB-GFP報(bào)道基因(Stratagene)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。隨后，采用候選化合物溫育該轉(zhuǎn)染細(xì)胞。接著，通過采用熒光/可見光顯微鏡裝置測(cè)定GFP表達(dá)，或通過FACS分析，以監(jiān)測(cè)NF-kB激發(fā)的基因活性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組蛋白制劑，該制劑含有受體多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)，和一種或多種RAGE-BP(例如S100或兩性蛋白)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)包括體外標(biāo)記蛋白質(zhì)相互結(jié)合實(shí)驗(yàn)、對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫測(cè)定等。純化蛋白也可被用于測(cè)定三維晶體結(jié)構(gòu)，該測(cè)定可被用于模擬分子間的相互作用。
在本發(fā)明實(shí)驗(yàn)的某些實(shí)施方案中，RAGE-BP多肽(例如S100或兩性蛋白)或受體多肽(例如RAGE)可以是被選擇用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞的內(nèi)源多肽。可選地，RAGE-BP多肽或受體多肽(例如RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)可以是外源多肽。例如，通過重組技術(shù)(例如通過利用表達(dá)載體)，和通過顯微注射本發(fā)明融合蛋白本身或編碼該融合蛋白的mRNA，便可將融合蛋白導(dǎo)入細(xì)胞中。
在本發(fā)明實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可在完整細(xì)胞內(nèi)生成RAGE-BP與受體多肽形成的復(fù)合體，同時(shí)利用了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以利于本發(fā)明實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。例如，如上所述，在真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，包括哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞中，可構(gòu)成該復(fù)合體。在完整細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)包括具有檢測(cè)特定化合物的能力，其中該特定化合物在更近似于其治療用途所需條件的環(huán)境中發(fā)揮了功能，而該功能包括化合物進(jìn)入細(xì)胞的能力。此外，在本發(fā)明實(shí)驗(yàn)的某些體內(nèi)實(shí)施方案中，諸如下述實(shí)例，均可對(duì)候選化合物實(shí)現(xiàn)高通量的分析。
在本發(fā)明實(shí)驗(yàn)的某些體外實(shí)施方案中，重組復(fù)合體包括至少被半純化的蛋白質(zhì)的重組混合物。半純化指上述重組混合物中利用的蛋白質(zhì)已預(yù)先與其它細(xì)胞蛋白分離。例如，與細(xì)胞溶解產(chǎn)物相比，該復(fù)合體形成所含蛋白質(zhì)在混合物中的純度相對(duì)于該混合物中所有其它蛋白質(zhì)的純度，至少為50％，且更優(yōu)選的純度是90-95％。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，重組蛋白混合物是通過將高度純化的蛋白質(zhì)混合而獲得的，因此，該重組混合物基本上缺乏其它蛋白質(zhì)(諸如來源于細(xì)胞的那些蛋白)，而這些蛋白可能干擾或以其它方式改變測(cè)定該復(fù)合體裝配和/或分解的能力。
在某些實(shí)施方案中，可在任何適合容納反應(yīng)物的容器中實(shí)現(xiàn)候選化合物存在和缺乏情況下的測(cè)定。該容器實(shí)例包括微量滴定板、試管和微離心管。
在某些實(shí)施方案中，可形成具有如下特征的藥物篩選實(shí)驗(yàn)，即該實(shí)驗(yàn)基于試驗(yàn)化合物干擾特定復(fù)合體裝配、穩(wěn)定性或功能的能力對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，其中該復(fù)合體由RAGE-BP(例如S100或兩性蛋白)和受體多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)形成。在一種典型的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)化合物與含有RAGE-LBE-免疫球蛋白融合多肽和RAGE-BP，諸如S100或兩性蛋白的混合物接觸。對(duì)上述復(fù)合體的檢測(cè)和定量提供了測(cè)定化合物特定功效的途徑，該功效即化合物在抑制上述復(fù)合體兩種組成之間相互作用方面的功效?；衔锏脑摴πЭ赏ㄟ^特定數(shù)據(jù)所生成的劑量反應(yīng)曲線而得以評(píng)估，該特定數(shù)據(jù)是通過采用多個(gè)濃度的試驗(yàn)化合物獲得的。此外，也可進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以提供基線用于比較。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合體的形成是在缺乏試驗(yàn)化合物的條件下被定量的。
在某些實(shí)施方案中，可通過多種技術(shù)檢測(cè)復(fù)合體中兩種多肽(例如RAGE-BP和受體多肽)之間的結(jié)合，這些技術(shù)中的許多技術(shù)已在上文得到了描述。例如，復(fù)合體形成中的調(diào)節(jié)可采用，例如可檢測(cè)標(biāo)記蛋白(例如放射標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記的)，通過免疫測(cè)定，或通過色譜檢測(cè)而得以定量。表面等離子共振系統(tǒng)，諸如BiacoreInternational AB(Uppsala，Sweden)可提供的表面等離子共振系統(tǒng)也可被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。
在某些實(shí)施方案中，含有RAGE-BP和受體多肽的復(fù)合體中的一種多肽可以被固定，從而有利于從未復(fù)合形式的其它多肽中分離該復(fù)合體，也配合了該實(shí)驗(yàn)的自動(dòng)化操作。在一種例證性的實(shí)施方案中，可提供一種插入了特定區(qū)域的融合蛋白，該區(qū)域可使該蛋白質(zhì)與不溶性基質(zhì)結(jié)合。例如，GST-RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白可被吸收至谷胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，隨后使該谷胱甘肽瓊脂糖珠或谷胱甘肽衍生的微量滴定板與可能相互作用的蛋白質(zhì)(例如標(biāo)記有35S的S100多肽)結(jié)合，并在有助于復(fù)合體形成的條件下溫育該試驗(yàn)化合物。溫育結(jié)束后，洗滌珠體，以除去所有未結(jié)合的相互作用蛋白，并直接測(cè)定與該基質(zhì)珠結(jié)合的放射性標(biāo)記(例如將珠體置入閃爍體中)，或者在復(fù)合體解離后，在上清液中測(cè)定與基質(zhì)珠結(jié)合的放射性標(biāo)記，例如在采用微量滴定板的情況中?？蛇x地，洗掉未結(jié)合蛋白質(zhì)后，可使復(fù)合體與基質(zhì)解離，通過SDS-PAGE凝膠分離，并采用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)從凝膠中定量出基質(zhì)結(jié)合部分中存在相互作用的多肽水平。
在另一種實(shí)施方案中，可采用雙雜交實(shí)驗(yàn)(也被稱為相互作用陷阱實(shí)驗(yàn))檢測(cè)RAGE-LBE與RAGE-BP所形成復(fù)合體中兩種多肽的相互作用(也可參見美國(guó)專利NO5,283,317；Zervos et al.(1993)Cell72223-232；Madura et al.(1993)J.Biol Chem 26812046-12054；Bartel et al.(1993)Biotechniques 14920-924；和Iwabuchi etal.(1993)Oncogene 81693-1696)，也可將該雙雜交實(shí)驗(yàn)繼續(xù)用于檢測(cè)可抑制RAGE-LBE-免疫球蛋白融合多肽與RAGE-BP多肽結(jié)合的試驗(yàn)化合物。該實(shí)驗(yàn)包括提供宿主細(xì)胞，例如，酵母細(xì)胞(優(yōu)選的)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞類型。該宿主細(xì)胞含有特定報(bào)道基因，該報(bào)道基因具有與誘餌蛋白所用轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合區(qū)對(duì)應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，因此該報(bào)道基因被轉(zhuǎn)錄激活時(shí)，便可表達(dá)可檢測(cè)基因產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)提供了第一嵌合基因，該基因可在上述宿主細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)，并編碼“誘餌”融合蛋白。該實(shí)驗(yàn)也提供了第二嵌合基因，該基因也可在上述宿主細(xì)胞中被表達(dá)，并編碼“魚”融合蛋白。一種實(shí)施方案中，第一和第二嵌合基因均以質(zhì)粒形式被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。但優(yōu)選地使第一嵌合基因位于宿主細(xì)胞的染色體上，而將第二嵌合基因作為質(zhì)粒部分導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了雙雜交實(shí)驗(yàn)以鑒定特定試驗(yàn)化合物，該化合物可抑制RAGE-BP多肽(例如S100和兩性蛋白)與受體多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)的結(jié)合。例如，將含有受體多肽的“誘餌”蛋白，和含有RAGE-BP多肽(例如S100或兩性蛋白)的“魚”蛋白導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。使細(xì)胞處于特定條件下，可使誘餌和魚融合蛋白均以足夠活化報(bào)道基因的量表達(dá)。兩種融合多肽的相互作用導(dǎo)致了可檢測(cè)信號(hào)的出現(xiàn)，該信號(hào)由報(bào)道基因表達(dá)生成。因此，在試驗(yàn)化合物存在和缺乏的兩種情況中，兩種融合蛋白之間的相互作用水平可通過檢測(cè)各情況中報(bào)道基因的表達(dá)水平而得以評(píng)估。根據(jù)本發(fā)明方法可采用多種報(bào)道構(gòu)建體，這些構(gòu)建體包括，例如可產(chǎn)生下述可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)道基因，該可檢測(cè)信號(hào)選自酶信號(hào)、熒光信號(hào)、磷光信號(hào)和抗藥性。
在許多測(cè)試化合物和天然提取物文庫(kù)的藥物篩選程序中，為使指定時(shí)限內(nèi)所鑒定化合物的數(shù)量最大化，采用高通量分析是理想的?？稍跓o(wú)細(xì)胞體系中進(jìn)行的本發(fā)明實(shí)驗(yàn)，諸如可采用已純化或半純化蛋白或溶解產(chǎn)物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)通常被稱為“初級(jí)”篩選，該篩選的進(jìn)行可使針對(duì)分子目標(biāo)中的變化的檢測(cè)快速進(jìn)行并相對(duì)簡(jiǎn)單，其中分子目標(biāo)中的變化由試驗(yàn)化合物所介導(dǎo)。此外，在體外系統(tǒng)中，通?？梢院雎栽囼?yàn)化合物的細(xì)胞毒性和/或生物利用率的影響，實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注的是藥物對(duì)分子目標(biāo)的作用，該作用可通過分子目標(biāo)與其它蛋白結(jié)合親和力的改變或該分子目標(biāo)酶特性的變化而得以顯現(xiàn)。
在某些實(shí)施方案中，可通過免疫沉淀和對(duì)共免疫沉淀蛋白的分析，或通過親和純化和對(duì)共純化蛋白的分析，評(píng)估RAGE-BP與受體之間的復(fù)合體形成。以熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)也可被用于確定該復(fù)合體形成。具有合適發(fā)射和激發(fā)光譜的熒光分子被帶入彼此接近的位置時(shí)，便可顯示出FRET。該熒光分子是特選的，因而其中一個(gè)分子(供體分子)的發(fā)射光譜與另一個(gè)分子(受體分子)的激發(fā)光譜重疊。供體分子被其激發(fā)光譜范圍內(nèi)合適強(qiáng)度的光所激發(fā)。隨后該供體便以熒光形式發(fā)射被吸收的能量。它所產(chǎn)生的熒光能量被受體分子淬滅。FRET可通過供體來源熒光信號(hào)強(qiáng)度的降低、供體被激發(fā)狀態(tài)壽命的縮短，和/或受體較長(zhǎng)波長(zhǎng)(較低能量)特征處熒光的再發(fā)射而得以顯現(xiàn)。當(dāng)熒光蛋白在物理上分散時(shí)，F(xiàn)RET效應(yīng)便被削弱或消除了(見例如，美國(guó)專利No.5,981,200)。
FRET的發(fā)生也導(dǎo)致供體熒光部分的熒光壽命縮短了。熒光壽命的變化可通過利用被稱為熒光壽命成像技術(shù)(FLIM)測(cè)定(Verveer et al.(2000)Science 2901567-1570；Squire et al.(1999)J.Microsc.19336；Verveer et al.(2000)Biophys.J.782127)。人們已研發(fā)出可用于分析FLIM數(shù)據(jù)的整體分析技術(shù)。這些算法利用了一種認(rèn)識(shí)，即供體熒光部分僅存在于有限數(shù)量的狀態(tài)中，各狀態(tài)均具有獨(dú)特的熒光壽命。各狀態(tài)的定量圖可在逐個(gè)像素的基礎(chǔ)上生成。
為進(jìn)行以FRET為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)，需將RAGE-BP多肽(例如S100或兩性蛋白)和受體多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)二者熒光標(biāo)記。根據(jù)本說明書，合適的熒光標(biāo)記是本領(lǐng)域熟知的。下文提供了實(shí)例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員也可采用此處未具體論述的合適熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記可通過將多肽與一種熒光蛋白，例如分離自水母、珊瑚蟲及其它腔腸動(dòng)物的熒光蛋白一起作為融合蛋白表達(dá)而得以實(shí)現(xiàn)。典型的熒光蛋白包括來源自Aequoria victoria水母的綠色熒光蛋白(GFP)的許多變體。變體可以是發(fā)光體、變光體，或者具有不同的激發(fā)和/或發(fā)射光譜。某些變體被改變后不再出現(xiàn)綠色，并可能出現(xiàn)藍(lán)色、藍(lán)綠色、黃色或紅色(分別被稱為BFP、CFP、YFP和RFP)。熒光蛋白可通過多種共價(jià)和非共價(jià)連接，包括，例如肽鍵(例如作為融合蛋白表達(dá))、化學(xué)交聯(lián)和生物素-鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)，與多肽穩(wěn)定附著。熒光蛋白的實(shí)例參見美國(guó)專利Nos.5,625,048；5,777,079；6,066,476；6,124,128；Prasher et al.(1992)Gene，111229-233；Heim et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，9112501-04；Ward et al.(1982)Photochem.Photobiol.，35803-808；Levine et al.(1982)Comp.Biochem.Physiol.，72B77-85；Tersikh et al.(2000)Science 2901585-88。
以FRET為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)可被應(yīng)用在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)和無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中。以FRET為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)應(yīng)按照高通量篩選方法進(jìn)行，該方法包括熒光激活細(xì)胞分類術(shù)和微滴陣列的熒光篩選。
通常，在篩選實(shí)驗(yàn)為結(jié)合實(shí)驗(yàn)的情況中(無(wú)論是蛋白質(zhì)相互結(jié)合，還是化合物-蛋白質(zhì)結(jié)合等)，分子中的一個(gè)或多個(gè)均可與一個(gè)標(biāo)記連接，其中該標(biāo)記可直接或間接地提供可檢測(cè)信號(hào)。多種標(biāo)記包括放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶、特異性結(jié)合分子、粒子，例如磁性粒子等。特異性結(jié)合分子包括配對(duì)的結(jié)合分子，諸如生物素和鏈霉抗生物素蛋白、異羥基洋地黃毒苷原和抗異羥基洋地黃毒苷原等。根據(jù)已知的操作方法，對(duì)特異性結(jié)合的成員而言，互補(bǔ)成員通常應(yīng)被標(biāo)記有可供檢測(cè)的分子。
篩選實(shí)驗(yàn)可包括其它多種試劑。這些試劑包括那些可被采用以利于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)最佳結(jié)合和/或減少非特異性或背景相互作用的試劑，如鹽、中性蛋白，例如白蛋白，去污劑等?？商岣邔?shí)驗(yàn)效率的試劑，諸如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物化合物等試劑也可被采用?；旌衔锔鹘M分可以任意順序添加，但該順序應(yīng)為必需的結(jié)合做準(zhǔn)備。溫育可在任意合適溫度下進(jìn)行，典型地為4℃～40℃。溫育期是針對(duì)最適活性而特選的，但也可被最優(yōu)化以利于快速高通量的篩選。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了不依賴復(fù)合體的實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)直接針對(duì)，諸如(RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)的復(fù)合體中的單個(gè)多肽。該實(shí)驗(yàn)包括對(duì)試驗(yàn)化合物的鑒定，該試驗(yàn)化合物是抑制RAGE-BP與受體多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)結(jié)合的候選抑制劑。
在一種典型的實(shí)施方案中，通過采用受體RAGE-LBE多肽，可鑒定與受體多肽結(jié)合的化合物。在一種例證性的實(shí)施方案中，RAGE-LBE-免疫球蛋白的融合蛋白可插入一個(gè)附加區(qū)域，該區(qū)域可使融合蛋白與不溶性基質(zhì)結(jié)合。例如，與GST蛋白融合的RAGE-LBE-免疫球蛋白可被吸收至谷胱苷肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱苷肽衍生的微量滴定板上，谷胱苷肽瓊脂糖珠或谷胱苷肽衍生的微量滴定板隨后與潛在的已標(biāo)記結(jié)合化合物結(jié)合，并在有助于結(jié)合的條件下被溫育。溫育結(jié)束后，洗滌珠體，以除去所有未結(jié)合的化合物，并直接測(cè)定與基質(zhì)珠結(jié)合的標(biāo)記，或者在已結(jié)合化合物解離后在上清液中進(jìn)行測(cè)定。
在某些實(shí)施方案中，標(biāo)記可直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)。多種標(biāo)記包括放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、酶、特異性結(jié)合分子、粒子，例如磁性粒子等。特異性結(jié)合分子包括配對(duì)的結(jié)合分子，諸如生物素和鏈霉抗生物素蛋白、異羥基洋地黃毒苷原和抗異羥基洋地黃毒苷原等。根據(jù)已知操作方法，對(duì)特異性結(jié)合成員而言，互補(bǔ)成員通常應(yīng)標(biāo)記有可供檢測(cè)的分子。在某些實(shí)施方案中，該方法包括在體外形成混合物。在某些實(shí)施方案中，該方法通過在體內(nèi)形成混合物，包括了以細(xì)胞為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)。在某些實(shí)施方案中，該方法包括使表達(dá)受體多肽(例如RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白)或其變體的細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸。
在某些實(shí)施方案中，實(shí)驗(yàn)不僅可以無(wú)細(xì)胞體系，例如已純化的蛋白或細(xì)胞溶解產(chǎn)物為基礎(chǔ)，還可以細(xì)胞為基礎(chǔ)，利用完整細(xì)胞。簡(jiǎn)單結(jié)合實(shí)驗(yàn)可被用于檢測(cè)與受體多肽相互作用的化合物。待檢化合物可由，例如細(xì)菌、酵母或其它生物體生成(例如天然產(chǎn)物)，也可通過化學(xué)法或重組法生成(例如，小分子，包括肽模擬體)。
任選地，由上述實(shí)驗(yàn)鑒定的試驗(yàn)化合物可被用于治療RAGE相關(guān)病癥。
9.藥物制劑本發(fā)明的蛋白或核酸最為優(yōu)選地以合適組合物的形式被施用。就合適組合物而言，可列舉出所有通常被用于全身性或局部施用藥物的組合物。藥學(xué)可接受載體基本上應(yīng)為惰性，因而不與活性組分反應(yīng)。合適的惰性載體包括水、酒精、聚乙二醇、礦物油或凡士林、丙二醇等。該藥物制劑(包括本發(fā)明融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸)可被配制用于以適用于人類或獸用藥品的任意方便途徑進(jìn)行的給藥。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了藥學(xué)可接受組合物，該組合物含有有效量的本發(fā)明融合蛋白，并連同配制了一種或多種藥學(xué)可接受載體(添加劑)和/或稀釋劑。如下文所具體描述的，本發(fā)明的藥物組合物可被特別配制，以適用于固體或液體形式的給藥方式，包括適用于下述給藥的方式(1)口服，例如獸用頓服藥(水性或非水性溶液或懸液)、片劑、大丸劑、粉劑、粒劑、應(yīng)用于舌部的糊劑；(2)腸胃外給藥，例如，通過皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，例如，無(wú)菌溶液或懸液；(3)體表應(yīng)用，例如，以乳膏、軟膏或噴霧劑形式應(yīng)用于皮膚；或(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)給藥，例如，以陰道栓劑、乳膏或泡沫形式給藥。不過，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明藥劑可以僅溶解或懸浮于無(wú)菌水中。在某些實(shí)施方案中，該藥物制劑無(wú)熱原性，即不提高患者的體溫。
此處所用短語(yǔ)“有效量”指可在動(dòng)物體內(nèi)有效產(chǎn)生某些預(yù)期效果的一種或多種藥劑、物質(zhì)或組合物的量，該組合物含有本發(fā)明的一種或多種藥劑。應(yīng)當(dāng)認(rèn)可的是，當(dāng)藥劑被用于實(shí)現(xiàn)療效時(shí)，包括“有效量”在內(nèi)的實(shí)際劑量應(yīng)根據(jù)多種情況而改變，這些情況包括被治療的特定病癥、該疾病的嚴(yán)重程度、患者的個(gè)體大小或身體狀況、給藥途徑等。一個(gè)熟練的醫(yī)師可利用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的方法輕松確定合適劑量。
此處所用短語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”指屬于合理醫(yī)學(xué)判斷范疇，適用于與人類和動(dòng)物的組織接觸，且不引起過多毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng)或其它難題或并發(fā)癥，相當(dāng)于具有合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比的化合物、物質(zhì)、組合物和/或劑型。
此處所用短語(yǔ)“藥學(xué)可接受載體”指參與將本發(fā)明藥劑從肌體的一個(gè)器官或部分負(fù)載或轉(zhuǎn)運(yùn)至肌體的另一個(gè)器官或部分的藥學(xué)可接受物質(zhì)、組合物或媒介物，諸如液體或固體填充物、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料。各載體在與配方中其它組分相容的意義上必須是“可接受的”?？沙洚?dāng)藥學(xué)可接受載體的物質(zhì)的某些實(shí)例包括(1)糖類，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉狀西黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，諸如可可油和栓劑蠟；(9)油劑，諸如花生油、棉子油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)乙二醇，諸如丙二醇；(11)多元醇，諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯類，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無(wú)致熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；及(21)其它被應(yīng)用在藥物配方中的無(wú)毒性相容物質(zhì)。
在某些實(shí)施方案中，一種或多種藥劑可含有堿性功能基團(tuán)，諸如氨基或烷氨基，從而能夠與藥學(xué)可接受的酸形成藥學(xué)可接受的鹽。在這個(gè)方面，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的鹽”指本發(fā)明化合物中相對(duì)無(wú)毒性的無(wú)機(jī)和有機(jī)酸加成鹽。這些鹽可在本發(fā)明化合物的最終分離和純化期間被原位制備，或者通過使本發(fā)明已純化的化合物以其游離堿形式分別與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸反應(yīng)，并分離所形成的鹽，而得以制備。代表性的鹽包括溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡萄糖酸鹽、乳糖酸鹽和月桂基磺酸鹽等(見例如Berge et al.(1977)“PharmaceuticalSalts，”J.Pharm.Sci.661-19)。
藥劑中的藥學(xué)可接受鹽包括化合物中的常規(guī)無(wú)毒性鹽或季銨鹽，例如衍生自無(wú)毒性有機(jī)或無(wú)機(jī)酸的常規(guī)無(wú)毒性鹽或季銨鹽。例如，這種常規(guī)無(wú)毒性鹽包括由無(wú)機(jī)酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等衍生的鹽；由有機(jī)酸，諸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、棕櫚酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、磺胺酸、2乙酸基苯甲酸、延胡索酸、甲苯亞磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、異硫羰酸等制備的鹽。
在其它情況中，一種或多種藥劑可含有一個(gè)或多個(gè)酸性功能基團(tuán)，從而能夠與藥學(xué)可接受的堿形成藥學(xué)可接受的鹽。這些鹽同樣可在化合物的最終分離和純化期間被原位制備，或者通過使已純化的化合物以其游離酸形式分別與合適的堿，諸如藥學(xué)可接受金屬陽(yáng)離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽反應(yīng)，或與氨、藥學(xué)可接受的有機(jī)伯胺、仲胺或叔胺反應(yīng)，而得以制備。代表性的堿或堿土鹽包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁鹽等。適用于形成堿加成鹽的代表性有機(jī)胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(見例如Berge et al.，同上)。
潤(rùn)濕劑、乳化劑和潤(rùn)滑劑，諸如硫酸月桂酯鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、隔離劑、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑和加香劑、防腐劑和抗氧化劑也可存在于本發(fā)明組合物中。
藥學(xué)可接受抗氧化劑的實(shí)例包括(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸鹽、丁化羥基苯甲醚(BHA)、丁化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α生育酚等；和(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
本發(fā)明的配方包括適用于口、鼻、體表(包括面頰和舌下)、直腸、陰道和/或腸胃外給藥的配方。該配方可方便地以單位劑型存在，并可通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法制備?？膳c載體物質(zhì)結(jié)合并獲得單一劑型的有效成分的量應(yīng)根據(jù)接受治療的宿主和特定給藥方式的不同而變化?？膳c載體物質(zhì)結(jié)合并獲得單一劑型的有效成分的量通常應(yīng)為可產(chǎn)生療效的化合物的量。通常，在100％的范圍中，有效成分的量的范圍應(yīng)是大約1％～大約99％，優(yōu)選的范圍應(yīng)是大約5％～大約70％，最為優(yōu)選的范圍應(yīng)是大約10％～大約30％。
制備上述配方或組合物的方法包括使藥劑與載體，以及任選的一種或多種助劑聯(lián)合的步驟。通常，該配方是通過使本發(fā)明藥劑與液體載體，或細(xì)碎的固體載體，或與二者一起均勻且緊密地聯(lián)合而得以制備，并且如有必要，隨后還可對(duì)產(chǎn)品塑型。
適用于口服的本發(fā)明配方可為膠囊、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(采用調(diào)味基質(zhì)，通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)、粉劑、粒劑形式，或者為在水性或非水性液體中形成的溶液或懸液形式，或者為水包油或油包水液體乳劑形式，或者為酏劑或糖漿形式，或者為錠劑(采用惰性基質(zhì)，諸如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)形式和/或漱口劑形式等，各種配方形式所含有效成分均為預(yù)定量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明化合物也可以大丸劑、藥糖劑或糊劑形式施用。
在本發(fā)明用于口服的固體劑型(膠囊、片劑、丸劑、糖錠劑、粉劑、粒劑等)中，有效成分與一種或多種藥學(xué)可接受載體，諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，和/或下述任一物質(zhì)混合(1)填充劑或增容劑，諸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合劑，諸如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯砒咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，諸如甘油；(4)崩解劑，諸如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，諸如石蠟；(6)吸收促進(jìn)劑，諸如季銨化合物；(7)潤(rùn)濕劑，諸如鯨蠟醇和甘油單硬脂酸酯；(8)吸收劑，諸如高嶺土和皂土；(9)潤(rùn)滑劑，諸如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、硫酸月桂酯鈉及它們的混合物；和(10)著色劑。在膠囊、片劑和丸劑的情況中，藥物組合物也可包含緩沖劑。相似類型的固體組合物也可作為填充劑應(yīng)用在軟和硬填充明膠膠囊中，這些膠囊采用了諸如乳糖，以及高分子量聚乙二醇等作為賦形劑。
片劑可通過壓縮或塑型而得以制備，任選地含有一種或多種助劑。壓縮片劑可采用粘合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥基乙酸鈉或交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)、表面活性或分散劑而得以制備。塑型片劑可通過在合適的機(jī)器中對(duì)經(jīng)由惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉狀化合物混合物進(jìn)行塑型而得以制備。
本發(fā)明藥物組合物的片劑及其它固體劑型，諸如糖錠劑、膠囊、丸劑和粒劑，均可任選地經(jīng)過涂層和外殼的修整或制備，諸如藥物配制領(lǐng)域熟知的腸溶衣及其它涂層。也可采用，例如羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球體對(duì)上述劑型進(jìn)行配制，使其所含有效成分得以緩釋或控釋，其中采用羥丙基甲基纖維素時(shí)，可使其比例變化，從而獲得要求的釋放分布圖。上述劑型可通過下述方法得以滅菌，例如通過擋菌濾器進(jìn)行過濾，或通過加入無(wú)菌固體組合物形式的滅菌劑，并在使用前立即溶解于無(wú)菌水或其它無(wú)菌注射介質(zhì)中。上述組合物也可任選地含有乳濁劑，并可屬于這樣一種組合物，即其僅僅釋放有效成分，或優(yōu)先在胃腸道的特定部位中，可選地以延遲方式釋放有效成分。可采用的包埋組合物實(shí)例包括聚合物和蠟。有效成分也可為微膠囊形式，如適當(dāng)，可采用一種或多種上述賦形劑以形成該微膠囊。
本發(fā)明化合物適用于口服的液體劑型包括藥學(xué)可接受乳劑、微乳劑、溶液、懸液、糖漿和酏劑。除了有效成分外，液體劑型還可含有本領(lǐng)域通用的惰性稀釋劑，諸如，例如水或其它溶劑、加溶劑和乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油類(尤其是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄欖、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氫基呋喃醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，及它們的混合物。
除了惰性稀釋劑以外，口服組合物還可包括佐劑，諸如潤(rùn)濕劑、乳化劑和助懸劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、加香劑和防腐劑。
除了有效化合物以外，懸液還可含有助懸劑，諸如，乙氧基化的異十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨聚糖酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、皂土、瓊脂和西黃蓍膠，及它們的混合物。
本發(fā)明藥物組合物適用于直腸或陰道給藥的配方可為栓劑形式，可通過將本發(fā)明的一種或多種化合物與一種或多種合適的無(wú)刺激性賦形劑或載體混合而得以制備，合適的無(wú)刺激性賦形劑或載體包括，例如可可油、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸酯，且該栓劑室溫下為固體，體溫下則為液體，因此可在直腸或陰道腔內(nèi)融化并釋放藥劑。
本發(fā)明適用于陰道給藥的配方還包括含有本領(lǐng)域已知適用的載體的陰道栓劑、棉塞、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧配方。
本發(fā)明化合物適用于體表或經(jīng)皮給藥的劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、溶液、膜片和吸入劑。該活性化合物可在無(wú)菌條件下與藥學(xué)可接受載體混合，也可能需要混合任意防腐劑、緩沖劑或推進(jìn)劑。
上述軟膏、糊劑、乳膏和凝膠除含有本發(fā)明的活性化合物以外，還可含有賦形劑，諸如動(dòng)物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、皂土、硅酸、滑石和氧化鋅，或它們的混合物。
粉劑和噴霧劑除含有本發(fā)明化合物以外，還可含有賦形劑，諸如乳糖、滑石、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末，或它們的混合物。噴霧劑可另外含有通用的推進(jìn)劑，諸如含氯氟烴，和揮發(fā)性未被取代的烴，諸如丁烷和丙烷。
經(jīng)皮藥貼具有另一個(gè)優(yōu)勢(shì)，即可提供本發(fā)明化合物到肌體的受控送遞。這種劑型可通過將藥劑溶解或分散于合適介質(zhì)中而得以制備。也可采用吸收增強(qiáng)劑以提高藥劑跨越皮膚的通量。該通量的速率可通過采用速度控制膜或?qū)⒒衔锓稚⒃诰酆衔锘|(zhì)或凝膠中而得到控制。
眼科配方，眼部軟膏、粉劑、溶液等也被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范疇。
本發(fā)明適用于腸胃外給藥的藥物組合物包括本發(fā)明的一種或多種化合物，還組合了一種或多種藥學(xué)可接受的無(wú)菌等滲水性或非水性溶液、分散體、懸液或乳劑，或可于使用前在無(wú)菌可注射溶液或分散體中重構(gòu)的無(wú)菌粉劑，該藥物組合物可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑，以及可使配方與預(yù)期受體血液等滲的溶質(zhì)或懸浮劑或增稠劑。
可應(yīng)用于本發(fā)明藥物組合物中的合適水性和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及它們合適的混合物，還包括植物油，諸如橄欖油，以及可注射有機(jī)酯，諸如油酸乙酯。通過例如，利用涂料，諸如卵磷脂，或通過在分散體情況中維持必需的粒度，以及通過利用表面活性劑，均可維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。
上述組合物也可含有佐劑，諸如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑。通過包含多種抗菌劑和抗真菌劑，例如對(duì)羥苯甲酸、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可確保預(yù)防微生物的作用。將等滲劑，諸如糖類、氯化鈉等包括在該組合物中也是理想的。另外，通過包含可延遲吸收的物質(zhì)，諸如單硬脂酸鋁和明膠，便可延長(zhǎng)可注射藥物形式的吸收。
在某些情況中，為延長(zhǎng)藥效，減緩皮下或肌內(nèi)注射藥劑的吸收是理想的?？赏ㄟ^利用具有弱水溶性的結(jié)晶或無(wú)定形材料的液體懸液而實(shí)現(xiàn)吸收減緩。藥劑的吸收率則取決于其溶解速率，反過來可能取決于結(jié)晶粒度和晶形?？蛇x地，延遲腸胃外施用藥劑的吸收可通過使藥劑溶解或懸浮于油性媒介物中而得以實(shí)現(xiàn)。
通過使本發(fā)明化合物在生物可降解聚合物，諸如聚丙交酯-聚乙交酯中形成微膠囊基質(zhì)，可制備成可注射的貯存形式。根據(jù)藥劑與聚合物的比例，以及所應(yīng)用特定聚合物的性質(zhì)，可控制藥劑釋放速率。其它生物可降解聚合物實(shí)例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。貯存可注射配方也可通過將藥劑包入脂質(zhì)體或與肌體組織相容的微乳劑中而得以制備。
當(dāng)將本發(fā)明化合物作為藥物施用于人和動(dòng)物時(shí)，可施用該化合物本身，或者以藥物組合物形式施用，該藥物組合物除含有例如，0.1～99.5％(更為優(yōu)選的是0.5～90％)有效成分，并組合了一種藥學(xué)可接受載體。
除了上述組合物，還可由含有適當(dāng)量治療劑的掩蔽物，諸如石膏、繃帶、敷料劑、紗布等組成應(yīng)用。如上文所具體描述的，治療性組合物可存在于支架、裝置、假體和植入物上，從而一起被施用/送遞。
實(shí)施例本發(fā)明現(xiàn)已得到一般性描述，通過參考下述實(shí)施例可更輕松地理解本發(fā)明，將下述實(shí)施例包括在內(nèi)僅為例證本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案，對(duì)本發(fā)明并不構(gòu)成限制。
實(shí)施例1對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)被正或負(fù)調(diào)節(jié)的基因的鑒定該實(shí)施例描述了對(duì)若干基因的鑒定，其中與這些基因在正常被試者PBMCs中的表達(dá)相比，這些基因在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(R.A.)患者的外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中被正或負(fù)調(diào)節(jié)了。
如下從9名R..A.患者和13名正常志愿者體內(nèi)分離PMBCs。將8毫升血液吸入CPT Vacutainer管中，倒置若干次。將管置于旋翼式轉(zhuǎn)子中，以室溫、1500×g(2700rpm)離心。除去血清，并將PBMCs轉(zhuǎn)移進(jìn)15毫升圓錐形離心管中。通過加入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，并于450g(1200rpm)離心5分鐘，以洗滌細(xì)胞。拋棄上清液，并再次重復(fù)洗滌操作。除去上清液后，采用RNeasy微型試劑盒(Qiagen，Hidden，Germany)，并根據(jù)廠商的操作方法分離總RNA。
如下，在由6,800和12,000個(gè)人類基因(分別為AffymetrixHu6800和HgU95A芯片組)組成的寡核苷酸陣列上分析RNA。
如下制備用于雜交的目標(biāo)核酸。通過使PBMC來源的5pg總RNA和100pM T7/T24標(biāo)記的寡dt引物(在Genetics Institute，Cambridge，MA合成)于70℃變性10分鐘，并于冰上冷卻，從而制備獲得用于雜交的總RNA。cDNA第一鏈的合成在下述緩沖條件下進(jìn)行1×第一鏈緩沖劑(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)、10mM DTT(GIBCO/Invitrogen)、分別為500μM的各種dNTP(Invitrogen LifeTechnologies)、400單位Superscript RT II(Invitrogen LifeTechnologies)和40單位RNAase抑制劑(Ambion，Austin，TX)。反應(yīng)在47℃進(jìn)行1小時(shí)。通過添加終濃度如下的下列試劑合成cDNA第二鏈1X第二鏈緩沖劑(Invitrogen Life Technologies)、額外的分別為200μM的各種dNTP(Invitrogen Life Technologies)、40單位大腸桿菌DNA聚合酶I(Invitrogen Life Technologies)、2單位大腸桿菌RNAaseH(Invitrogen Life Technologies)和10單位大腸桿菌DNA連接酶。反應(yīng)在15.8℃進(jìn)行2小時(shí)，并在該反應(yīng)進(jìn)行的最后5分鐘內(nèi)加入6單位T4DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)。如下利用BioMag羧基終止粒子純化通過上述步驟獲得的雙鏈cDNA通過采用0.5M EDTA洗滌三次，以平衡0.2mg的BioMag粒子(Polysciences In.，Warrington，PA)，并將其重懸浮在0.5MEDTA中，濃度為22.2mg/ml。稀釋該雙鏈cDNA反應(yīng)物，至終濃度為10％PEG/1.25M NaCl，并加入珠懸液至最終珠濃度為0.614mg/ml。室溫溫育反應(yīng)10分鐘。采用300μl、70％乙醇洗滌cDNA/珠復(fù)合體，將乙醇除去后，風(fēng)干試管。通過加入pH7.8、20μl、10mM的Tris-乙酸洗脫cDNA，溫育2-5分鐘，并移出含cDNA的上清液。
隨后，將10μl已純化的雙鏈cDNA加入體外轉(zhuǎn)錄(IVT)溶液中，該溶液含有1×IVT緩沖劑(Ambion，Austin，TX)、5,000單位T7 RNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)、3mM GTP、1.5mMATP、1.2mM CTP和1.2mM UTP(Amersham/Pharmacia)、各為0.4mM的bio-16UTP和bio-11CTP(Enzo Diagnostics，F(xiàn)armingdale，NY)和80單位RNase抑制劑(Ambion，Austin，TX)。反應(yīng)于37℃進(jìn)行16小時(shí)。利用RNeasy(Qiagen)純化已標(biāo)記RNA。通過測(cè)定260nm處的吸光度可定量該RNA的產(chǎn)量。
如下進(jìn)行陣列雜交和熒光檢測(cè)。94℃條件下，在pH8.0、含有100mM乙酸鉀和30mM乙酸鎂、40mM的Tris-乙酸中溫育35分鐘，使12μg的IVT片段化。在雜交緩沖液中稀釋該片段化的標(biāo)記RNA探針，該雜交緩沖液所含最終組分為1×2-N嗎啉乙磺酸(MES(緩沖液(pH6.5)、50pM Bio948(可與探針陣列(Genetics Institute，Cambridge，MA)上的界標(biāo)特征雜交的對(duì)照生物素化寡體)、100μg/ml鯡魚精子DNA(Promega，Madison，WI)、500μg/ml乙?；疊SA(Invitrogen LifeTechnologies)和1μl/μg的標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑(由Gene Logic，Gaithersburg，MD提供的專利試劑)。45℃條件下，采用兩種玻璃珠(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)與上述雜交溶液預(yù)雜交過夜。將雜交溶液移至干凈試管中，95℃加熱1-2分鐘，并高速微離心2分鐘，使不溶性碎屑沉淀。采用非嚴(yán)格性洗滌緩沖液(0.9M NaCl、60mM磷酸鈉、6mM EDTA和0.01％Tween20)預(yù)先濕潤(rùn)Affymetrix寡核苷酸陣列盒(人6800陣列P/N900183和人U95A(Affymetrix，Santa Clara，CA))，并于45℃旋轉(zhuǎn)條件下溫育5-10分鐘。從Affymetrix盒移除緩沖液，并于45□、45-60rpm旋轉(zhuǎn)條件下，采用180μl雜交溶液與該陣列雜交過夜。溫育過夜后，除去雜交溶液，并在盒內(nèi)充滿非嚴(yán)格性洗滌緩沖液。采用Affymetrix射流狀態(tài)洗滌陣列盒，該狀態(tài)為25℃條件下，采用非嚴(yán)格性洗滌緩沖液進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的2次混合/循環(huán)，隨后采用嚴(yán)格性洗滌緩沖液(100mM MES、0.1M Na+、0.01％Tween20和0.005％消泡劑)進(jìn)行4個(gè)循環(huán)的15次混合/循環(huán)。隨后于25℃條件下，在SAPE溶液(100mM MES、1M Na+、0.05％Tween20、0.005％消泡劑、2mg/ml乙?；疊SA(Invitrogen Life Technologies)，和10μg/mlR藻紅蛋白鏈霉抗生物素蛋白(Molecular Probes，Eugene，OR))中，對(duì)探針陣列進(jìn)行第一次染色10分鐘。第一次染色后，于25℃條件下，采用非嚴(yán)格性洗滌緩沖液進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的4次混合/循環(huán)，洗滌探針陣列。隨后，于25℃條件下，在抗體溶液(100mM MES、1M Na+、0.05％Tween20、0.005％消泡劑、2mg/ml乙?；疊SA(Invitrogen LifeTechnologies)、100μg/ml山羊I gG(SIGMA，St.Louis，MO)和3μg/ml生物素化抗鏈霉生物素蛋白抗體(山羊)(VectorLaboratories))中，對(duì)探針陣列染色10分鐘。在第二次染色后，于25℃，在SAPS溶液中，對(duì)探針陣列再次染色10分鐘。最后，于30℃，采用非嚴(yán)格性洗滌緩沖液進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的4次混合/循環(huán)，洗滌探針陣列。采用Affymetrix基因芯片掃描儀(Affymetrix，Santa Clara，CA)掃描陣列。該掃描儀含有掃描共焦顯微鏡，采用了氬離子激光器作為激發(fā)源，并通過530nm帶通濾波器(熒光素0或560長(zhǎng)通濾波器(藻紅蛋白))的光電倍增管檢測(cè)發(fā)射。
利用GENECHIP 3.0或4.0軟件，并對(duì)內(nèi)部對(duì)照進(jìn)行歸一化/標(biāo)度，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)每一患者而言，采用了兩個(gè)參數(shù)過濾數(shù)據(jù)1)“絕對(duì)判定(Absolute Decision)”，可指出特定RNA樣品內(nèi)某一基因RNA的存在(P)或缺乏(A)；2)“頻率”，可測(cè)定RNA樣品內(nèi)特定RNA的拷貝數(shù)量，且該數(shù)值被表示為拷貝數(shù)與一百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的比例。如基因被認(rèn)為“缺乏”，其頻率不被用于計(jì)算該基因的平均頻率。如果在Hu6800數(shù)據(jù)中，對(duì)4個(gè)以上的患者而言；或在HgU95A數(shù)據(jù)中，對(duì)2個(gè)以上的患者，或6個(gè)以上的正常研究對(duì)象而言，基因均被認(rèn)為“缺乏”，便不計(jì)算平均頻率。僅對(duì)正常志愿者而言具有平均頻率的基因被標(biāo)記為“正?！?，而僅對(duì)患者而言具有平均頻率的基因被標(biāo)記為“疾病”。通過用正常志愿者的平均基因頻率除患者的平均基因頻率，可計(jì)算基因表達(dá)中的倍數(shù)變化。被選定用于分析的基因符合下述標(biāo)準(zhǔn)1)倍數(shù)變化大于1.95或小于-1.95，以及2)這些基因被標(biāo)記為“正常”或“疾病”。
尤應(yīng)指出的是，RAGE配體S100a9和S100a12在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的細(xì)胞中均被過度表達(dá)。
實(shí)施例2對(duì)在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型中被正或負(fù)調(diào)節(jié)的基因的鑒定該實(shí)施例描述了對(duì)若干基因的鑒定，其中與正常小鼠相比，該基因在患有膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的小鼠(CIA)體內(nèi)被正或負(fù)調(diào)節(jié)了。基因表達(dá)在小鼠爪部、PBMCs和滑膜中測(cè)定。
CIA是被公認(rèn)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。如下在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)該疾病。采用雄性DBA/I(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine)小鼠進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。利用雞II型膠原(Sigma，St.Louis，MO)或牛II型膠原(Chondrex，Redmond，WA)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。將雞膠原溶解于0.01M乙酸中，并采用等體積的完全弗氏佐劑(CFA；Difco Labs，Detroit，MI)將其乳化，該完全弗氏佐劑含有1mg/ml結(jié)核桿菌(菌株H37RA)。第0天，將200μg雞膠原皮內(nèi)注射進(jìn)小鼠尾根處。第21天，對(duì)小鼠腹膜內(nèi)注射含有100μg雞II型膠原的PBS溶液。將牛II型膠原(Chondrex，Redmond，WA)溶解于0.1M乙酸中，并采用含有1mg/ml結(jié)核桿菌(菌株H 37RA)的等體積CFA(Sigma)將其乳化。第0天，將200μg牛膠原皮下注射進(jìn)小鼠尾根處。第21天，對(duì)小鼠尾根處皮下注射一種溶液，該溶液由含200μg牛膠原的0.1M乙酸與等體積不完全弗氏佐劑(Sigma)混合而成。使首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物接受相同的注射方案，但不含膠原。監(jiān)控小鼠的疾病進(jìn)展，一周至少三次。根據(jù)指數(shù)0＝正常；P＝關(guān)節(jié)炎前期，特征為趾尖上的病灶紅斑；1＝可見紅斑，伴隨以1-2個(gè)腫脹爪趾；2＝顯著紅斑，特征為爪部腫脹和/或多個(gè)爪趾腫脹；3＝延伸至踝或腕關(guān)節(jié)處的大量腫脹；4＝難以活動(dòng)僵硬的肢體或關(guān)節(jié)，對(duì)個(gè)體小鼠的肢體進(jìn)行臨床評(píng)分。對(duì)任意特定小鼠的全部肢體評(píng)分的總和可獲得的最大總體評(píng)分為16。
在疾病的不同階段，使動(dòng)物安樂死，并收獲組織。在一組實(shí)施例中，將每只動(dòng)物的至少兩只爪瞬間冷凍于液氮中，以用于RNA分析。利用研缽、研棒和液氮，將冷凍的小鼠爪磨成細(xì)粉。采用PromegaRNAgents總RNA分離系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)純化RNA。采用RNeasy微型試劑盒進(jìn)一步純化RNA。將其余的爪固定在組織學(xué)所用的10％福爾馬林中。
在另一組實(shí)施例中，在小鼠PBMC中測(cè)定基因表達(dá)。通過心臟穿刺，將血液收集進(jìn)EDTA包被的收集管中。根據(jù)相近的總體評(píng)分(正常、關(guān)節(jié)炎前期，評(píng)分為1、3、4、5、6和7-9)，將血樣混合進(jìn)15ml圓錐形管中。采用PBS以1∶1稀釋血樣，該P(yáng)BS含有2mM EDTA，并在等體積Lympholyte-M(Cedar Lane Labs，Hornby，Ontario，Canada)上形成分層。在Sorvall離心機(jī)(型號(hào)為RT6000D)中，以1850rpm無(wú)制動(dòng)離心混合物20分鐘。收集界面上的細(xì)胞，將其加入新試管中。通過加入10ml含有2mM EDTA的PBS洗滌細(xì)胞，并于1200rpm離心10分鐘。重復(fù)該洗滌2次。溶解殘留紅細(xì)胞，并將細(xì)胞沉淀分散在2ml冷0.2％NaCl中，于冰上溫育45-60秒。通過加入2ml的1.6％NaCl終止溶解，并于1200rpm離心細(xì)胞10分鐘。將PBMC重懸浮于5ml含有2mM EDTA的PBS中，并記數(shù)。于1200rpm離心細(xì)胞10分鐘，從用于RNA分離的制備物中拋棄上清液。采用RNeasy微型試劑盒(Qiagen，Hidden，Germany)從PBMC中分離總RNA。
還有另一組實(shí)施例，從分離自患病動(dòng)物的滑膜中獲得RNA。在解剖顯微鏡下，從患病和對(duì)照動(dòng)物體內(nèi)解剖獲得關(guān)節(jié)滑膜。將從具有相近疾病評(píng)分的5只或5只以上動(dòng)物體內(nèi)獲得的組織混合，并采用RNeasy試劑盒(Qiagen，Hidden，Germany)分離RNA。
在寡核苷酸陣列Affymetrix鼠IIK芯片組上分析基因表達(dá)，其中Affymetrix鼠IIK芯片組由兩種芯片上的11,000個(gè)鼠基因組成，這兩種芯片分別為鼠11KsubA P/N900188和鼠11KsubB P/N900189。
如上述實(shí)施例，采用來源自爪部或滑膜組織的5μg PBMC RNA或7μg RNA，制備可被用于與上述芯片雜交的已標(biāo)記目標(biāo)核酸。
利用GENECHIP 3.0軟件，并對(duì)內(nèi)部對(duì)照進(jìn)行歸一化/標(biāo)度，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在雙文本分析中，將各實(shí)驗(yàn)樣本與時(shí)間匹配的對(duì)照樣本作比較。接著將數(shù)據(jù)輸入GeneSpring(Silicon Genetics，Redwood City，CA)分析程序中。以分級(jí)方式過濾數(shù)據(jù)。首先，根據(jù)爪部評(píng)分將數(shù)據(jù)分組。針對(duì)每一個(gè)評(píng)分創(chuàng)建一個(gè)基因列表，這些基因被認(rèn)為“存在”于特定評(píng)分組和對(duì)照組中的所有樣本中。通過將所有被認(rèn)為在各評(píng)分組至少半數(shù)以上的樣本中未“增加”或“減少”(在程序中的定義)的基因剔除，可進(jìn)一步精確化上述列表。隨后對(duì)上述列表進(jìn)行過濾，以獲得在少于5個(gè)樣本的所有樣本中，或在超過70％的樣本中顯示倍數(shù)變化大于或等于1.95，或者小于或等于-1.95的基因。
尤應(yīng)指出的是，被認(rèn)為是RAGE配體的Saa3蛋白在關(guān)節(jié)炎患鼠來源的PBMC中被過度表達(dá)了。
實(shí)施例3對(duì)鼠可溶性RAGE-Fc的生化評(píng)估(a)RAGE配體S100B的生物素化將S100B(Sigma，St.Louis，MO)溶解在N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[3-丙磺酸](EPPS；Sigma，St.Louis，MO)緩沖液中，終濃度為50μM。該EPPS緩沖液由25mM EPPS、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2組成，pH＝7.5。將生物素(EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-biotin；Pierce，Rockford，IL)加入該S100B溶液中，其終濃度為250mM，室溫放置30分鐘。當(dāng)于4℃條件下，利用截留分子量為3,500道爾頓的Slide-A-LyzerTM透析組件(Pierce，Rockford，IL)，并采用磷酸鹽緩沖鹽水透析該溶液時(shí)，便可終止生物素化反應(yīng)。透析結(jié)束后，利用BioRad Protein Assay(Bio-Rad，Hercules，CA)測(cè)定S100B蛋白的濃度。
(b)鼠RAGE-LBE-Fc蛋白的制備采用HeLa細(xì)胞表達(dá)RAGE-LBE-Fc蛋白，并將其分泌在細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞在含有10％胎牛血清(FBS)的Dul becco改良細(xì)胞培養(yǎng)基(DME)中生長(zhǎng)至80％鋪滿。除去培養(yǎng)基，并更換為含有2％FBS和Ad-RAGE-LBE-Fc或Ad-GFP的DME，其中Ad-RAGE-LBE-Fc或Ad-GFP的濃度大約為每個(gè)細(xì)胞含10,000個(gè)病毒顆粒。37℃溫育2小時(shí)后，將另一份含10％FBS的DME加至細(xì)胞單層，溫育26小時(shí)。收集條件培養(yǎng)基，進(jìn)行離心，以除去細(xì)胞碎屑。將抑肽酶(17μg/ml)加入該條件培養(yǎng)基中，并隨后保存于約80℃。利用Fc特異性ELISA測(cè)定條件培養(yǎng)基中的RAGE-LBE-Fc濃度約為6μg/ml。
(c)對(duì)RAGE-LBE-FcS100B結(jié)合的評(píng)估將生物素化的S100B蛋白(0.3-3μM)加至200μL條件培養(yǎng)基中，如上所述，該條件培養(yǎng)基來自經(jīng)由Ad-RAGE-LBE-Fc或Ad-GFP感染的HeLa細(xì)胞。通過加入EPPS緩沖液，使反應(yīng)體積升至0.3mL，并將其在室溫下溫育1.5小時(shí)。應(yīng)指出的是，某些反應(yīng)含有45μM高速游動(dòng)族蛋白1(HMG-1)或未標(biāo)記的S100B蛋白(Sigma，St.Louis，MO)。加入交聯(lián)試劑雙[硫代琥珀酰亞胺基]辛二酸酯(BS3；Pierce，Rockford，IL)，終濃度為標(biāo)示的5mM，并于室溫另外溫育反應(yīng)物45分鐘。通過加入Tris(Sigma，St.Louis，MO)至終濃度200mM，以終止交聯(lián)。加入A蛋白瓊脂糖CL-4B(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，并置于室溫下1.5小時(shí)，使RAGE-LBE-Fc從溶液中沉淀出來。采用pH＝7.5，由50mM Tris、150mM NaCl、0.05％Tween-20組成的洗滌緩沖液(TBST)，每次1ml，對(duì)瓊脂糖沉淀洗滌5次。通過加入含有200mM二硫蘇糖醇(Sigma，St.Louis，MO)和4M尿素(Sigma，St.Louis，MO)的4X NuPageTM LDS樣品緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，使瓊脂糖釋放其捕獲的蛋白。利用4-12％梯度凝膠(NuPageTMBis-iris；Invitrogen，Carlsbad，CA)，并通過SDS-PAGE，解析蛋白質(zhì)，并利用轉(zhuǎn)移槽裝置(Hoefer Scientific，San Francisco，CA)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝化纖維素上。采用含有5％脫脂奶粉(NFDM)的TBST封閉硝化纖維素，并在含有5％NFDM的TBST中，采用1∶10,000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(ImmunoPureStreptavidin-HRP；Pierce，Rockford，IL)，對(duì)該硝化纖維素進(jìn)行探測(cè)。利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液(Western Lightning，Perkin ElmerLife Sciences，Boston，MA)檢測(cè)鏈霉抗生物素蛋白-HRP生物素復(fù)合體。
由代表性免疫印跡獲得的結(jié)果如圖6所示。＞176千道爾頓的條帶(泳道4-8)與被交聯(lián)至sRAGE-Fc的生物素化S100B對(duì)應(yīng)。當(dāng)對(duì)來自Ad-GFP感染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(泳道1和2)進(jìn)行評(píng)估時(shí)，未出現(xiàn)該條帶。另外，當(dāng)不添加交聯(lián)劑BS3時(shí)，RAGE-LBE-Fc條件培養(yǎng)基中也未出現(xiàn)該條帶。存在BS3時(shí)，S100B-生物素與RAGE-LBE-Fc以濃度依賴方式結(jié)合(泳道4-6)。但存在過量HMB-1(另一種RAGE配體)和未標(biāo)記的S100B時(shí)，該相互作用受到抑制(泳道7和8分別與泳道5作比較)。綜合起來，上述結(jié)果證實(shí)Ad-RAGE-LBE-Fc表達(dá)載體編碼可與溶液中的RAGE配體結(jié)合的可分泌RAGE-Fc。
實(shí)施例4對(duì)可于CIA患鼠體內(nèi)表達(dá)mRAGE mRNA的細(xì)胞的鑒定該實(shí)施例描述了對(duì)一種細(xì)胞的鑒定，該細(xì)胞可于CIA患鼠體內(nèi)表達(dá)mRAGE基因。
如實(shí)施例2所描述方法，誘導(dǎo)小鼠爪部的CIA，并在將對(duì)照小鼠爪部固定在4％多聚甲醛中24小時(shí)后，采用EDTA將其脫鈣。對(duì)組織進(jìn)行修剪、加工、石蠟包埋，并制成5μm切片用于原位雜交。原位雜交方法與實(shí)施例3所描述方法相同。如下制備與mRAGE對(duì)應(yīng)的有義和反義探針。
通過從相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中生成2種獨(dú)立的PCR產(chǎn)物，獲得反-有義鼠RAGE和有義鼠RAGE核糖核酸探針。寡核苷酸5′-GACTGATAATACGACTCACT ATAGGGCGAATGCCAGCGGG GACAGCAGCTAGAG-3′(SEQ IDNO29)和5′-AGAGGCAGGA TCCACAATTT CTGGCTTCCC AGGAAT-3′(SEQID NO30)被用于生成鼠RAGE有義探針，5′-GACTGATAAT ACGACTCACTATAGGGCGAA GAGGCAGGAT CCACAATTTC TGGCTT-3′(SEQ ID NO31)和5′ATGCCAGCGG GGACAGCAGC TAGAGCCTGG GTGCTGGTT-3′(SEQ IDNO32)則被用于生成鼠RAGE反義探針。
PCR擴(kuò)增后，采用T7RNA聚合酶和體外轉(zhuǎn)錄，生成探針。將T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)整合進(jìn)上述寡核苷酸中，以插入T7結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)被插入在與有義核糖核酸探針對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物的5′末端，或者在與反義核糖核酸探針對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物的3′末端。采用DIG RNA標(biāo)記混合物(Roche Diagnostics，Mannheirn，Germany)，并根據(jù)廠商描述的方法，結(jié)合采用T7RNA聚合酶(Roche Diagnostics)，以制備洋地黃毒苷標(biāo)記探針。
如實(shí)施例3所述方法，以洋地黃毒苷標(biāo)記該探針。采用抗洋地黃毒苷抗體與辣根過氧化物酶偶聯(lián)形成的復(fù)合物(Roche)檢測(cè)標(biāo)記探針2小時(shí)，其中上述復(fù)合物已被2％正常綿羊血清/0.1％Triton X-100以1∶50稀釋。采用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(Vector Laboratory，Buflingame，CA)使標(biāo)記探針顯影15分鐘，在水中洗滌，并由Mayers蘇木精(Sigma，St.Louis，MO)短暫染色，通過逐級(jí)乙醇脫水，將其脫水至二甲苯中，并在顯微檢驗(yàn)前將其封固在DPX封固劑中。
雜交結(jié)果如表I所示。針對(duì)每一份經(jīng)由mRAGE染色的組織，檢測(cè)是否存在特異性染色。在mRAGE的情況中，當(dāng)檢測(cè)到特異性染色時(shí)，可將反應(yīng)性的強(qiáng)度定級(jí)為輕度、中度和重度。當(dāng)細(xì)胞具有褐色粒狀胞質(zhì)著色(DAB色原)，且陽(yáng)性和陰性對(duì)照切片具有足夠反應(yīng)性時(shí)，陽(yáng)性染色被認(rèn)為是特異性的。在該研究中，有義對(duì)照切片(陰性對(duì)照)是針對(duì)每一份經(jīng)由mRAGE染色的組織制備的。
表I對(duì)CIA患鼠關(guān)節(jié)炎爪和對(duì)照爪中mRAGE mRNA陽(yáng)性細(xì)胞的原位雜交評(píng)估
P代表具有不同陽(yáng)性度水平的胞質(zhì)陽(yáng)性度，P1被定義為輕度陽(yáng)性，P2為中度陽(yáng)性，P3為重度陽(yáng)性。
在患有誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的小鼠爪部，被鑒定為mRAGE陽(yáng)性的細(xì)胞為巨噬細(xì)胞、活化的成骨細(xì)胞、成熟和未成熟成纖維細(xì)胞、活化的軟骨細(xì)胞、具有濾泡和皮脂腺的表皮，以及動(dòng)脈平滑肌。
具有濾泡和皮脂腺的表皮、成熟成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞在患有和不患有關(guān)節(jié)炎的爪部均為陽(yáng)性。
實(shí)施例5RAGE-LBE融合蛋白的施用緩解了小鼠體內(nèi)的CIA該實(shí)施例顯示對(duì)CIA患鼠施用可溶性RAGE后，顯著緩解了該疾病，其作用與可溶性腫瘤壞死因子受體II(TNFRII)Fc融合蛋白相似。
通過PCR從患有膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的DBA/1小鼠爪部分離鼠RAGE。將該鼠RAGE從1位ATG到1029位的編碼區(qū)融合至鼠IgG2a突變Fc。通過將mRAGE-IG2a_Fc序列(SEQ ID NO37和具有SEQ ID NO38的編碼蛋白；也可參見圖1)克隆進(jìn)由EcoRI和NotI消化的腺病毒載體Adori1-2中，衍生出Adoril-1mRAGE_Fc。通過PCR從DBA/1小鼠的CIA患爪中分離鼠TNFRII中1-774的胞外域，并將其融合至鼠IgG2a突變Fc。將含有與鼠IgG2a突變Fc(SEQ ID NO39和具有SEQID NO40的編碼蛋白；也可參見圖2)融合的小鼠TNFRII胞外部分的cDNA克隆進(jìn)Adori1-2中的EcoRI和Not1位點(diǎn)，所獲質(zhì)粒被稱為Adori1-2 msolTNFRII_Fc。AdoriI-1空載體不含有該插入部分。通過廣泛限制消化分析和對(duì)上述質(zhì)粒內(nèi)cDNA插入部分的測(cè)序，可驗(yàn)證所有構(gòu)建體。所有上述cDNAs的表達(dá)均由巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子和增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)。
通過在人胚胎腎細(xì)胞系293中進(jìn)行同源重組，可生成具有或不具有RAGE-IgG2a_Fc或sTNFRII-IgG2a_Fc(也被稱為“sTNFRII_Fc”和“mso1TNFRII_Fc”)的Ad5E1a缺失(d1327)重組腺病毒，即Ad-RAGE_Fc和Ad-msTNFRII_Fc(可應(yīng)用于CIA模型的載體)，其中上述Ad5 Ela缺失(d1327)重組腺病毒被稱為Ad-空載體。分離重組腺病毒，并在293細(xì)胞上擴(kuò)增。通過3個(gè)循環(huán)的冷凍解凍，該病毒從感染的293細(xì)胞中被釋放出來。通過2次氯化銫梯度離心，并于4℃，采用pH7.2的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)對(duì)其進(jìn)行透析，可進(jìn)一步純化該病毒。透析后，加入甘油至10％濃度，使用前一直將病毒保存于-80℃。通過轉(zhuǎn)基因的表達(dá)、293細(xì)胞上的空斑形成單位、顆粒/毫升、內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果、對(duì)該病毒的PCR分析結(jié)果，以及對(duì)該病毒編碼區(qū)的序列分析結(jié)果，表征上述病毒。
該實(shí)施例檢驗(yàn)了可溶性mRAGE-Fc改善膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)患鼠模型體內(nèi)癥狀的能力。采用雄性DBA/I小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine)進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。利用牛II型膠原(Chondrex，Redmond，WA)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。將牛II型膠原溶解在0.1M乙酸中，并采用等體積CFA(Sigma)將其乳化，該CFA含有1mg/ml結(jié)核桿菌(菌株H37RA)。第0天，將100μg牛膠原皮下注射進(jìn)小鼠尾根處。第21天，對(duì)小鼠尾根處皮下注射一種溶液，該溶液由含100μg牛膠原的0.1M乙酸與等體積不完全弗氏佐劑(Sigma，St.Louis，MO)混合而成。第20天，小鼠靜脈內(nèi)接受劑量均為5×1010個(gè)顆粒的空病毒顆粒、msolTNFRIII_Fc或mRAGE-LBE-Fc。
監(jiān)控小鼠的疾病進(jìn)展，一周至少三次。根據(jù)指數(shù)0＝正常；P＝關(guān)節(jié)炎前期，特征為趾尖上的病灶紅斑；1＝可見紅斑，并伴以1-2個(gè)爪趾的腫脹；2＝顯著紅斑，特征為爪部腫脹和/或多個(gè)爪趾腫脹；3＝延伸至踝或腕關(guān)節(jié)處的大量腫脹；4＝難以活動(dòng)僵硬的肢體或關(guān)節(jié)，對(duì)個(gè)體小鼠的肢體進(jìn)行臨床評(píng)分。對(duì)任意特定小鼠的全部肢體評(píng)分的總和可獲得最大總體評(píng)分為16。
如圖4所示的結(jié)果顯示RAGE-LBE融合蛋白的施用將總體評(píng)分保持得非常低，說明RAGE-LBE融合蛋白的施用顯著緩解并預(yù)防了CIA。
實(shí)施例6穩(wěn)定表達(dá)并分泌RAGE-LBE-Fc蛋白的細(xì)胞系對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞進(jìn)行工程改造，使其表達(dá)鼠和人RAGE-LBE-Fc蛋白。將該鼠和人RAGE-LBE-Fc克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，線型化，并采用lipofectin方法將其轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO細(xì)胞中(Kaufman，R.J.(1990)Methods in Enzymology 185537-66；Kaufman，R.J.(1990)Methods in Enzymology 185487-511；Pittman，D.D.et al.(1993)，Methodsin Enzymology 222236)。在20nM和50nM氨甲蝶呤中進(jìn)一步選擇細(xì)胞，并從單個(gè)克隆中收獲條件培養(yǎng)基，通過SDS十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡對(duì)其進(jìn)行分析，以證實(shí)表達(dá)。
培養(yǎng)可表達(dá)人和鼠RAGE-LBE-Fc的CHO細(xì)胞，并收獲條件培養(yǎng)基用于蛋白質(zhì)純化。采用標(biāo)準(zhǔn)方法純化蛋白。對(duì)已純化蛋白進(jìn)行還原和非還原SDS-PAGE，并通過考馬斯藍(lán)染色(Current Protocols inProtein Sciences Wiley Interscience)目測(cè)蛋白。所獲分析結(jié)果顯示純化蛋白具有預(yù)期的分子量。
作為參考引入此處所提及的所有出版物和專利均被完整引入作為參考，如同每一單獨(dú)出版物或?qū)＠惶囟ú为?dú)指出將被引入作為參考。如果存在矛盾，包括此處所述任何定義在內(nèi)的本申請(qǐng)將起主導(dǎo)作用。
等同方案雖然本文論述了本發(fā)明的若干特定實(shí)施方案，但上述說明僅具有例證性，不具有限制性。根據(jù)本說明書和下列權(quán)利要求的論述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解本發(fā)明的許多變化。通過參考權(quán)利要求及其完整范疇的等同方案，和本說明書及其變化，便可確定本發(fā)明的完整范疇。
序列表<110>WvethPittman，Debra D.
Clancy，BrianLarsen，GlennTrepicchio，William L.
Brennan，F(xiàn)ionula MaryFeldman，MarcFoxwell，Brian John MauriceFeldman，Jeffrey L.
<120>用于治療RAGE相關(guān)病癥的組合物和方法<130>WYTH-PW0-002<140>PCT/US03/25996<141>2003-08-18<150>60/404,205<151>2002-08-16<160>13<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>2057<212>DNA<213>鼠可溶性RAGE_FC<400>1atgccagcgg ggacagcagc tagagcctgg gtgctggttc ttgctctatg gggagctgta 60gctggtggtc agaacatcac agcccggatt ggagagccac ttgtgctaag ctgtaagggg120gcccctaaga agccgcccca gcagctagaa tggaaactga acacaggaag aactgaagct180tggaaggtcc tctctcccca gggaggcccc tgggacagcg tggctcaaat cctccccaat240ggttccctcc tccttccagc cactggaatt gtcgatgagg ggacgttccg gtgtcgggca300actaacaggc gagggaagga ggtcaagtcc aactaccgag tccgagtcta ccagattcct360gggaagccag aaattgtgga tcctgcctct gaactcacag ccagtgtccc taataaggtg420gggacatgtg tgtctgaggg aagctaccct gcagggaccc ttagctggca cttagatggg480
aaacttctga ttcccgatgg caaagaaaca ctcgtgaagg aagagaccag gagacaccct 540gagacgggac tctttacact gcggtcagag ctgacagtga tccccaccca aggaggaacc 600acccatccta ccttctcctg cagtttcagc ctgggccttc cccggcgcag acccctgaac 660acagccccta tccaactccg agtcagggag cctgggcctc cagagggcat tcagctgttg 720gttgagcctg aaggtggaat agtcgctcct ggtgggactg tgaccttgac ctgtgccatc 780tctgcccagc cccctcctca ggtccactgg ataaaggatg gtgcaccctt gcccctggct 840cccagccctg tgctgctcct ccctgaggtg gggcacgcgg atgagggcac ctatagctgc 900gtggccaccc accctagcca cggacctcag gaaagccctc ctgtcagcat cagggtcaca 960gaaaccggcg atgaggggcc agctgaaggc tctgtgggtg agtctgggct gggtacgcta1020gccctggccg agccccgcgg accgacaatc aagccctgtc ctccatgcaa atgcccaggt1080aagtcactag accagagctc cactcccggg agaatggtaa gtgctataaa catccctgca1140ctagaggata agccatgtca agatccattt ccatctctcc tcatcagcac ctaacctcga1200gggtggacca tccgtcttca tcttccctcc aaagatcaag gatgtactca tgatctccct1260gagccccata gtcacatgtg tggtggtgga tgtgagcgag gatgacccag atgtccagat1320cagctggttt gtgaacaacg tggaagtaca cacagctcag acacaaaccc atagagagga1380ttacaacagt actctccggg tggtcagtgc cctccccatc cagcaccagg actggatgag1440tggcaaggct ttcgcatgcg ccgtcaacaa caaagacctc ccagcgccca tcgagagaac1500catctcaaaa cccaaaggtg agagctgcag cctgactgca tgggggctgg gatgggcata1560aggataaagg tctgtgtgga cagccttctg cttcagccat gacctttgtg tatgtttcta1620ccctcacagg gtcagtaaga gctccacagg tatatgtctt gcctccacca gaagaagaga1680tgactaagaa acaggtcact ctgacctgca tggtcacaga cttcatgcct gaagacattt1740acgtggagtg gaccaacaac gggaaaacag agctaaacta caagaacact gaaccagtcc1800tggactctga tggttcttac ttcatgtaca gcaagctgag agtggaaaag aagaactggg1860tggaaagaaa tagctactcc tgttcagtgg tccacgaggg tctgcacaat caccacacga1920
ctaagagctt ctcccggact ccgggtaaat gagctcagca cccacaaaac tctcaggtcc 1980aaagagacac ccacactcat ctccatgctt cccttgtata aataaagcac ccagcaatgc 2040ctgggaccat gtaatag 2057<210>2<211>343<212>PRT<213>鼠可溶性RAGE_FC<400>2Met Pro Ala Gly Thr Ala Ala Arg Ala Trp Val Leu Val Leu Ala Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Ala Gly Gly Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Ser Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Gln35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Gln Ile Leu Pro Asn65 70 75 80Gly Ser Leu Leu Leu Pro Ala Thr Gly Ile Val Asp Glu Gly Thr Phe85 90 95Arg Cys Arg Ala Thr Asn Arg Arg Gly Lys Glu Val Lys Ser Asn Tyr100 105 110Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Pro115 120 125Ala Ser Glu Leu Thr Ala Ser Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val130 135 140
Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly145 150 155 160Lys Leu Leu Ile Pro Asp Gly Lys Glu Thr Leu Val Lys Glu Glu Thr165 170 175Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr180 185 190Val Ile Pro Thr Gln Gly Gly Thr Thr His Pro Thr Phe Ser Cys Ser195 200 205Phe Ser Leu Gly Leu Pro Arg Arg Arg Pro Leu Asn Thr Ala Pro Ile210 215 220Gln Leu Arg Val Arg Glu Pro Gly Pro Pro Glu Gly Ile Gln Leu Leu225 230 235 240Val Glu Pro Glu Gly Gly Ile Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu245 250 255Thr Cys Ala Ile Ser Ala Gln Pro Pro Pro Gln Val His Trp Ile Lys260 265 270Asp Gly Ala Pro Leu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Leu Leu Leu Pro275 280 285Glu Val Gly His Ala Asp Glu Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His290 295 300Pro Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Pro Pro Val Ser Ile Arg Val Thr305 310 315 320Glu Thr Gly Asp Glu Gly Pro Ala Glu Gly Ser Val Gly Glu Ser Gly325 330 335
Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala340<210>3<211>1810<212>DNA<213>鼠colTNFRII_FC<400>3atggcgcccg ccgccctctg ggtcgcgctg gtcttcgaac tgcagctgtg ggccaccggg 60cacacagtgc ccgcccaggt tgtcttgaca ccctacaaac cggaacctgg gtacgagtgc120cagatctcac aggaatacta tgacaggaag gctcagatgt gctgtgctaa gtgtcctcct180ggccaatatg tgaaacattt ctgcaacaag acctcggaca ctgtgtgtgc ggactgtgag240gcaagcatgt atacccaggt ctggaaccag tttcgtacat gtttgagctg cagttcttcc300tgtagcactg accaggtgga gacccgcgcc tgcactaaac agcagaaccg agtgtgtgct360tgcgaagctg gcaggtactg cgccttgaaa acccattctg gcagctgtcg acagtgcatg420aggctgagca agtgcggccc tggcttcgga gtggccagtt caagagcccc aaatggaaat480gtgctatgca aggcctgtgc cccagggacg ttctctgaca ccacatcatc cacagatgtg540tgcaggcccc accgcatctg tagcatcctg gctattcccg gaaatgcaag cacagatgca600gtctgtgcgc ccgagtcccc aactctaagt gccatcccaa ggacactcta cgtatctcag660ccagagccca caagatccca acccctggat caagagccag ggcccagcca aactccaagc720atccttacat cgttgggttc aacccccatt attgaacaaa gtaccaaggg tggcgagccc780cgcggaccga caatcaagcc ctgtcctcca tgcaaatgcc caggtaagtc actagaccag840agctccactc ccgggagaat ggtaagtgct ataaacatcc ctgcactaga ggataagcca900tgtacagatc catttccatc tctcctcatc agcacctaac ctcgagggtg gaccatccgt960cttcatcttc cctccaaaga tcaaggatgt actcatgatc tccctgagcc ccatagtcac 1020atgtgtggtg gtggatgtga gcgaggatga cccagatgtc cagatcagct ggtttgtgaa 1080
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Lys His Phe Cys Asn Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Ala Asp Cys Glu65 70 75 80Ala Ser Met Tyr Thr Gln Val Trp Asn Gln Phe Arg Thr Cys Leu Ser85 90 95Cys Ser Ser Ser Cys Ser Thr Asp Gln Val Glu Thr Arg Ala Cys Thr100 105 110Lys Gln Gln Asn Arg Val Cys Ala Cys Glu Ala Gly Arg Tyr Cys Ala115 120 125Leu Lys Thr His Ser Gly Ser Cys Arg Gln Cys Met Arg Leu Ser Lys130 135 140Cys Gly Pro Gly Phe Gly Val Ala Ser Ser Arg Ala Pro Asn Gly Asn145 150 155 160Val Leu Cys Lys Ala Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asp Thr Thr Ser165 170 175Ser Thr Asp Val Cys Arg Pro His Arg Ile Cys Ser Ile Leu Ala Ile180 185 190Pro Gly Asn Ala Ser Thr Asp Ala Val Cys Ala Pro Glu Ser Pro Thr195 200 205Leu Ser Ala Ile Pro Arg Thr Leu Tyr Val Ser Gln Pro Glu Pro Thr210 215 220Arg Ser Gln Pro Leu Asp Gln Glu Pro Gly Pro Ser Gln Thr Pro Ser225 230 235 240Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ile Ile Glu Gln Ser Thr Lys245 250 255
Gly Gly<210>5<211>585<212>PRT<213>與Fc元件融合的人RAGE-LBE<220>
<221>misc_feature<222>(423)..(423)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<400>5Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95Phe Arg Cys Gln Ala Asn Ile Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser100 105 110Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Glu Lys Pro Glu Ile Val
115 120 125Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr130 135 140Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu145 150 155 160Asp Gly Lys Pro Leu Val Leu Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu165 170 175Gln Thr Arg Arg His Pro Glu Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu180 185 190Leu Met Val Thr Pro Ala Arg Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser195 200 205Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala210 215 220Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln225 230 235 240Leu Val Val Glu Pro Glu Gly Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val245 250 255Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp260 265 270Met Lys Asp Gly Val Pro Leu Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile275 280 285Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala290 295 300Thr His Ser Ser His Gly Pro Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser
305 310 315 320Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly325 330 335Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala Leu Ala Cys Ala Gly Ser Gly Ser Gly340 345 350Ser Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys355 360 365Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Asp370 375 380Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys385 390 395 400Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp405 410 415Tyr Val Asp Gly Val Glu Xaa Gln Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu420 425 430Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu435 440 445His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn450 455 460Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly465 470 475 480Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu485 490 495Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
500 505 510Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn515 520 525Lys Cys Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe530 535 540Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val545 550 555 560Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln565 570 575Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys580 585<210>6<211>1701<212>DNA<213>與Fc元件融合的人RAGE-LBE<220>
<221>misc_feature<222>(1205)..(1205)<223>n是肌苷<400>6atggcagccg gaacagcagt tggagcctgg gtgctggtcc tcagtctgtg gggggcagta 60gtaggtgctc aaaacatcac agcccggatt ggcgagccac tggtgctgaa gtgtaagggg 120gcccccaaga aaccacccca gggaggaggc ccctgggaca gtgtggctcg tgtccttccc 180aacggctccc tcttccttcc ggctgtcggg atccaggatg aggggatttt ccggtgccag 240gcaatgaaca ggaatggaaa ggagaccaag tccaactacc gagtccgtgt ctaccagatt 300cctgagaagc cagaaattgt agattctgcc tctgaactca cggctggtgt tcccaataag 360gtggggacat gtgtgtcaga gggaagctac cctgcaggga ctcttagctg gcacttggat 420
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<213>人RAGE<400>7Met Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Ala Trp Val Leu Val Leu Ser Leu1 5 10 15Trp Gly Ala Val Val Gly Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu20 25 30Pro Leu Val Leu Lys Cys Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg35 40 45Leu Glu Trp Lys Leu Asn Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu50 55 60Ser Pro Gln Gly Gly Gly Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro65 70 75 80Asn Gly Ser Leu Phe Leu Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile85 90 95Phe Arg Cys Gln Ala Met Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr His Ser Asn100 105 110Tyr Arg Val Arg Val Tyr Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp115 120 125Ser Ala Ser Glu Leu Thr Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys130 135 140Val Ser Glu Gly Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp145 150 155 160Gly Lys Pro Leu Val Pro Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln165 170 175
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Arg Gly Glu Glu Arg Lys Ala Pro Glu Asn Gln Glu Glu Glu Glu Glu370 375 380Arg Ala Glu Leu Asn Gln Ser Glu Glu Pro Glu Ala Gly Glu Ser Ser385 390 395 400Thr Gly Gly Pro<210>8<211>1436<212>DNA<213>人RAGE<400>8gtccctggaa ggaagcagga tggcagccgg aacagcagtt ggagcctggg tgctggtcct 60cagtctgtgg ggggcagtag taggtgctca aaacatcaca gcccggattg gcgagccact120ggtgctgaag tgtaaggggg cccccaagaa accaccccag cggctggaat ggaaactgaa180cacaggccgg acagaagctt ggaaggtcct gtctccccag ggaggaggcc cctgggacag240tgtggctcgt gtccttccca acggctccct cttccttccg gctgtcggga tccaggatga300ggggattttc cggtgccagg caatgaacag gaatggaaag gagaccaagt ccaactaccg360agtccgtgtc taccagattc ctgggaagcc agaaattgta gattctgcct ctgaactcac420ggctggtgtt cccaataagg tggggacatg tgtgtcagag ggaagctacc ctgcagggac480tcttagctgg cacttggatg ggaagcccct ggtgcctaat gagaagggag tatctgtgaa540ggaacagacc aggagacacc ctgagacagg gctcttcaca ctgcagtcgg agctaatggt600gaccccagcc cggggaggag atccccgtcc caccttctcc tgtagcttca gcccaggcct660tccccgacac cgggccttgc gcacagcccc catccagccc cgtgtctggg agcctgtgcc720tctggaggag gtccaattgg tggtggagcc agaaggtgga gcagtagctc ctggtggaac780cgtaaccctg acctgtgaag tccctgccca gccctctcct caaatccact ggatgaagga840tggtgtgccc ttgccccttc cccccagccc tgtgctgatc ctccctgaga tagggcctca900
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權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，含有高級(jí)糖基化終產(chǎn)物配體結(jié)合元件受體(RAGE-LBE)和免疫球蛋白元件。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分。
3.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括圖7所示氨基酸序列中的氨基酸殘基1-344。
4.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括圖7所示氨基酸序列中的氨基酸殘基1-330。
5.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括圖7所示氨基酸序列中的氨基酸殘基1-321。
6.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括圖7所示氨基酸序列中的氨基酸殘基1-230。
7.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括圖7所示氨基酸序列中的氨基酸殘基1-118。
8.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括Ig1、Ig2和Ig3區(qū)。
9.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括Ig1和Ig2區(qū)。
10.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括Ig1區(qū)。
11.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中RAGE-LBE包括一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，其中這些點(diǎn)突變提高了RAGE-LBE與高級(jí)糖基化終產(chǎn)物結(jié)合配偶體受體(RAGE-BP)的結(jié)合親和力。
12.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中免疫球蛋白元件包括免疫球蛋白重鏈。
13.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中免疫球蛋白元件包括Fc區(qū)。
14.權(quán)利要求12的融合蛋白，其中免疫球蛋白重鏈選自IgM、IgD、IgE和IgA重鏈。
15.權(quán)利要求12的融合蛋白，其中免疫球蛋白重鏈選自IgG1、IgG2β、IgG2α和IgG3重鏈。
16.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中免疫球蛋白元件包括CH1和Fc區(qū)。
17.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中免疫球蛋白元件包括第一類免疫球蛋白的CH1區(qū)，和第二類免疫球蛋白的CH1區(qū)，其中第一類免疫球蛋白與第二類免疫球蛋白不同。
18.權(quán)利要求1的融合蛋白，進(jìn)一步包括二聚化多肽。
19.一種組合物，包含權(quán)利要求1～18中任意一項(xiàng)的融合蛋白和藥學(xué)可接受載體。
20.一種融合蛋白，含有RAGE-LBE和第二區(qū)，該第二區(qū)選自二聚化多肽、純化多肽、穩(wěn)定化多肽和導(dǎo)向多肽。
21.權(quán)利要求20的融合蛋白，其中二聚化多肽包括兩親性多肽。
22.權(quán)利要求21的融合蛋白，其中兩親性多肽含最多達(dá)50個(gè)氨基酸。
23.權(quán)利要求22的融合蛋白，其中兩親性多肽含最多達(dá)30個(gè)氨基酸。
24.權(quán)利要求22的融合蛋白，其中兩親性多肽含最多達(dá)20個(gè)氨基酸。
25.權(quán)利要求22的融合蛋白，其中兩親性多肽含最多達(dá)10個(gè)氨基酸。
26.權(quán)利要求20的融合蛋白，其中二聚化多肽含有肽螺旋束。
27.權(quán)利要求20的融合蛋白，其中二聚化多肽含有亮氨酸拉鏈。
28.權(quán)利要求27的融合蛋白，其中亮氨酸拉鏈為jun拉鏈。
29.權(quán)利要求27的融合蛋白，其中亮氨酸拉鏈為fos拉鏈。
30.權(quán)利要求20的融合蛋白，其中二聚化多肽包括具有帶正電或負(fù)電荷殘基的多肽，其中該多肽可與帶相反電荷的另一個(gè)肽結(jié)合。
31.一種組合物，包括權(quán)利要求20～30中任意一項(xiàng)的融合蛋白和藥學(xué)可接受載體。
32.一種融合蛋白，所含氨基酸序列與圖3A所示氨基酸序列存在至少90％的同一性。
33.編碼多肽融合體的核酸序列，該多肽融合體含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件。
34.編碼多肽的核酸序列，該多肽與圖3A所示氨基酸序列存在至少90％的同一性。
35.權(quán)利要求33的核酸，其中RAGE-LBE通過C-或N-末端氨基或羧基與免疫球蛋白元件融合。
36.一種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求33的核酸。
37.權(quán)利要求36的表達(dá)載體，可在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的至少一種細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。
38.一種經(jīng)由權(quán)利要求37的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
39.一種制備RAGE-LBE-免疫球蛋白融合蛋白的方法，包括在適合表達(dá)該融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求38的細(xì)胞。
40.權(quán)利要求39的方法，進(jìn)一步包括純化程序，以提高上述融合蛋白的純度。
41.一種分離抗體或其片段，可與圖3A所示氨基酸序列中的一個(gè)表位進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)。
42.一種蛋白質(zhì)復(fù)合體，含有一種或多種融合蛋白，其中該融合蛋白選自a)含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件的融合蛋白；和b)含有RAGE-LBE和第二區(qū)的融合蛋白，該第二區(qū)選自二聚化區(qū)、穩(wěn)定化區(qū)、純化區(qū)和導(dǎo)向區(qū)。
43.一種藥物組合物，含有RAGE-LBE和TNF-α-抑制劑。
44.一種含有融合蛋白和TNF-α-抑制劑的藥物組合物，其中融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白元件。
45.一種鑒定化合物的方法，該化合物可抑制選自S100和兩性蛋白的RAGE-BP多肽與選自RAGE、RAGE-LBE和RAGE-LBE-免疫球蛋白融合體的受體多肽之間的相互作用，該方法包括a)在無(wú)試驗(yàn)化合物，且RAGE-BP多肽與受體多肽相互作用的條件下，形成反應(yīng)混合物，該混合物包括i)RAGE-BP多肽，為S100或兩性蛋白；ii)受體多肽，為RAGE、RAGE-LBE或RAGE-LBE-免疫球蛋白融合體；和iii)試驗(yàn)化合物；并b)檢測(cè)RAGE-BP多肽與受體多肽之間的相互作用，其中與無(wú)試驗(yàn)化合物條件下RAGE-BP多肽與受體多肽之間的相互作用水平相比，試驗(yàn)化合物存在條件下RAGE-BP多肽與受體多肽之間的相互作用減弱，說明試驗(yàn)化合物具有抑制活性。
46.權(quán)利要求45的方法，其中RAGE-BP為S100。
47.權(quán)利要求45的方法，其中RAGE-BP為兩性蛋白。
48.一種鑒定特定化合物的方法，該化合物可抑制RAGE-BP多肽所誘導(dǎo)的RAGE信號(hào)傳遞活性，該RAGE-BP多肽選自S100和兩性蛋白，該方法包括a)使細(xì)胞接觸RAGE-BP多肽，即S100或兩性蛋白；b)在無(wú)試驗(yàn)化合物存在，且RAGE信號(hào)傳遞活性正常發(fā)生的條件下，使細(xì)胞接觸試驗(yàn)化合物；并c)檢測(cè)RAGE-BP所誘導(dǎo)的RAGE信號(hào)傳遞活性，其中與無(wú)試驗(yàn)化合物條件下信號(hào)傳遞活性的水平相比，試驗(yàn)化合物存在條件下RAGE-BP所誘導(dǎo)的RAGE信號(hào)傳遞活性降低，說明試驗(yàn)化合物具有抑制活性。
49.權(quán)利要求48的方法，其中RAGE-BP為S100。
50.權(quán)利要求48的方法，其中RAGE-BP為兩性蛋白。
51.權(quán)利要求48的方法，其中信號(hào)傳遞活性是活化NF-kB轉(zhuǎn)錄活性。
52.權(quán)利要求48的方法，其中信號(hào)傳遞活性是活化促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)活性。
53.一種抑制高級(jí)糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)與RAGE結(jié)合配偶體(RAGE-BP)之間相互作用的方法，該方法包括施用一種融合蛋白，該融合蛋白含有RAGE-LBE和免疫球蛋白。
54.一種抑制高級(jí)糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)與RAGE結(jié)合配偶體(RAGE-BP)之間相互作用的方法，該方法包括施用權(quán)利要求41的抗體。
55.一種抑制高級(jí)糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)與RAGE結(jié)合配偶體(RAGE-BP)之間相互作用的方法，該方法包括施用一種通過權(quán)利要求45或48的方法鑒定的化合物。
56.一種降低內(nèi)源RAGE活性的方法，該方法包括施用一種含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。
57.一種降低內(nèi)源RAGE活性的方法，該方法包括施用權(quán)利要求41的抗體。
58.一種降低內(nèi)源RAGE活性的方法，該方法包括施用一種通過權(quán)利要求45或48的方法鑒定的化合物。
59.一種治療RAGE相關(guān)病癥的方法，該方法包括施用一種含RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。
60.權(quán)利要求59的方法，其中含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白與一種或多種用于治療選自下組的一種或多種狀況的藥劑聯(lián)合施用淀粉樣變性、癌癥、關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、朊病毒相關(guān)病癥、脈管炎、腎病、視網(wǎng)膜病和神經(jīng)病。
61.一種治療RAGE相關(guān)病癥的方法，該方法包括施用權(quán)利要求41的抗體。
62.權(quán)利要求61的方法，其中抗體與一種或多種用于治療選自下組的一種或多種狀況的藥劑聯(lián)合施用淀粉樣變性、癌癥、關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、朊病毒相關(guān)病癥、脈管炎、腎病、視網(wǎng)膜病和神經(jīng)病。
63.一種治療RAGE相關(guān)病癥的方法，該方法包括施用通過權(quán)利要求45或48的方法鑒定的化合物。
64.權(quán)利要求63的方法，其中化合物與一種或多種用于治療選自下組的一種或多種狀況的藥劑聯(lián)合施用淀粉樣變性、癌癥、關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、朊病毒相關(guān)病癥、脈管炎、腎病、視網(wǎng)膜病和神經(jīng)病。
65.權(quán)利要求60、62和64中任意一項(xiàng)的方法，其中藥劑選自抗炎劑、抗氧化劑、β阻斷劑、抗血小板劑、ACE抑制劑、降脂劑、抗血管發(fā)生劑和化學(xué)療法。
66.權(quán)利要求60、62和64中任意一項(xiàng)的方法，其中藥劑為氨甲蝶呤。
67.權(quán)利要求60、62和64中任意一項(xiàng)的方法，其中急性炎性疾病為膿毒癥。
68.權(quán)利要求60、62和64中任意一項(xiàng)的方法，其中心血管疾病為再狹窄。
69.權(quán)利要求53、56和59中任意一項(xiàng)的方法，其中RAGE-LBE包括RAGE的胞外部分。
70.一種治療RAGE相關(guān)病癥的方法，該方法包括施用一種組合物，該組合物包含TNF-α抑制劑和至少一種RAGE-LBE或含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。
71.一種治療RAGE相關(guān)病癥的方法，該方法包括施用一種組合物，該組合物包含至少一種含有RAGE-LBE和免疫球蛋白的融合蛋白。
72.權(quán)利要求59-64和70-71中任意一項(xiàng)的方法，其中RAGE相關(guān)病癥選自淀粉樣變性、癌癥、關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、慢性炎性疾病、急性炎性疾病、心血管疾病、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥、朊病毒相關(guān)病癥、脈管炎、腎病、視網(wǎng)膜病和神經(jīng)病。
73.權(quán)利要求72的方法，其中RAGE相關(guān)病癥為阿爾茨海默氏病。
74.權(quán)利要求72的方法，其中慢性炎性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
75.權(quán)利要求72的方法，其中慢性炎性疾病為骨關(guān)節(jié)炎。
76.權(quán)利要求72的方法，其中慢性炎性疾病為腸易激疾病。
77.權(quán)利要求72的方法，其中慢性炎性疾病為多發(fā)性硬化。
78.權(quán)利要求72的方法，其中慢性炎性疾病為銀屑病。
79.權(quán)利要求72的方法，其中慢性炎性疾病為狼瘡或任意其它自身免疫病。
80.權(quán)利要求72的方法，其中急性炎性疾病為膿毒癥。
81.權(quán)利要求72的方法，其中心血管疾病為動(dòng)脈粥樣硬化。
82.權(quán)利要求72的方法，其中心血管疾病為再狹窄。
83.權(quán)利要求46或49中任意一項(xiàng)的方法，其中S100為S100B。
84.權(quán)利要求46或49中任意一項(xiàng)的方法，其中S100為S100a12。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合蛋白，該融合蛋白含有高級(jí)糖基化終產(chǎn)物配體結(jié)合元件受體(RAGE－LBE)和免疫球蛋白元件。本發(fā)明也公開了含有RAGE－LBE和二聚化區(qū)域的融合蛋白。本發(fā)明還公開了編碼上述融合蛋白的核酸，以及利用該公開核酸和蛋白質(zhì)，例如，治療RAGE相關(guān)病癥的方法。本發(fā)明也公開了其它組合物和方法。
文檔編號(hào)C07K14/00GK1774445SQ03824210
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2003年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者D·D·皮特曼, B·克蘭西, G·拉森, W·L·特雷皮基奧, F·M·布倫南, M·費(fèi)爾德曼, B·J·M·?？怂咕S爾, J·L·費(fèi)爾德曼 申請(qǐng)人:惠氏公司, 帝國(guó)學(xué)院創(chuàng)新有限公司