一株高糖醇轉(zhuǎn)化率釀酒酵母菌種及其選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及工業(yè)微生物的育種，尤其是一株高糖醇轉(zhuǎn)化 率釀酒酵母菌種及其選育方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 燃料乙醇在國計民生中占有很重要的位置，在醫(yī)藥、有機(jī)合成、食品工業(yè)、工農(nóng)業(yè) 及國防工業(yè)都有著廣泛的應(yīng)用。2012年，世界乙醇總產(chǎn)量達(dá)到約225億加侖，其中80%的產(chǎn) 量是由釀酒酵母利用不同的碳源經(jīng)厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的。該方法以糖質(zhì)原料或淀粉質(zhì)為原料， 在微生物的作用下，發(fā)酵生成乙醇。根據(jù)原料不同又可分為三類：分別為以糖蜜原料發(fā)酵生 產(chǎn)乙醇、以淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇和以木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。我國當(dāng)前生成乙醇的 主要方法是以淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，利用薯類、谷物等含淀粉的原料，經(jīng)液化、糖化后 發(fā)酵生成乙醇。因此，碳源的價格是乙醇生產(chǎn)的總價值中一個重要參數(shù)，如何充分利用原料 中的碳源，提高釀酒酵母菌種的糖醇轉(zhuǎn)化率，是燃料乙醇產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。
[0003] 釀酒酵母細(xì)胞同其它動植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞一樣，具有一套完整的應(yīng)對外界環(huán) 境滲透壓改變的機(jī)制。生物采用的這種滲透調(diào)節(jié)機(jī)制，是通過一種或幾種可溶性物質(zhì)的累 積來實現(xiàn)控制細(xì)胞內(nèi)與外界滲透壓的平衡的。生物物種不同，其調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的可 溶性物質(zhì)也不同，種類包括從無機(jī)離子到有機(jī)物質(zhì)，有的還包括糖類與糖醇類化合物等。甘 油是釀酒酵母重要的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)。Fpslp為釀酒酵母細(xì)胞跨膜運(yùn)輸?shù)耐ǖ赖鞍祝浠?因是由鑲嵌在細(xì)胞膜上的FPSl編碼的。在釀酒酵母中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甘油合成途徑中的兩個酶 GPDH(三磷酸甘油脫氫酶）和GPP(三磷酸甘油酯酶）各自具有兩個同工酶。GPDH的同工 酶為Gpdlp和Gpd2p，分別由GPDl和GPD2基因編碼。
[0004] 本實驗室前期研宄結(jié)果證明，敲除通道蛋白編碼基因FPSl和三磷酸甘油脫氫酶 編碼基因GPDl可有效提高釀酒酵母菌種的糖醇轉(zhuǎn)化率。因此，為了提高釀酒酵母對發(fā)酵液 中糖的利用能力，降低發(fā)酵液中糖濃度，可通過敲除通道蛋白編碼基因FPSl和三磷酸甘油 脫氫酶編碼基因GPDl來實現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株高糖醇轉(zhuǎn)化率釀酒酵母菌種及其選育方法。
[0006] 本發(fā)明提供的面包酵母菌種是具有快速發(fā)酵性能的面包酵母菌株，具體為 Saccharomyces cerevisiae SY-5-11L。該菌已于2013年03月28日保藏于中國微生物保 藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號），保 藏號為 CGMCC No7378。
[0007] 所述釀酒酵母菌株在在發(fā)酵周期和乙醇產(chǎn)量不受影響的情況下，糖醇轉(zhuǎn)化率明 顯提高，為44. 22%，與親本菌株相比，糖醇轉(zhuǎn)化率提高了 6. 71%，發(fā)酵液初糖濃度降低了 5. 13%，從而大大降低了發(fā)酵成本。
[0008] 所述釀酒酵母菌株具體可以通過敲除出發(fā)菌株釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2. 1190(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，公眾可以通過該保藏管理 中心獲得出發(fā)菌株CGMCC 2. 1190)甘油通道蛋白編碼基因FPSl的部分或全部序列，并同時 敲除三磷酸甘油脫氫酶編碼基因GPDl來實現(xiàn)。
[0009] 上述敲除可以用常規(guī)的方法獲得。這些方法已有許多文獻(xiàn)報道，如Jowph Sambrook等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學(xué)出版社，1995。也可用本領(lǐng)域已知的其它 方法來構(gòu)建基因敲除的酵母菌。這種通過敲除獲得的菌株不易產(chǎn)生回復(fù)突變和表達(dá)基因丟 失，菌株的穩(wěn)定性高，有利于工業(yè)化應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建上述釀酒酵母菌株的方法是，將PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒得到的重 組基因盒導(dǎo)入面包酵母出發(fā)菌株中通過同源重組獲得重組菌。
[0011] 所述的重組質(zhì)粒分別是pUC-GIBAK和pUC-FBAK，是能夠完全敲除釀酒酵母的甘油 通道蛋白編碼基因并同時敲除三磷酸甘油脫氫酶編碼基因的重組質(zhì)粒，所述甘油通道蛋白 編碼基因為FPSl基因，三磷酸甘油脫氫酶編碼基因為GPDl基因。
[0012] 所述重組質(zhì)粒上無任何營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記。
[0013] 本發(fā)明所述釀酒酵母菌株可應(yīng)用于乙醇生產(chǎn)中。
[0014] 本發(fā)明同時提供了一種專門用于鑒定所述高糖醇轉(zhuǎn)化率釀酒酵母菌種的基因序 列，該基因序列是用Gl-U、Gl-D引物以及FPS1-U、FPSl-D兩組引物對所述高糖醇轉(zhuǎn)化率釀 酒酵母菌株基因組為模板擴(kuò)增的片段。
[0015] 鑒定菌種基因缺陷的引物序列為：
[0016] Gl-U: 5，-GCCACTTGAATGCTGGTAGA-3 '
[0017] Gl-D: 5 ' -GGCAGGTTCTTCATTGGGTA-3 '
[0018] FPSl-U: 5，-AGCAGTCATCCGACGAAG-3 '
[0019] FPSl-D: 5 ' -AGAATCAGTCGTCGTCGC-3 '
[0020] 有益效果：
[0021] 一是本發(fā)明選育的釀酒酵母菌株所敲除的甘油通道蛋白編碼基因以及三磷酸甘 油脫氫酶編碼基因為100%缺失，不易產(chǎn)生回復(fù)突變，并且重組菌株中的KanMX抗性基因已 經(jīng)敲除，保證了菌株及發(fā)酵產(chǎn)品的安全性；二是本發(fā)明選育的釀酒酵母菌株糖醇轉(zhuǎn)化率顯 著提高，能夠降低發(fā)酵液中初始糖濃度，而發(fā)酵周期和乙醇產(chǎn)量均沒有明顯變化。篩選得到 的工程菌對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般工廠的設(shè)備和條件均可使用，因而有廣泛 的應(yīng)用前景。
【附圖說明】：
[0022] 圖1是pUC-GIBAK質(zhì)粒構(gòu)建過程；
[0023] 圖2是pUC-FBAK質(zhì)粒構(gòu)建過程；
[0024] 圖3是重組質(zhì)粒pUC-GIBAK與基因組重組過程；
[0025] 圖4是重組質(zhì)粒pUC-FBAK與基因組重組過程。
[0026] 本發(fā)明所述的快速發(fā)酵面包酵母具體為Saccharomyces cerevisiae SY-5-11L， 已于2011年12月22日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC， 地址為：中國北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號），保藏號為CGMCC No7378。
【具體實施方式】：
[0027] 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0028] 實施例1 :高糖醇轉(zhuǎn)化率酵母菌株的選育
[0029] 雙倍體出發(fā)菌株CGMCC 2. 1190經(jīng)過產(chǎn)孢，篩選出單倍體菌株a 5,通過兩次同源 重組的方法并去除KanMX抗性基因，構(gòu)建得到重組單倍體菌株a 5 A F A Gl。
[0030] 重組質(zhì)粒pUC-GIBAK的構(gòu)建流程如圖1所示。重組質(zhì)粒pUC-GIBAK的構(gòu)建分為三 步：第一步：用限制性內(nèi)切酶BamHI和SphI，將504bp同源臂GlB片段連接到pUC19質(zhì)粒上， 得到質(zhì)粒PUC19-G1B ;第二步：用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Kpnl，將362bp同源臂GlA片段連 接到PUC19-G1B質(zhì)粒上，得到質(zhì)粒PUC19-G1BA ;第三步：通過KpnI和BamHI兩個限制性內(nèi) 切酶，將1600bp的KanMX連接到質(zhì)粒pUC19-GlBA上，得到重組質(zhì)粒pUC-GIBAK。
[0031] 重組質(zhì)粒pUC-FBAK的構(gòu)建流程如圖2所示。重組質(zhì)粒pUC-FBAK的構(gòu)建分為三步： 第一步：用限制性內(nèi)切酶BamHI和SphI，將713bp同源臂FB片段連接到pUC19質(zhì)粒上，得 到質(zhì)粒PUC19-FB ;第二步：用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Kpnl，將334bp同源臂FA片段連接到 PUC19-FB質(zhì)粒上，得到質(zhì)粒pUC19-FBA;第三步：通過KpnI和BamHI兩個限制性內(nèi)切酶，將 1600bp的KanMX連接到質(zhì)粒pUC19-FBA上，最終得到重組質(zhì)粒pUC-FBAK。
[0032] 重組質(zhì)粒pUC-GIBAK重組過程如圖3所示。以質(zhì)粒pUC-GIBAK為模板，用引物對 GlA-U和GlB-D進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到GlA-KanMX-GlB重組盒。用醋酸鋰轉(zhuǎn)化的方法將重組盒 GlA-KanMX-GlB轉(zhuǎn)入釀酒酵母單倍體細(xì)胞a8 AB和a5AB中，通過GlA和GlB片段與釀酒 酵母染色體上GPDl基因兩側(cè)的同源序列同時進(jìn)行兩次同源重組，從而將重組盒整合到釀 酒酵母染色體上，并隨著染色體的復(fù)制而一起復(fù)制。重組過程實現(xiàn)了 GPDl基因被KanMX完 全替換，從而實現(xiàn)GPDl基因的完全敲除。
[0033] 重組質(zhì)粒pUC-FBAK重組過程如圖4所示。以質(zhì)粒pUC-FBAK為模板，用引物對FA-U 和FB-D進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到FA-KanMX-FB重組盒。醋酸鋰轉(zhuǎn)化重組盒FA-KanMX-FB進(jìn)入酵 母單倍體細(xì)胞，通過FA和FB片段與酵母染色體上FPSl基因兩側(cè)的同源序列同時發(fā)生兩次 同源重組，從而整合到酵母染色體上并隨染色體一起復(fù)制。重組過程實現(xiàn)了 FPSl基因被 KanMX完全替換，從而實現(xiàn)FPSl基因的完全敲除。
[0034] 實施例2 :快速發(fā)酵面包酵母菌株發(fā)酵實驗
[0035] (1)轉(zhuǎn)化子與單倍體親本的發(fā)酵實驗
[0036] 將釀酒酵母出發(fā)菌株a 5及重組菌株a 5 AF AGl同時進(jìn)行濃醪發(fā)酵實驗，測 定菌種的乙醇產(chǎn)量并計算菌種的糖醇轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，在濃醪發(fā)酵條件 下，重組菌株的乙醇產(chǎn)量為15.3%，相較出發(fā)菌株（15.4% )基本持平；而其初糖濃度為 15. l(g/100mL)，與出發(fā)菌株相比降低了 5. 63%，糖醇轉(zhuǎn)化率為44. 22%，相較出發(fā)菌株 (41. 44% )提高了 6. 71%。
[0037] 表1釀酒酵母發(fā)酵性能
[0038]
【主權(quán)項】
1. 一株高糖醇轉(zhuǎn)化率釀酒酵母菌種，具體為Saccharomyces cerevisiae SY-5-11L，保 藏號為 CGMCC No 7378。
2. -種權(quán)利要求1所述的高糖醇轉(zhuǎn)化率釀酒酵母菌種的構(gòu)建方法，其特征在于，通過 缺失甘油通道蛋白的FPSl基因和三磷酸甘油脫氫酶的GPDl基因，獲得權(quán)利要求1所述的 高糖醇轉(zhuǎn)化率釀酒酵母菌種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高糖醇轉(zhuǎn)化率釀酒酵母菌種的構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種顯著提高釀酒酵母菌種糖醇轉(zhuǎn)化率的方法，通過該方法構(gòu)建得到的菌種，在發(fā)酵周期和乙醇產(chǎn)量不受影響的情況下，糖醇轉(zhuǎn)化率明顯提高，為44.22％，與親本菌株相比，糖醇轉(zhuǎn)化率提高了6.71％，發(fā)酵液初糖濃度降低了5.63％，從而大大降低了發(fā)酵成本。通過同時敲除釀酒酵母出發(fā)菌株的甘油通道蛋白的FPS1基因和三磷酸甘油脫氫酶的GPD1基因來實現(xiàn)。選育得到的釀酒酵母菌種對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般工廠的設(shè)備和條件均可使用，因而有廣泛的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12R1-865, C12N15-63, C12P7-06, C12N1-18
【公開號】CN104611244
【申請?zhí)枴緾N201410483288
【發(fā)明人】肖冬光, 趙麗彬, 陳葉福, 許海艷, 董健
【申請人】天津科技大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年9月19日