專利名稱：用于將合成氣和其他碳源轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)品的微生物和方法
用于將合成氣和其他碳源轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)品的微生物和方法本申請(qǐng)主張2007年12月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)No. 61/138，108的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
本發(fā)明總體上涉及能夠?qū)⒓状?、合成氣體和其他氣態(tài)碳源轉(zhuǎn)化成較高價(jià)值化學(xué)品的生物合成方法和有機(jī)體。更具體而言，本發(fā)明涉及能夠生產(chǎn)商用化學(xué)品如異丙醇、4-羥基丁酸酯和1，4_ 丁二醇的非天然存在的有機(jī)體。增加的廉價(jià)靈活性和容易獲得原料以及最小化對(duì)化學(xué)品生產(chǎn)的環(huán)境影響對(duì)于可持續(xù)發(fā)展的化學(xué)工業(yè)是有益的。原料靈活性依賴于可以訪問和使用各種材料作為化工生產(chǎn)的主要材料的引入方法。異丙醇(IPA)是一種無色、易燃液體，與大多數(shù)溶劑混合完全，包括水。IPA的最大用途是作為溶劑，包括眾所周知的但很小使用的“外用酒精”，這是一種IPA和水的混合物。 作為溶劑，IPA在許多日常產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)，如涂料、油漆、稀釋劑、油墨、粘合劑、通用清潔劑、消毒劑、化妝品、盥洗用品、除冰劑和藥品。低級(jí)IPA也用于發(fā)動(dòng)機(jī)油中。第二個(gè)最大作用是作為異丙胺(例如在農(nóng)產(chǎn)品中)、異丙醚和異丙酯生產(chǎn)的化工中間體。異丙醇經(jīng)由兩種石化路線生產(chǎn)。主要過程需要在有或沒有硫酸催化作用下利用丙烯的水合。其次，IPA經(jīng)由丙酮的氫化生產(chǎn)，這是在苯酚和環(huán)氧丙烷生產(chǎn)中形成的副產(chǎn)品。 高價(jià)位的丙烯目前在整個(gè)化學(xué)中正推動(dòng)成本上升利潤(rùn)下降，因而正需要低成本原料的擴(kuò)大范圍。4-羥基丁酸(4-羥基丁酸酯、4-羥基丁酸酯、4-HB)是4_碳羧酸，已作為各種商品和特種化學(xué)品中構(gòu)建塊的工業(yè)潛力物。特別地，4-HB有可能作為進(jìn)入1，4_丁二醇系列化學(xué)品的新切入點(diǎn)，其中包括溶劑、樹脂、聚合物前體和特種化學(xué)品。BDO是一種用于高性能聚合物、溶劑和精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)的有價(jià)值化學(xué)品。它是生產(chǎn)其他高價(jià)值化學(xué)品的基礎(chǔ)，如四氫呋喃(THF)和Y-丁內(nèi)酯(GBL)。BDO的用途包括(1)聚合物，O) THF衍生物，和C3) GBL衍生物。在聚合物的情況下，BDO是一種聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PBT)生產(chǎn)的共聚單體。PBT是一種由諸如杜邦公司和通用電氣公司生產(chǎn)的中性能工程熱塑性塑料，其用在汽車、電器、供水系統(tǒng)和小家電中。當(dāng)轉(zhuǎn)化成THF時(shí)，和隨后轉(zhuǎn)化成聚四亞甲基醚二醇(PTMEG)時(shí)，氨綸和萊卡纖維和服裝產(chǎn)業(yè)被添加到服務(wù)市場(chǎng)。在生產(chǎn)聚酯醚(COPE)時(shí)，PTMEG也與BDO相結(jié)合。COPES是高模量彈性體，具有優(yōu)良的機(jī)械性能和耐油性/耐環(huán)境性，從而允許它們?cè)跇O端高和低的溫度下操作。PTMEG和BDO還可制造經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)擠出、壓延和成型設(shè)備加工的熱塑性聚氨酯，其特征在于其出色的韌性和耐磨性，從BDO生產(chǎn)的GBL提供制造吡咯烷酮的原料，以及服務(wù)于農(nóng)藥市場(chǎng)應(yīng)用本身。吡咯烷酮用作高性能溶劑，用于增加在電子行業(yè)中使用的提取過程以及用在藥物生產(chǎn)中。BDO由兩種主要石化路線生產(chǎn)，幾個(gè)路線也投入商業(yè)運(yùn)營(yíng)中。一條路線涉及乙炔與甲醛的反應(yīng)，然后氫化。最近，已經(jīng)提出涉及將丁烷或丁二烯氧化成馬來酸酐，然后氫化的 BDO過程。BDO幾乎唯一用作合成其他化學(xué)品和聚合物的中間體。合成氣體(合成氣)是主要由吐和CO組成的混合物，可經(jīng)由氣化任何有機(jī)原料(例如煤、煤油、天然氣、生物質(zhì)或有機(jī)廢物)來獲得。已經(jīng)開發(fā)出眾多氣化方法，且大部分設(shè)計(jì)是基于在高溫(500-1500°C )下部分氧化(其中限制氧氣含量以避免完全燃燒)有機(jī)物質(zhì)以提供作為例如0.5 1-3 1H2/C0混合物的合成氣。有時(shí)添加蒸汽以增加氫氣含量，這通常伴隨著經(jīng)水煤氣變換反應(yīng)增加(X)2產(chǎn)量?，F(xiàn)今，煤是用于工業(yè)生產(chǎn)合成氣的主要底物，而煤通常用于加熱和供能，并且用作甲醇和液態(tài)烴的費(fèi)托合成(Fischer-Tropsch synthesis)的原料。許多大型化學(xué)和能源公司大規(guī)模地利用煤氣化方法，并在工業(yè)上應(yīng)用這種技術(shù)?？偟膩碚f，在世界上幾乎任何地點(diǎn)，從包括煤、生物質(zhì)、廢物、聚合物等在內(nèi)的眾多物質(zhì)有成本效益地生產(chǎn)合成氣的技術(shù)當(dāng)前是存在的。生物質(zhì)氣化技術(shù)正在進(jìn)行商業(yè)實(shí)踐， 尤其是用于熱量和能量產(chǎn)生。雖然可以獲得利用合成氣的有機(jī)體，但一般來說，這類有機(jī)體的特征不清楚且不是非常適用于商業(yè)開發(fā)。例如，梭菌和相關(guān)細(xì)菌是嚴(yán)格厭氧菌，無法耐受高濃度的某些產(chǎn)物(例如丁醇)，因此限制了滴定度和商業(yè)化潛力。梭菌還產(chǎn)生很多種產(chǎn)物，這在獲得期望產(chǎn)物方面帶來了分離問題。最后，用于操作梭菌基因的靈巧基因工具的開發(fā)尚處在初期，因此，它們目前不能容易地經(jīng)受快速基因工程以便改進(jìn)期望產(chǎn)物的產(chǎn)率或生產(chǎn)特征。因此，需要開發(fā)可利用合成氣或其他氣態(tài)碳源來產(chǎn)生期望化學(xué)品和燃料的微生物和其使用方法。更具體而言，需要開發(fā)用于合成氣利用的微生物，其也具有現(xiàn)有的有效基因工具，使其能夠經(jīng)受快速工程改造而以有用的速率和數(shù)量產(chǎn)生有價(jià)值產(chǎn)物。本發(fā)明滿足這種需求并且也提供相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
在一些方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼異丙醇途徑酶的至少一種外源核酸的異丙醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生異丙醇。異丙醇途徑酶包括琥珀酰-CoA: 3-酮酸-CoA轉(zhuǎn)移酶。在其他方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼4-羥基丁酸酯途徑酶的至少一種外源核酸的4-羥基丁酸酯途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生4-羥基丁酸酯。4-羥基丁酸酯途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶和 4-羥基丁酸酯激酶。在其他方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼1， 4-丁二醇途徑酶的至少一種外源核酸的1，4_ 丁二醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生 1,4- 丁二醇。1，4- 丁二醇途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還包含具有編碼乙酰-CoA途徑酶的至少一種外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA。乙酰-CoA途徑酶包括類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在其他方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼1，4-丁二醇途徑酶的至少一種外源核酸的1，4_ 丁二醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生 1,4- 丁二醇。1，4- 丁二醇途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還包含具有編碼乙酰-CoA途徑酶的至少一種外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA。乙酰-CoA途徑酶包括乙酰-CoA合成酶、甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。在其他方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼異丙醇途徑酶的至少一種外源核酸的異丙醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生異丙醇。異丙醇途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸酯脫羧酶和異丙醇脫氫酶。所述有機(jī)體還包含具有編碼乙酰-CoA途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA。乙酰-CoA途徑酶包括甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在其他方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生異丙醇的方法，其包括培養(yǎng)具有異丙醇途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體。所述途徑包含編碼異丙醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生異丙醇的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生異丙醇。異丙醇途徑包括琥珀酰-CoA :3-酮酸-CoA轉(zhuǎn)移酶。 在其他方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生4-羥基丁酸酯的方法，其包括培養(yǎng)具有4-羥基丁酸酯途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體。所述途徑包含編碼4-羥基丁酸酯途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生4-羥基丁酸酯的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生4-羥基丁酸酯。4-羥基丁酸酯途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA 脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶和 4-羥基丁酸酯激酶。在其他方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4- 丁二醇的方法，其包括培養(yǎng)具有1，4- 丁二醇途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體。所述途徑包含編碼1，4_ 丁二醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生1，4_ 丁二醇的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生1， 4- 丁二醇。1，4- 丁二醇途徑包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還原酶 (醛形成型)和1，4_ 丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還包含具有編碼乙酰-CoA途徑酶的至少一種外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA。乙酰-CoA途徑酶包括類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。最后，在一些方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1，4_ 丁二醇的方法，其包括培養(yǎng)具有1， 4-丁二醇途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體。所述途徑包含編碼1，4_ 丁二醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生1，4_ 丁二醇的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生1，4_ 丁二醇。1，4_ 丁二醇途徑包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、 巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還包含具有編碼乙酰-CoA途徑酶的至少一種外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰_CoA。乙酰-CoA 途徑酶包括乙酰-CoA合成酶、甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。


圖1顯示乙酸酯和乙醇的Wood-Ljungdahl途徑和形成路徑。能夠在合成氣體上生長(zhǎng)的有機(jī)體典型地獨(dú)有的轉(zhuǎn)化有1)C0脫氫酶，幻氫化酶，；3)能量守恒氫化酶(ECH)，和 4)雙功能CO脫氫酶/乙酰-CoA合成酶。將氫氧化成2 [H]或用H2O將CO氧化成CO2, 2 [H] 提供將CO2還原成甲酸酯、將次甲基-四氫葉酸(次甲基-THF)還原成亞甲基四氫葉酸(亞甲基-THF)、將亞甲基-THF還原成甲基四氫葉酸(甲基-THF)以及將(X)2還原成CO的還原
=I里。圖2A顯示完全Wood-Ljungdahl途徑，用于將包含C0、0)2和/或H2的氣體轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA，乙酰-CoA隨后被轉(zhuǎn)化為細(xì)胞物質(zhì)和例如乙醇或乙酸酯等產(chǎn)物。圖2B顯示合成代謝途徑，其用于將包含CO、CO2和/或吐的氣體和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為異丙醇。圖2C顯示合成代謝途徑，其用于將包含CO、CO2和/或吐的氣體和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸酯。圖2D顯示合成代謝途徑，其用于將包含C0、0)2和 /或吐的氣體和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為1，4- 丁二醇。在圖2A-D中，可經(jīng)工程改造為生產(chǎn)宿主的特異性酶促轉(zhuǎn)化被編號(hào)?？s寫IOFTHF 10-甲酰四氫葉酸，5MTHF 5-甲基四氫葉酸，ACTP 乙酰磷酸，CFeSp 類咕啉鐵硫蛋白，F(xiàn)OR 甲酸酯，MeOH 甲醇，METHF 亞甲基四氫葉酸，MLTHF 次甲基四氫葉酸，THF 四氫葉酸。圖3A顯示合成代謝途徑，其用于將包含CO、CO2和/或H2的氣體和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為異丙醇。圖:3B顯示合成代謝途徑，其用于將包含C0、0)2和/或H2 的氣體和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸酯。圖3C顯示合成代謝途徑， 其用于將包含⑶、CO2和/或吐的氣體和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為1，4_ 丁二醇。在圖3A-C中，可經(jīng)工程改造為生產(chǎn)宿主的特異性酶促轉(zhuǎn)化被編號(hào)?？s寫10FTHF :10-甲酰四氫葉酸，5MTHF 5-甲基四氫葉酸，ACTP 乙酰磷酸，CFeSp 類咕啉鐵硫蛋白，F(xiàn)OR 甲酸酯，MeOH 甲醇，METHF 亞甲基四氫葉酸，MLTHF 次甲基四氫葉酸，THF 四氫葉酸。圖4顯示10微克ACS90 (泳道1)、ACS91 (泳道2)、Mta98/99 (泳道3和4)的細(xì)胞提取物、大小標(biāo)準(zhǔn)物(泳道5)和熱乙酸穆爾氏菌(M. thermoacetica)CODH(Moth_1202/1203) 或 Mtr(Mo th 1197)蛋白的對(duì)照(50、150、250、；350、450、500、750、900 和 IOOOng)的 Western 印跡。圖5顯示甲基紫精分析中使用的試管。空白在右側(cè)，含有還原的甲基紫精的試管在左側(cè)。每個(gè)試管上的塞子和真空脂用于保持反應(yīng)是厭氧性的。圖6顯示對(duì)于將CH3從加入的CH3-THF轉(zhuǎn)移到純化的熱乙酸穆爾氏菌類咕啉蛋白而進(jìn)行分析的ACS90細(xì)胞提取物的譜圖。圖7顯示重組大腸桿菌(E. coli)MG1655在37°C下在N2和CO中36hr的厭氧性生長(zhǎng)。從左到右顯示空白載體、ACS90和ACS91。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明部分地涉及非天然存在的微生物，其表達(dá)編碼與MtaABC型甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)一起催化Wood-Ljimgdahl途徑的羰基分支的酶的基因。所述有機(jī)體能夠?qū)⒓状?一種可來源于合成氣體的相對(duì)廉價(jià)的有機(jī)原料)和包含C0、0)2和/或H2的氣體轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA、 細(xì)胞物質(zhì)和產(chǎn)物，如異丙醇(IPA)、4_羥基丁酸酯G-HB)和1，4_ 丁二醇(BDO)。本發(fā)明也部分地涉及非天然存在的微生物，其表達(dá)編碼催化Wood-Ljimgdahl途徑的羰基和甲基分支的酶的基因。所述有機(jī)體能夠?qū)珻O、CO2和/或吐的氣體轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA、細(xì)胞物質(zhì)和產(chǎn)物，如IPA、4-HB和BD0。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能夠從甲醇和氣態(tài)原料如合成氣的混合物生產(chǎn)異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4_ 丁二醇的非天然存在的微生物有機(jī)體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能夠從合成氣的混合物而無需甲醇生產(chǎn)異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4_ 丁二醇的非天然存在的微生物有機(jī)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過培養(yǎng)這些非天然存在的微生物有機(jī)體生產(chǎn)異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4-丁二醇的方法。利用這些有機(jī)體的生物技術(shù)過程將會(huì)為異丙醇、4-羥基丁酸酯和1，4_ 丁二醇制造商提供操作靈活性，以保證基于多元化原料的最低運(yùn)營(yíng)成本和任選地抵消目前原料(如石油和天然氣)的市場(chǎng)導(dǎo)向的商品價(jià)格波動(dòng)。此外，這些過程將提供可持續(xù)的生產(chǎn)實(shí)踐，利用再生原料、降低能源強(qiáng)度和降低溫室氣體的排放。諸如楊氏梭菌(Moorellathermoacelica, C. Iiungdahlii)和嗜羧酸梭菌 (C. carboxidivorans)等產(chǎn)乙酸菌可利用從己糖到一氧化碳的范圍內(nèi)的多種碳源生長(zhǎng)。諸如葡萄糖等已糖首先經(jīng)由Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)糖酵解代謝為丙酮酸酯，然后經(jīng)由丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶(PFOR)轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA。乙酰-CoA可用于組建生物質(zhì)前體或可轉(zhuǎn)化為乙酸酯，其經(jīng)由乙酸酯激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶產(chǎn)生能量。葡萄糖至乙酸、能量和還原當(dāng)量的總體轉(zhuǎn)化由方程式1給出C6H1206+4ADP+4Pi — 2CH3C00H+2C02+4ATP+8 [H]方程式 1產(chǎn)乙酸菌甚至從葡萄糖中提取更多的能量供應(yīng)到乙酸酯轉(zhuǎn)化，同時(shí)也通過經(jīng)由 Wood-Ljungdahl途徑將釋放的(X)2轉(zhuǎn)化為乙酸酯來維持氧化還原平衡。2C02+8 [H] +η ADP+n Pi — CH3C00H+n ATP 方程式 2以上方程式中的系數(shù)η表示這種轉(zhuǎn)化是產(chǎn)生能量的過程，因?yàn)樵S多產(chǎn)乙酸菌可以在(X)2存在下經(jīng)由Wood-Ljimgdahl途徑生長(zhǎng)，甚至在沒有葡萄糖的情況下也可生長(zhǎng)，只要存在氫以便供應(yīng)必需的還原當(dāng)量即可。2C02+4H2+n ADP+n Pi — CH3C00H+2H20+n ATP 方程式 3圖1所說明的Wood-Ljimgdahl途徑與Na+或H+離子梯度的產(chǎn)生相聯(lián)系，所述離子梯度可分別經(jīng)由Na+-或H+依賴性ATP合成酶產(chǎn)生ATP (Muller, V. Appl Environ Microbiol 69 :6345-6353(2003)).基于這些已知的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)乙酸菌也可具有利用CO作為唯一碳源和能源的能力。具體來說，CO可經(jīng)氧化以產(chǎn)生還原當(dāng)量和CO2，或可被直接同化成乙酰-CoA， 其隨后轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)或乙酸酯。4C0+2H20 — CH3C00H+2C02 方程式 4然而，當(dāng)存在足夠的氫以滿足還原當(dāng)量的需求時(shí)，甚至可獲得更高的乙酸酯產(chǎn)率。
2C0+2H2 — CH3COOH 方程式 5根據(jù)圖1，經(jīng)由乙酰-CoA產(chǎn)生乙酸酯時(shí)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)ATP分子，而從乙酰-CoA產(chǎn)生乙醇時(shí)則不會(huì)產(chǎn)生ATP分子且需要兩個(gè)還原當(dāng)量。因此可以預(yù)期，從合成氣產(chǎn)生乙醇不會(huì)在無乙酸產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生足夠用于細(xì)胞生長(zhǎng)的能量。然而，在某些條件下，楊氏梭菌(Clostridium liungdahlii)主要從合成氣體產(chǎn)牛乙醇Oilasson等人，F(xiàn)uel 72: 1673-1678 (199 )，表明以下途徑的一些組合實(shí)際上不產(chǎn)生足以支持細(xì)胞生長(zhǎng)的能量。2C02+6H2 — CH3CH20H+3H20 方程式 66C0+3H20 — CH3CH20H+4C02 方程式 72C0+4H2 — -CH3CH20H+H20 方程式 8諸如深紅紅螺菌(R. rubrum)等產(chǎn)氫細(xì)菌也可從CO和水轉(zhuǎn)化為氫氣的過程產(chǎn)生能量(參見圖 1) (Simoma 等人，Critical Reviews in Biotechnology26 :41-65 (2006)) 一個(gè)重要的機(jī)制是能量轉(zhuǎn)換氫化酶(ECH)和CO脫氫酶的協(xié)同作用。CO脫氫酶從CO供應(yīng)電子，然后通過ECH用于將質(zhì)子還原為H2,ECH的活性與產(chǎn)生能量的質(zhì)子轉(zhuǎn)移相聯(lián)系。最終結(jié)果是經(jīng)由水煤氣變換反應(yīng)產(chǎn)生能量。本發(fā)明的實(shí)施方案描述(1)用于將合成氣連同和不連同甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的途徑與( 用于將乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4_ 丁二醇的途徑的組合。 因此，本發(fā)明提供生產(chǎn)有機(jī)體和轉(zhuǎn)化途徑，其與經(jīng)工程改造以從碳水化合物原料產(chǎn)生異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4_ 丁二醇的有機(jī)體相比具有固有的產(chǎn)率優(yōu)勢(shì)。例如，使用本文所述的從乙酰-CoA開始進(jìn)行的代謝途徑，從葡萄糖產(chǎn)生異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4_ 丁二醇的最大理論產(chǎn)率是每摩爾葡萄糖得到1摩爾產(chǎn)物。具體而言，經(jīng)由糖酵解每摩爾葡萄糖可產(chǎn)生2摩爾乙酰-CoA，且每摩爾異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4_ 丁二醇需要2摩爾乙酰-CoA。 通過以下化學(xué)計(jì)量方程式描述凈轉(zhuǎn)化異丙醇C6H1206+L502 — C3H80+3C02+2H204-羥基丁酸酯C6H1206+1. 502 — C4H803+2C02+2H201，4- 丁二醇C6H12O6 — C4H1002+CH202+C02另一方面，葡萄糖氣化為其更簡(jiǎn)單的組分CO和H2,隨后使用本文所述的途徑轉(zhuǎn)化為異丙醇、4-羥基丁酸酯和1，4_ 丁二醇，這會(huì)產(chǎn)生以下最大理論產(chǎn)率異丙醇60)+6 — 1. 333C3H80+2C02+0. 667H204-羥基丁酸酯6C0+6H2 — 1. 333C4H803+0. 667C02+0. 667H201,4- 丁二醇:6C0+6H2 — 1. 091C4H10O2+1. 636C02+0. 545H20應(yīng)注意葡萄糖的氣化最多可提供6摩爾CO和6摩爾H2。從合成氣體產(chǎn)生異丙醇、 4-羥基丁酸酯和1，4- 丁二醇的最大理論產(chǎn)率可通過如下文所述添加甲醇而得到進(jìn)一步提尚異丙醇CH40+6C0+6H2— 1. 667C3H80+2C02+1. 3 3 3H204-羥基丁酸酯CH40+6C0+6H2 — 1. 667C4H803+0. 333C02+1. 3 3 3H201,4- 丁二醇CH40+6C0+64 — 1. 364C4H1002+1. 545C02+1. 182H20異丙醇2CH40+6C0+6H2— 2C3H80+2C02+2H204-羥基丁酸酯2CH40+6C0+6H2 — 2C4Hg03+2H201,4- 丁二醇2CH40+6C0+64 — 1. 636C4H1002+1. 455C02+1. 818H20
因此，本文所述的有機(jī)體和轉(zhuǎn)化途徑顯然可提供將碳水化合物轉(zhuǎn)化為異丙醇、 4-羥基丁酸酯或1，4-丁二醇的有效方法。當(dāng)關(guān)于本發(fā)明的微生物有機(jī)體或微生物使用時(shí)，如本文所用的術(shù)語“非天然存在” 意指微生物有機(jī)體具有在天然存在的所提及物種的菌株(包括所提及物種的野生型菌株) 中通常未發(fā)現(xiàn)的至少一處基因變異。基因變異包括例如引入可表達(dá)的編碼代謝多肽的核酸的修飾、其他核酸添加、核酸缺失和/或微生物遺傳物質(zhì)的其他功能性破壞。所述修飾包括例如所提及物種的異源、同源或異源與同源多肽的編碼區(qū)和其功能片段。其他修飾包括例如非編碼調(diào)控區(qū)，其中修飾會(huì)改變基因或操縱子的表達(dá)。示例性代謝多肽包括異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4-丁二醇生物合成途徑內(nèi)的酶或蛋白。代謝修飾是指從天然存在的狀態(tài)發(fā)生改變的生化反應(yīng)。因此，非天然存在的微生物可具有對(duì)編碼代謝多肽的核酸或其功能片段的基因修飾。本文公開了示例性代謝修飾。當(dāng)關(guān)于微生物有機(jī)體使用時(shí)，如本文所用的術(shù)語“經(jīng)分離的”意指有機(jī)體基本上不含在自然界中發(fā)現(xiàn)所提及的微生物有機(jī)體時(shí)所伴隨的至少一種組分。所述術(shù)語包括移除自然環(huán)境中所伴隨的部分或所有組分的微生物有機(jī)體。所述術(shù)語還包括移除非天然存在的環(huán)境中伴隨微生物有機(jī)體的部分或所有組分的微生物有機(jī)體。因此，經(jīng)分離的微生物有機(jī)體與在自然界中發(fā)現(xiàn)時(shí)或在非天然存在的環(huán)境中生長(zhǎng)、儲(chǔ)存或生存時(shí)與其他物質(zhì)部分或完全分離。經(jīng)分離的微生物有機(jī)體的具體例子包括部分純的微生物、基本上純的微生物和在非天然存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物。如本文所用的術(shù)語“微生物性”、“微生物有機(jī)體”或“微生物”意指以古菌域、細(xì)菌域或真核域內(nèi)所包括的顯微細(xì)胞形式存在的任何有機(jī)體。因此，所述術(shù)語意圖涵蓋具有顯微尺寸的原核或真核細(xì)胞或有機(jī)體，且包括所有種類的細(xì)菌、古細(xì)菌和真細(xì)菌，以及真核微生物，例如酵母和真菌。所述術(shù)語還包括可經(jīng)培養(yǎng)以用于產(chǎn)生生化物質(zhì)的任何種類的細(xì)胞培養(yǎng)物。如本文所用的術(shù)語"CoA”或“輔酶A”意指有機(jī)輔因子或輔基(酶的非蛋白部分)，其存在對(duì)于許多酶(脫輔酶)形成活性酶系統(tǒng)的活性是必需的。輔酶A在某些縮合酶中、在乙?；蚱渌；D(zhuǎn)移中、在脂肪酸合成和氧化、在丙酮酸酯氧化中和在其他乙?；饔弥邪l(fā)揮功能。當(dāng)關(guān)于培養(yǎng)或生長(zhǎng)條件使用時(shí)，如本文所用的術(shù)語“基本上厭氧的”意指液體培養(yǎng)基中的含氧量小于溶解氧飽和含量的約10%。所述術(shù)語還意圖包括維持在小于約氧氣的氣氛下的液體或固體培養(yǎng)基的密封室。如本文所用的“外源”意指所提及的分子或所提及的活性被引入到宿主微生物有機(jī)體中。分子可例如通過將編碼核酸引入到宿主遺傳物質(zhì)中而引入，例如通過編碼核酸整合到宿主染色體中或編碼核酸作為非染色體遺傳物質(zhì)(例如質(zhì)粒)。因此，在關(guān)于編碼核酸的表達(dá)使用時(shí)，所述術(shù)語是指將編碼核酸以可表達(dá)形式引入到微生物有機(jī)體中。當(dāng)關(guān)于生物合成活性使用時(shí)，所述術(shù)語是指活性被引入到宿主參考有機(jī)體中。來源可為例如同源或異源編碼核酸，其在引入到宿主微生物有機(jī)體中之后表達(dá)所提及的活性。因此，術(shù)語“內(nèi)源”是指所提及的分子或活性是存在于宿主中。類似地，當(dāng)關(guān)于編碼核酸的表達(dá)使用時(shí)，所述術(shù)語是指表達(dá)微生物有機(jī)體內(nèi)所含的編碼核酸。術(shù)語“異源”是指分子或活性是來源于除所提及的物種以外的來源，而“同源”是指分子或活性是來源于所述宿主微生物有機(jī)體。因此，本發(fā)明的編碼核酸的外源表達(dá)可利用異源編碼核酸或同源編碼核酸或這兩者。本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可含有穩(wěn)定的基因變異，這是指微生物在培養(yǎng)超過5代后仍不會(huì)損失所述變異。一般來說，穩(wěn)定的基因變異包括持續(xù)超過10代的修飾， 特別地，穩(wěn)定的修飾將持續(xù)超過約25代，更特別地，穩(wěn)定的基因修飾將持續(xù)超過50代，包括無限持續(xù)下去。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，對(duì)基因變異(包括本文示例的代謝修飾)的描述是關(guān)于合適的宿主有機(jī)體(例如大腸桿菌)和其對(duì)應(yīng)的代謝反應(yīng)，或產(chǎn)生期望遺傳物質(zhì)(例如針對(duì)期望代謝途徑的基因)的合適來源有機(jī)體。然而，鑒于多種有機(jī)體的完整基因組測(cè)序和基因組學(xué)領(lǐng)域中的高度技術(shù)水平，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地將本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)應(yīng)用于基本上所有其他有機(jī)體。例如，通過并入來自除所提及物種以外的物種的相同或類似的編碼核酸，本文示例的大腸桿菌代謝變化可容易地應(yīng)用于其他物種。所述基因變異一般包括例如種間同源物的基因變異，特別是直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置換。直系同源物是通過垂直家系產(chǎn)生關(guān)聯(lián)且在不同有機(jī)體中負(fù)責(zé)基本上相同或一致的功能的基因。例如，小鼠環(huán)氧化物水解酶和人類環(huán)氧化物水解酶可被視為環(huán)氧化物水解的生物功能的直系同源物。例如，當(dāng)基因共有足量的序列相似性以指示其是同源的時(shí)，所述基因通過垂直家系產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，或通過從共同祖先進(jìn)化而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。如果基因具有足量的三維結(jié)構(gòu)相似性但未必具有足量的序列相似性，從而在無法鑒別到一級(jí)序列相似性的范圍內(nèi)表明其是進(jìn)化自共同祖先，那么所述基因也可被視為直系同源物。直系同源的基因可編碼序列相似性為氨基酸序列同一性的約25%到100%的蛋白。如果編碼共有氨基酸相似性小于25%的蛋白的基因的三維結(jié)構(gòu)也顯示相似性，那么其也被視為是由垂直家系產(chǎn)生的。絲氨酸蛋白酶家族的成員(包括組織纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶)被視為是通過垂直家系從共同祖先產(chǎn)生的。直系同源物包括經(jīng)由例如進(jìn)化而在結(jié)構(gòu)或總體活性上趨異的基因或其編碼的基因產(chǎn)物。例如，在一種物種編碼展現(xiàn)兩種功能的基因產(chǎn)物的情況下，以及在所述功能分離成第二物種中的不同基因的情況下，這三種基因和其對(duì)應(yīng)產(chǎn)物被視為直系同源物。為了產(chǎn)生生物化學(xué)產(chǎn)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，可對(duì)具有欲引入或破壞的代謝活性的直系同源基因進(jìn)行選擇，以便構(gòu)建非天然存在的微生物。展現(xiàn)可分離活性的直系同源物的例子是不同活性已在兩種或兩種以上物種之間或在單一物種內(nèi)被分離成不同基因產(chǎn)物。具體例子是彈性蛋白酶蛋白水解和纖溶酶原蛋白水解(兩種類型的絲氨酸蛋白酶活性)被分離成作為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶的不同分子。另一例子是支原體5' -3'核酸外切酶和果蠅 DNA聚合酶III活性的分離。第一物種的DNA聚合酶可被視為第二物種的核酸外切酶或聚合酶中一者或兩者的直系同源物，且反之亦然。相反，旁系同源物是通過例如復(fù)制和隨后的進(jìn)化趨異而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)且具有相似或共同、但不完全相同的功能的同源物。旁系同源物可來源于或衍生于例如相同物種或不同物種。例如，微粒體環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶I)和可溶性環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶II)可被視為旁系同源物，因?yàn)槠浯韮煞N共同進(jìn)化自共同祖先的不同酶，催化不同反應(yīng)且在相同物種中具有不同功能。旁系同源物是來自相同物種的彼此具有顯著序列相似性的蛋白，表明其是同源的或通過共同進(jìn)化自共同祖先而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。旁系同源蛋白家族的分組包括HipA同源物、熒光素酶基因、肽酶等。
非直系同源基因置換是來自一個(gè)物種的非直系同源基因，可取代不同物種中的參考基因功能。取代包括例如能夠在起源物種中執(zhí)行與不同物種中的參考功能相比基本上相同或類似的功能。雖然一般來說，非直系同源基因置換可被鑒別為在結(jié)構(gòu)上與編碼參考功能的已知基因相關(guān)，但是結(jié)構(gòu)相關(guān)性較小但功能類似的基因和其對(duì)應(yīng)的基因產(chǎn)物在本文中使用時(shí)仍然處于所述術(shù)語的含義內(nèi)。功能相似性需要例如非直系同源基因產(chǎn)物的活性位點(diǎn)或結(jié)合區(qū)域與編碼設(shè)法取代的功能的基因相比具有至少一些結(jié)構(gòu)相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物或無關(guān)基因。因此，在鑒別和構(gòu)建具有異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4_ 丁二醇生物合成能力的本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體的過程中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，通過對(duì)特定物種應(yīng)用本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，代謝修飾的鑒別可包括直系同源物的鑒別和納入或失活。只要參考微生物中存在旁系同源物和/或非直系同源基因置換以用于編碼催化類似或基本上類似的代謝反應(yīng)的酶，那么本領(lǐng)域技術(shù)人員也可利用這些進(jìn)化上相關(guān)的基因。直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置換可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來確定。例如，檢查兩種多肽的核酸或氨基酸序列將會(huì)揭示所比較序列之間的序列同一性和相似性?；谒鱿嗨菩裕绻嗨菩宰銐蚋?，那么本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定蛋白是通過進(jìn)化自共同祖先而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的算法(例如Align、BLAST、ClUStal W) 比較和確定粗略序列相似性或同一性，并且確定序列中可被指派權(quán)重或分?jǐn)?shù)的空位的存在或顯著性。所述算法在本領(lǐng)域中也是已知的，且類似地可用于確定核苷酸序列相似性或同一性。足以確定關(guān)聯(lián)性的相似性的參數(shù)是基于用于計(jì)算統(tǒng)計(jì)相似性的熟知方法，或在隨機(jī)多肽中發(fā)現(xiàn)類似匹配的概率和所確定匹配的顯著性來計(jì)算得出。兩種或兩種以上序列的計(jì)算機(jī)比較在必要時(shí)也可由本領(lǐng)域技術(shù)人員目測(cè)優(yōu)化。預(yù)期相關(guān)的基因產(chǎn)物或蛋白可具有高相似性，例如25%到100%序列同一性。如果掃描足夠大小的數(shù)據(jù)庫(kù)，那么無關(guān)的蛋白可具有與預(yù)期偶然發(fā)生的概率基本上相同的同一性(約5%)。5%- %之間的序列可能代表或可能不代表足以推斷所比較序列是相關(guān)序列的同源性?？蓤?zhí)行鑒于數(shù)據(jù)集的大小確定所述匹配的顯著性的其他統(tǒng)計(jì)分析，以便確定這些序列的相關(guān)性。使用BLAST算法確定兩種或兩種以上序列的關(guān)聯(lián)性的示例性參數(shù)例如可說明如下。簡(jiǎn)言之，氨基酸序列比對(duì)可使用2. 0.8版(1999年1月5日)BLASTP和以下參數(shù)來進(jìn)行矩陣0 BL0SUM62 ；空位開放11 ；空位延伸1 ;x_扣分50 ；期望值10. 0 ；字長(zhǎng)3 ；過濾器開。核酸序列比對(duì)可使用2. 0. 6版(1998年9月16日)BLASTN和以下參數(shù)來進(jìn)行匹配1 ；錯(cuò)配-2 ；空位開放5 ；空位延伸2 ；x_扣分50 ；期望值10. 0 ；字長(zhǎng)11 ；過濾器 關(guān)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知悉，例如，為了增加或降低比較嚴(yán)格度并確定兩種或兩種以上序列的關(guān)聯(lián)性，可對(duì)上述參數(shù)作哪些修改。大腸桿菌(Escherichia coli)是具有充分研究的一套基因工具的常用有機(jī)體。將合成氣體轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA (重要代謝物，可由其獲得細(xì)胞物質(zhì)組分和許多有價(jià)值的產(chǎn)物) 的能力可被工程改造入外部宿主，例如大腸桿菌，其隨后表達(dá)編碼Wood-Ljungdahl途徑的各種蛋白的外源基因。所述途徑在例如熱乙酸穆爾氏菌(Moorella thermoacetica)(以前稱作熱乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum))等產(chǎn)乙酸有機(jī)體中高度活躍，熱乙酸穆爾氏菌早在1942年被分離出時(shí)就作為闡明Wood-Ljungdahl途徑的模型有機(jī)體(Rmtaine 等人，J Bacteriol. 43 :701-715 (1942))。Wood-Ljungdahl 途徑包含兩個(gè)分支東部(或甲基)分支，其允許CO2轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸(Me-THF)；和西部(或羰基)分支，其允許甲基-THF、CO和輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA (參見圖2A)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其表達(dá)與MtaABC型甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)一起催化Wood-L jungdahl途徑的羰基分支的酶的編碼基因。所述有機(jī)體能將甲醇(一種可來源于合成氣體的相對(duì)廉價(jià)的有機(jī)原料)和包含CO、CO2和/或吐的氣體轉(zhuǎn)化為乙酰_CoA、細(xì)胞物質(zhì)和產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的有機(jī)體具有圖2B所示的以下能力1)功能甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，能夠從甲醇和THF生產(chǎn)5-甲基-四氫葉酸(Me-THF)J)將CO、輔酶A和Me-THF 的甲基組合而形成乙酰-CoA的能力，和3)從乙酰-CoA合成IPA的能力。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的有機(jī)體具有功能甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、合成乙酰-CoA的能力以及從乙酰-CoA合成 4-HB的能力，如圖2C所示。本發(fā)明的其他有機(jī)體具有功能甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、合成乙酰-CoA 的能力以及從乙酰-CoA合成BDO的能力，如圖2D所示。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的有機(jī)體能夠‘固定’來自外源CO和/或(X)2和甲醇的碳，以合成乙酰-CoA、細(xì)胞物質(zhì)和產(chǎn)物。合成氣體直接轉(zhuǎn)化為乙酸酯是能量中性過程(參見圖1和2A)。具體而言，在通過甲?；?THF合成酶形成甲酰基-THF的過程中消耗1個(gè) ATP分子，而在經(jīng)由乙酸酯激酶產(chǎn)生乙酸的過程中則產(chǎn)生1個(gè)ATP分子。通過確保從甲醇而不是CO2獲得甲基分支產(chǎn)物甲基-THF上的甲基避免了 ATP消耗需求。這因此確保了乙酸酯形成具有正ATP產(chǎn)出，從而幫助支持細(xì)胞生長(zhǎng)和維持。經(jīng)工程改造而具有這些能力且天然也具有回補(bǔ)能力的宿主有機(jī)體(例如，大腸桿菌)可在合適的外部電子受體(例如硝酸鹽)存在下，利用甲醇和合成氣所產(chǎn)生的乙酰-CoA生長(zhǎng)。這種電子受體用于接受來自于經(jīng)由琥珀酸酯脫氫酶而形成的還原苯醌的電子。添加外部電子受體的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于可從乙酰-CoA的呼吸作用產(chǎn)生額外的能量用于細(xì)胞生長(zhǎng)、維持和產(chǎn)物形成。在其他實(shí)施方案中， 可以將丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶(PFOR)插到菌株中以允許在不存在外部電子受體的情況下合成生物質(zhì)前體。本發(fā)明的有機(jī)體的另一特征是能夠從分子氫提取還原當(dāng)量的能力。這允許高產(chǎn)率的還原產(chǎn)物，例如乙醇、丁醇、異丁醇、異丙醇、1，4_ 丁二醇、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸、4-羥基丁酸、3-羥基丙酸、乳酸、己二酸、3-羥基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸和丙烯酸。本發(fā)明的有機(jī)體可從以下來源產(chǎn)生乙酰-CoA、細(xì)胞物質(zhì)和目標(biāo)化學(xué)品，更具體而言IPA、4-HB或BDO :1)甲醇和C0，2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、CO、CO2和H2,4)甲醇和包含 CO和H2的合成氣體，和5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣體。成功地將這種途徑工程改造到有機(jī)體中會(huì)涉及鑒別適當(dāng)?shù)拿讣?，將其?duì)應(yīng)基因克隆到生產(chǎn)宿主中，優(yōu)化這些基因的穩(wěn)定性和表達(dá)，優(yōu)化發(fā)酵條件，和分析發(fā)酵后的產(chǎn)物形成。下文描述催化合成氣體和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4_ 丁二醇所必需的途徑的每一步驟的多種酶。為了工程改造生產(chǎn)宿主以利用合成氣和甲醇，在微生物中表達(dá)一種或多種編碼酶的外源DNA序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼異丙醇途徑酶的至少一種外源核酸的異丙醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生異丙醇。異丙醇途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸酯脫羧酶和異丙醇脫氫酶。本發(fā)明的額外異丙醇途徑包括琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA轉(zhuǎn)移酶(SCOT)、乙酰乙酸酯脫羧酶和異丙醇脫氫酶。
所述有機(jī)體還可包含例如以下的至少一種酶或多肽類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸 類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在一些實(shí)施方案中，具有異丙醇途徑的有機(jī)體可包含甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。在這種實(shí)施方案中，所述有機(jī)體利用例如以下的原料1)甲醇和C0，2)甲醇、0)2和氏，3)甲醇、CO、 CO2和H2,4)甲醇和包含CO和H2的合成氣體，和5)甲醇和包含CO、CO2和H2的合成氣體。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的有機(jī)體具有甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。所述有機(jī)體利用選自以下的原料1) CO, 2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成氣體，和5)包含CO、CO2和H2的合成氣體。本發(fā)明還提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼4-羥基丁酸酯途徑酶的至少一種外源核酸的4-羥基丁酸酯途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生4-羥基丁酸酯。4-羥基丁酸酯途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶和4-羥基丁酸酯激酶。所述有機(jī)體還可包含例如以下的至少一種酶或多肽類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸 類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在一些實(shí)施方案中，具有4-羥基丁酸酯途徑的有機(jī)體可包含甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。所述有機(jī)體利用例如以下的原料1)甲醇和C0，2)甲醇、0)2和吐，3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和吐的合成氣體，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成氣體。具有4-羥基丁酸酯途徑的其他有機(jī)體可具有甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。所述有機(jī)體利用例如以下的原料1) CO, 2) CO2和H2, 3) CO和C02，4)包含CO和H2的合成氣體，和5) 包含CO、CO2和H2的合成氣體。本發(fā)明還提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼1，4_ 丁二醇途徑酶的至少一種外源核酸的1，4- 丁二醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生1，4- 丁二醇。 1,4- 丁二醇途徑酶包括例如乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4_羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)和1，4_ 丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還可包含例如以下的至少一種酶或多肽類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸 類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在一些實(shí)施方案中，具有1，4_ 丁二醇途徑的有機(jī)體可包含甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。所述有機(jī)體利用例如以下的原料1)甲醇和C0，2)甲醇、(X)2和H2, 3)甲醇、CO、CO2和H2,4)甲醇和包含CO和吐的合成氣體，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成氣體。在其他實(shí)施方案中，具有1，4_ 丁二醇途徑的有機(jī)體可包含甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。所述有機(jī)體利用選自以下的原料1) CO, 2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成氣體，和幻包含CO、CO2和吐的合成氣體。本發(fā)明還公開一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼乙酰-CoA途徑酶的至少一種外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA。乙酰-CoA途徑酶包括甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶和乙酰-CoA合成酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼異丙醇途徑酶的至少一種外源核酸的異丙醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生異丙醇，所述異丙醇途徑酶包括甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在一些實(shí)施方案中，所述有機(jī)體可包含例如以下的外源多肽或酶乙酰乙酰-C0A 硫解酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸酯脫羧酶和異丙醇脫氫酶。在其他實(shí)施方案中，所述有機(jī)體可包含例如以下的外源多肽或酶琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA轉(zhuǎn)移酶(SCOT)、乙酰乙酸酯脫羧酶和異丙醇脫氫酶。經(jīng)修飾的Wood-Ljungdahl途徑在外來宿主中的表達(dá)(參見圖2B)需要一組甲基轉(zhuǎn)移酶以便利用由甲醇提供的碳和氫以及由CO和/或CO2提供的碳。3種甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白(表示為MtaA、MtaB和MtaC)的復(fù)合物發(fā)揮期望的甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶活性(Naidu 和 Ragsdale，T Bacteriol. 183 :3276-3281 (2001) ；Ragsdale, S. W.，Crit Rev. Biochem. Mol. Biol 39 :165-195(2004) Sauer 等人，Eur. T BioChem. 243 :670-677(1997) ；Tallant 和 Krzycki，TBacteriol. 178 :1295-1301(1996) ；Tallant 和 Krzycki，T Bacteriol. 179 6902-6911(1997) :Tallant 等人，J Biol Chem. 276 :4485_4493 (2OOl))。MtaB是一種鋅蛋白，催化甲基從甲醇轉(zhuǎn)移到MtaC(類咕啉蛋白)?？稍诋a(chǎn)甲烷古細(xì)菌，例如巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri) (Maeder等人，.丁 Bacteriol. 188 7922-7931 (2006))和嗜乙酸甲燒八疊球菌(Methanosarcina acetivorans) (Galagan 等人，基因組Res 12 :532-542(2002)),以及產(chǎn)乙酸菌熱乙酸穆爾氏菌(Moorella thermoacetica) (Das 等人，Proteins 67 :167-176(2007))中發(fā)現(xiàn)編碼 MtaB 和 MtaC 的示例性基因。一般來說，MtaB和MtaC基因在染色體上彼此相鄰，因?yàn)槠浠钚跃o密地相互依賴。 巴氏甲烷八疊球菌、嗜乙酸甲烷八疊球菌和熱乙酸穆爾氏菌中的各種MtaB和MtaC編碼基因的蛋白序列可由以下GenBank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。表 1.
權(quán)利要求
1.一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其包括具有異丙醇途徑的微生物有機(jī)體，所述異丙醇途徑包含編碼異丙醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生異丙醇，所述異丙醇途徑酶包括琥珀酰-CoA: 3-酮酸-CoA轉(zhuǎn)移酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機(jī)體，其中所述琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA轉(zhuǎn)移酶由選自以下的一種或多種基因編碼HPAG1_0676、HPAG1_0677、ScoA, ScoB, OXCTl 和 0XCT2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機(jī)體，還包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酸酯脫羧酶和異丙醇脫氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的有機(jī)體，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由選自以下的基因編碼atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的有機(jī)體，其中所述乙酰乙酸酯脫羧酶由基因adc編碼。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的有機(jī)體，其中所述異丙醇脫氫酶由選自以下的基因編碼adh 禾口 ipdho
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有機(jī)體，還包含選自以下的至少一種酶或多肽類咕啉蛋白、 甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，其中所述類咕啉蛋白由選自以下的基因編碼mtaC、 mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC30
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaA、mtaAl和mtaA2。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由基因acsE編碼。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，其中所述類咕啉鐵硫蛋白由基因acsD編碼。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，其中所述鎳蛋白裝配蛋白由選自以下的至少一種基因編碼acsF禾口 cooC。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，其中所述鐵氧還蛋白由基因orf7編碼。
14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，其中所述乙酰-CoA合成酶由選自以下的至少一種基因編碼acsB禾口 acsC。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，其中所述一氧化碳脫氫酶由基因acsA編碼。
16.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，其中所述丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶由選自以下的基因編碼por和ydbK。
17.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，其中所述氫化酶由選自以下的至少一種基因編碼hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth 1883、moth 1884、moth 1885、moth 1886、moth 1887、moth 1888、moth 1452、moth_1453 禾口 moth_1454。
18.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，還包含由基因acsEps編碼的多肽AcsEps。
19.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，還包含由選自以下的基因編碼的至少一種酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
20.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，還包含甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的有機(jī)體，其中所述甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的有機(jī)體，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)甲醇和 C0, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成氣體，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成氣體。
23.根據(jù)權(quán)利要求7所述的有機(jī)體，還包含甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的有機(jī)體，其中所述甲酸酯脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073Uchy_0732 和 chy_0733。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的有機(jī)體，其中所述甲酰四氫葉酸合成酶由選自以下的基因編碼moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的有機(jī)體，其中所述次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的有機(jī)體，其中所述亞甲基四氫葉酸脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的有機(jī)體，其中所述亞甲基四氫葉酸還原酶由選自以下的基因編碼moth_l 191、metF 和 chy_1233。
29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的有機(jī)體，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成氣體，和5)包含CO、CO2和H2的合成氣體。
30.一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其包括具有4-羥基丁酸酯途徑的微生物有機(jī)體，所述4-羥基丁酸酯途徑包含編碼4-羥基丁酸酯途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生4-羥基丁酸酯，所述4-羥基丁酸酯途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶和4-羥基丁酸酯激酶。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的有機(jī)體，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由選自以下的基因編碼atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的有機(jī)體，其中所述3-羥基丁酰-CoA脫氫酶由選自以下的基因編碼hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 禾口 msed_1933。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的有機(jī)體，其中所述巴豆酸酶由選自以下的基因編碼crt、 paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF 禾口 paaG。
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的有機(jī)體，其中所述巴豆酰-CoA水合酶由選自以下的基因編碼abfD、msed_1321 禾口 msed_1220。
35.根據(jù)權(quán)利要求30所述的有機(jī)體，其中所述4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼cat2、abfT-2、abfT-1 和 abfT。
36.根據(jù)權(quán)利要求30所述的有機(jī)體，其中所述磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶由選自以下的基因編碼:pta禾口 ptb。
37.根據(jù)權(quán)利要求30所述的有機(jī)體，其中所述4-羥基丁酸酯激酶由選自以下的基因編碼ackA、bukl、buk2 禾口 proB。
38.根據(jù)權(quán)利要求30所述的有機(jī)體，還包含選自以下的至少一種酶或多肽類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，其中所述類咕啉蛋白由選自以下的基因編碼 mtaC、mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC30
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaA、mtaAl和mtaA2。
41.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由基因acsE編碼。
42.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，其中所述類咕啉鐵硫蛋白由基因acsD編碼。
43.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，其中所述鎳蛋白裝配蛋白由選自以下的至少一種基因編碼acsF禾口 cooC。
44.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，其中所述鐵氧還蛋白由基因orf7編碼。
45.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，其中所述乙酰-CoA合成酶由選自以下的至少一種基因編碼acsB禾口 acsC。
46.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，其中所述一氧化碳脫氫酶由基因acsA編碼。
47.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，其中所述丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶由選自以下的基因編碼por和ydbK。
48.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，其中所述氫化酶由選自以下的至少一種基因編碼hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfa、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、 moth_1453 禾口 moth_1454。
49.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，還包含由基因acsEps編碼的多肽AcsEps。
50.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，還包含由選自以下的基因編碼的至少一種酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
51.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，還包含甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的有機(jī)體，其中所述甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的有機(jī)體，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)甲醇和 CO, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成氣體，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成氣體。
54.根據(jù)權(quán)利要求38所述的有機(jī)體，還包含甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
55.根據(jù)權(quán)利要求M所述的有機(jī)體，其中所述甲酸酯脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073U chy_0732 和 chy_0733。
56.根據(jù)權(quán)利要求M所述的有機(jī)體，其中所述甲酰四氫葉酸合成酶由選自以下的基因編碼moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
57.根據(jù)權(quán)利要求M所述的有機(jī)體，其中所述次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
58.根據(jù)權(quán)利要求M所述的有機(jī)體，其中所述亞甲基四氫葉酸脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
59.根據(jù)權(quán)利要求M所述的有機(jī)體，其中所述亞甲基四氫葉酸還原酶由選自以下的基因編碼moth_l 191、metF 和 chy_1233。
60.根據(jù)權(quán)利要求M所述的有機(jī)體，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成氣體，和5)包含CO、CO2和H2的合成氣體。
61.一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其包括具有1，4_ 丁二醇途徑的微生物有機(jī)體， 所述1，4_ 丁二醇途徑包括編碼1，4_ 丁二醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生1，4_ 丁二醇，所述1，4_ 丁二醇途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、 4-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)和1，4-丁二醇脫氫酶；所述有機(jī)體還包含具有編碼乙酰-CoA途徑酶的至少一種外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑酶包括類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由選自以下的基因編碼atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述3-羥基丁酰-CoA脫氫酶由選自以下的基因編碼hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 禾口 msed_1933。
64.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述巴豆酸酶由選自以下的基因編碼crt、 paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF 禾口 paaG。
65.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述巴豆酰-CoA水合酶由選自以下的基因編碼abfD、msed_1321 禾口 msed_1220。
66.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型) 由選自以下的基因編碼adhE、adhE2、mcr、rcas_2929、napl_02720 和 mgp2080_005;35。
67.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述4-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型) 由選自以下的基因編碼acrl、sucD、bphG、msed_0709、mcr、asd-2 禾口 saci_2370。
68.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述1，4_丁二醇脫氫酶由選自以下的基因編 5 :alrA,adh2,yqhD,bdh I、bdh II 禾口 4hbd。
69.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述類咕啉蛋白由選自以下的基因編碼 mtaC、mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC30
70.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaA、mtaAl和mtaA2。
71.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由基因acsE編碼。
72.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述類咕啉鐵硫蛋白由基因acsD編碼。
73.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述鎳蛋白裝配蛋白由選自以下的至少一種基因編碼acsF禾口 cooC。
74.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述鐵氧還蛋白由基因編碼orf7.
75.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述乙酰-CoA合成酶由選自以下的至少一種基因編碼acsB禾口 acsC。
76.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述一氧化碳脫氫酶由基因acsA編碼。
77.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶由選自以下的基因編碼por和ydbK。
78.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，其中所述氫化酶由選自以下的至少一種基因編碼hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、 moth_1453 禾口 moth_1454。
79.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，還包含由基因acsEps編碼的多肽AcsEps。
80.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，還包含由選自以下的基因編碼的至少一種酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
81.根據(jù)權(quán)利要求61所述的有機(jī)體，還包含甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的有機(jī)體，其中所述甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
83.根據(jù)權(quán)利要求81所述的有機(jī)體，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)甲醇和 C0, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成氣體，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成氣體。
84.一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其包括具有1，4_ 丁二醇途徑的微生物有機(jī)體， 所述1，4_ 丁二醇途徑包括編碼1，4_ 丁二醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生1，4_ 丁二醇，所述1，4_ 丁二醇途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、 4-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)和1，4-丁二醇脫氫酶；所述有機(jī)體還包含具有編碼乙酰-CoA途徑酶的至少一種外源核酸的乙酰-CoA途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑酶包括乙酰-CoA合成酶、甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、 次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的有機(jī)體，其中所述甲酸酯脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073U chy_0732 和 chy_0733。
86.根據(jù)權(quán)利要求84所述的有機(jī)體，其中所述甲酰四氫葉酸合成酶由選自以下的基因編碼moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
87.根據(jù)權(quán)利要求84所述的有機(jī)體，其中所述次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
88.根據(jù)權(quán)利要求84所述的有機(jī)體，其中所述亞甲基四氫葉酸脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
89.根據(jù)權(quán)利要求84所述的有機(jī)體，其中所述亞甲基四氫葉酸還原酶由選自以下的基因編碼moth_l 191、metF 和 chy_1233。
90.根據(jù)權(quán)利要求84所述的有機(jī)體，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成氣體，和5)包含CO、CO2和H2的合成氣體。
91.一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其包括具有異丙醇途徑的微生物有機(jī)體，所述異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生異丙醇，所述異丙醇途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸酯脫羧酶和異丙醇脫氫酶；所述有機(jī)體還包含編碼乙酰-CoA酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑酶包括甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶、 類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、 鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。
92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的有機(jī)體，其中所述乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼atoA、atoD、ctfA和ctfB。
93.一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其包括具有異丙醇途徑的微生物有機(jī)體，所述異丙醇途徑包括編碼異丙醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生異丙醇，所述異丙醇途徑酶包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸酯脫羧酶和異丙醇脫氫酶；所述有機(jī)體還包含編碼乙酰-CoA酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑酶包括乙酰-CoA合成酶、 甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的有機(jī)體，其中所述乙酰乙酰-CoA:乙酸酯CoA轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼atoA、atoD、ctfA和ctfB。
95.一種產(chǎn)生異丙醇的方法，其包括培養(yǎng)具有異丙醇途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體，所述途徑包含編碼異丙醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生異丙醇的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生異丙醇，所述異丙醇途徑包括琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA轉(zhuǎn)移酶。
96.根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中所述琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA轉(zhuǎn)移酶由選自以下的一種或多種基因編碼HPAG1_0676、HPAG1_0677、ScoA, ScoB, OXCTl 和 0XCT2。
97.根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，還包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰乙酸酯脫羧酶和異丙醇脫氫酶。
98.根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由選自以下的基因編碼atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
99.根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中所述乙酰乙酸酯脫羧酶由基因adc編碼。
100.根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中所述異丙醇脫氫酶由選自以下的基因編碼 adh 禾口 ipdho
101.根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中所述有機(jī)體還包含選自以下的至少一種酶或多肽類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。
102.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述類咕啉蛋白由選自以下的基因編碼 mtaC、mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC30
103.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaA、mtaAl和mtaA2。
104.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由基因acsE編碼。
105.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述類咕啉鐵硫蛋白由基因acsD編碼。
106.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述鎳蛋白裝配蛋白由選自以下的至少一種基因編碼acsF禾口 cooC。
107.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述鐵氧還蛋白由基因orf7編碼。
108.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述乙酰-CoA合成酶由選自以下的至少一種基因編碼acsB禾口 acsC。
109.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述一氧化碳脫氫酶由基因acsA編碼。
110.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶由選自以下的基因編碼por和ydbK。
111.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述氫化酶由選自以下的至少一種基因編碼hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179> moth_2180> moth_2181 > hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth 1883、moth 1884、moth 1885、moth 1886、moth 1887、moth 1888、moth 1452、moth_1453 禾口 moth_1454。
112.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，還包括由基因acsEps編碼的多肽AcsEps。
113.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，還包括由選自以下的基因編碼的至少一種酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
114.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，還包括甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。
115.根據(jù)權(quán)利要求114所述的方法，其中所述甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
116.根據(jù)權(quán)利要求114所述的方法，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)甲醇和 C0, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成氣體，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成氣體。
117.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中所述有機(jī)體還包含甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
118.根據(jù)權(quán)利要求117所述的方法，其中所述甲酸酯脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073U chy_0732 和 chy_0733。
119.根據(jù)權(quán)利要求117所述的方法，其中所述甲酰四氫葉酸合成酶由選自以下的基因編碼moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
120.根據(jù)權(quán)利要求117所述的方法，其中所述次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
121.根據(jù)權(quán)利要求117所述的方法，其中所述亞甲基四氫葉酸脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
122.根據(jù)權(quán)利要求117所述的方法，其中所述亞甲基四氫葉酸還原酶由選自以下的基因編碼moth_l 191、metF 和 chy_1233。
123.根據(jù)權(quán)利要求117所述的方法，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成氣體，和5)包含CO、CO2和H2的合成氣體。
124.—種產(chǎn)生4-羥基丁酸酯的方法，其包括培養(yǎng)具有4-羥基丁酸酯途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體，所述途徑包含編碼4-羥基丁酸酯途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生4-羥基丁酸酯的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生4-羥基丁酸酯，所述4-羥基丁酸酯途徑包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶和4-羥基丁酸酯激酶。
125.根據(jù)權(quán)利要求124所述的方法，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由選自以下的基因編碼atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
126.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的方法，其中所述3-羥基丁酰-CoA脫氫酶由選自以下的基因編碼hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 禾口 msed_1933。
127.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的方法，其中所述巴豆酸酶由選自以下的基因編碼crt、 paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF 禾口 paaG。
128.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的方法，其中所述巴豆酰-CoA水合酶由選自以下的基因編碼abfD、msed_1321 禾口 msed_1220。
129.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的方法，其中所述4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼cat2、abfT-2、abfT-1 和 abfT。
130.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的方法，其中所述磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶由選自以下的基因編碼:pta禾口 ptb。
131.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的方法，其中所述4-羥基丁酸酯激酶由選自以下的基因編碼ackA、bukl、buk2 禾口 proB。
132.根據(jù)權(quán)利要求IM所述的方法，其中所述有機(jī)體還包含選自以下的至少一種酶或多肽類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。
133.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述類咕啉蛋白由選自以下的基因編碼 mtaC、mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC3 0
134.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaA、mtaAl和mtaA2。
135.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由基因acsE編碼。
136.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述類咕啉鐵硫蛋白由基因acsD編碼。
137.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述鎳蛋白裝配蛋白由選自以下的至少一種基因編碼acsF禾口 cooC。
138.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述鐵氧還蛋白由基因orf7編碼。
139.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述乙酰-CoA合成酶由選自以下的至少一種基因編碼acsB禾口 acsC。
140.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述一氧化碳脫氫酶由基因acsA編碼。
141.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶由選自以下的基因編碼por和ydbK。
142.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述氫化酶由選自以下的至少一種基因編碼hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179> moth_2180> moth_2181 > hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、 moth_1453 禾口 moth_1454。
143.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，還包括由基因acsEps編碼的多肽AcsEps。
144.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，還包括由選自以下的基因編碼的至少一種酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
145.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，還包括甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。
146.根據(jù)權(quán)利要求145所述的方法，其中所述甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
147.根據(jù)權(quán)利要求145所述的方法，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)甲醇和 CO, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成氣體，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成氣體。
148.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述有機(jī)體還包含甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
149.根據(jù)權(quán)利要求148所述的方法，其中所述甲酸酯脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073U chy_0732 和 chy_0733。
150.根據(jù)權(quán)利要求148所述的方法，其中所述甲酰四氫葉酸合成酶由選自以下的基因編碼moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
151.根據(jù)權(quán)利要求148所述的方法，其中所述次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
152.根據(jù)權(quán)利要求148所述的方法，其中所述亞甲基四氫葉酸脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
153.根據(jù)權(quán)利要求148所述的方法，其中所述亞甲基四氫葉酸還原酶由選自以下的基因編碼moth_l 191、metF 和 chy_1233。
154.根據(jù)權(quán)利要求148所述的方法，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成氣體，和5)包含CO、CO2和H2的合成氣體。
155.—種產(chǎn)生1，4_ 丁二醇的方法，其包括培養(yǎng)具有1，4_ 丁二醇途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體，所述途徑包含編碼1，4_ 丁二醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生1，4-丁二醇的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生1，4-丁二醇，所述1，4-丁二醇途徑包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)、1，4- 丁二醇脫氫酶；所述有機(jī)體還包含具有編碼乙酰-CoA途徑酶的至少一種外源核酸的乙酰-CoA 途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑酶包括類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-CoA合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。
156.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述乙酰乙酰-CoA硫解酶由選自以下的基因編碼atoB、thlA、thlB 禾口 erg 10。
157.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述3-羥基丁酰-CoA脫氫酶由選自以下的基因編碼hbd、msed_1423、msed_0399、msed_0389 禾口 msed_1933。
158.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述巴豆酸酶由選自以下的基因編碼crt、 paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF 禾口 paaG。
159.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述巴豆酰-CoA水合酶由選自以下的基因編碼abfD、msed_1321 禾口 msed_1220。
160.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)由選自以下的基因編碼adhE、adhE2、mcr、rcas_2929、napl_02720 和 mgp2080_005;35。
161.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述4-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型) 由選自以下的基因編碼acrl、sucD、bphG、msed_0709、mcr、asd-2 禾口 saci_2370。
162.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述1，4-丁二醇脫氫酶由選自以下的基因編 5 :alrA,adh2,yqhD,bdh I、bdh II 禾口 4hbd。
163.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述類咕啉蛋白由選自以下的基因編碼 mtaC、mtaCl、mtaC2 禾口 mtaC3 0
164.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaA、mtaAl和mtaA2。
165.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述甲基四氫葉酸類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶由基因acsE編碼。
166.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述類咕啉鐵硫蛋白由基因acsD編碼。
167.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述鎳蛋白裝配蛋白由選自以下的至少一種基因編碼acsF禾口 cooC。
168.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述鐵氧還蛋白由基因orf7編碼。
169.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述乙酰-CoA合成酶由選自以下的至少一種基因編碼acsB禾口 acsC。
170.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述一氧化碳脫氫酶由基因acsA編碼。
171.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述丙酮酸酯鐵氧還蛋白氧化還原酶由選自以下的基因編碼por和ydbK。
172.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述氫化酶由選自以下的至少一種基因編碼hypA、hypB、hypC、hypD、hypE、hypF、moth_2175、moth_2176、moth_2177、moth_2178、 moth_2179、moth_2180、moth_2181、hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、hycl、 hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfl、hyfj、hyfR、moth_2182、moth_2183、 moth_2184、moth_2185、moth_2186、moth_2187、moth_2188、moth_2189、moth_2190、 moth_2191、moth_2192、moth_0439、moth_0440、moth_0441、moth_0442、moth_0809、 moth_0810、moth_0811、moth_0812、moth_0813、moth_0814、moth_0815、moth_0816、 moth_1193、moth_1194、moth_1195、moth_1196、moth_1717、moth_1718、moth_1719、 moth_1883、moth_1884、moth_1885、moth_1886、moth_1887、moth_1888、moth_1452、 moth_1453 禾口 moth_1454。
173.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，其中所述有機(jī)體還包含由基因acsEps編碼的多肽 AcsEps0
174.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，還包括由選自以下的基因編碼的至少一種酶或多月太codh、codh-I、cooF、hypA、cooH、cooU、cooX、cooL、cooK、cooM、cooT、cooj 禾口 codh-IL·
175.根據(jù)權(quán)利要求155所述的方法，還包括甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。
176.根據(jù)權(quán)利要求175所述的方法，其中所述甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的基因編碼mtaB、mtaBl、mtaB2 禾口 mtaB3。
177.根據(jù)權(quán)利要求175所述的方法，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)甲醇和 C0, 2)甲醇、CO2和H2, 3)甲醇、0)、0)2和!12，4)甲醇和包含CO和H2的合成氣體，和5)甲醇和包含CO、CO2和吐的合成氣體。
178.—種產(chǎn)生1，4_ 丁二醇的方法，其包括培養(yǎng)具有1，4_ 丁二醇途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體，所述途徑包含編碼1，4_ 丁二醇途徑酶的至少一種外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生1，4-丁二醇的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生1，4-丁二醇，所述1，4-丁二醇途徑包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)、1，4- 丁二醇脫氫酶；所述有機(jī)體還包含具有編碼乙酰-CoA途徑酶的至少一種外源核酸的乙酰-CoA 途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-CoA，所述乙酰-CoA途徑酶包括乙酰-CoA合成酶、甲酸酯脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。
179.根據(jù)權(quán)利要求178所述的方法，其中所述甲酸酯脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_2312、moth_2313、moth_2314、sfum_2703、sfum_2704、sfum_2705、sfi ι m_2706、 chy_073Uchy_0732 和 chy_0733。
180.根據(jù)權(quán)利要求178所述的方法，其中所述甲酰四氫葉酸合成酶由選自以下的基因編碼moth_0109、chy_2385 禾口 fhs。
181.根據(jù)權(quán)利要求178所述的方法，其中所述次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
182.根據(jù)權(quán)利要求178所述的方法，其中所述亞甲基四氫葉酸脫氫酶由選自以下的基因編碼moth_1516、folD 和 chy_1878。
183.根據(jù)權(quán)利要求178所述的方法，其中所述亞甲基四氫葉酸還原酶由選自以下的基因編碼moth_l 191、metF 和 chy_1233。
184.根據(jù)權(quán)利要求178所述的方法，其中所述有機(jī)體利用選自以下的原料1)C0，2) CO2和H2, 3) CO和CO2,4)包含CO和H2的合成氣體，和5)包含CO、CO2和H2的合成氣體。
全文摘要
一種示例性非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含編碼異丙醇途徑酶的至少一種外源核酸的異丙醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生異丙醇，異丙醇途徑酶包括琥珀酰-CoAL3-酮酸-CoA轉(zhuǎn)移酶。另一種有機(jī)體具有包含至少一種外源核酸的4-羥基丁酸酯途徑，包含乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶和4-羥基丁酸酯激酶。一種具有1，4-丁二醇途徑的示例性有機(jī)體包括乙酰乙酰-CoA硫解酶、3-羥基丁酰-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-CoA水合酶、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成型)、4-羥基丁酰-CoA還原酶(醛形成型)和1，4-丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還包括乙酰-CoA途徑。上述有機(jī)體中的任一種被培養(yǎng)以產(chǎn)生異丙醇、4-羥基丁酸酯或1，4-丁二醇。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102307986SQ200980156147
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2009年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月16日
發(fā)明者A·P·博加德, M·J·伯克, 約翰·D·特拉威克 申請(qǐng)人:基因組股份公司