一株米曲霉菌株及其產(chǎn)生的蛋白酶應(yīng)用于酵母抽提物生產(chǎn)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)蛋白酶米曲霉菌株及其產(chǎn)生的蛋白酶在酵母抽提物生產(chǎn)中的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。所述的米曲霉Aspergillus oryzae HGD12菌株已于2016年05月03日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：CCTCC NO：M 2016243，該米曲霉HGD12菌株高產(chǎn)蛋白酶，其酸性蛋白酶活大于1000 U/g，堿性蛋白酶活大于10000 U/g，中性蛋白酶活大于9000 U/g。將米曲霉HGD12菌株產(chǎn)蛋白酶用于面包酵母生產(chǎn)酵母抽提物，可明顯增加酵母抽提物產(chǎn)品中鮮味氨基酸含量，其中谷氨酸含量大于6.5%、天冬氨酸含量大于3.0%、丙氨酸含量大于5.0%、甘氨酸含量大于1.0%，可明顯改善酵母抽提物的調(diào)味功能。CCTCC NO：M 201624320160503
【專利說明】
一株米曲霉菌株及其產(chǎn)生的蛋白酶應(yīng)用于酵母抽提物生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一株高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉菌株HGD12及其產(chǎn)生的蛋白酶在酵母抽提物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]酵母抽提物(Yeastextract)又稱酵母味素，是以蛋白質(zhì)含量豐富的食用酵母細(xì)胞為原料，經(jīng)過細(xì)胞自溶或酶解工藝，將酵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等進(jìn)行降解，并進(jìn)一步通過離心、濃縮、干燥等加工處理，制備成的營(yíng)養(yǎng)性鮮味劑和風(fēng)味增強(qiáng)劑。其主要成分包括多肽、游離氨基酸、核苷酸以及少量B族維生素和礦物元素等，其中的呈味氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸等可賦予酵母抽提物的特殊鮮味。酵母抽提物的生產(chǎn)涉及酵母菌種選育、酶解工藝、濃縮與干燥等技術(shù)，其中蛋白酶酶解工藝是其生產(chǎn)中的關(guān)鍵一環(huán)，是決定酵母抽提物品質(zhì)的主要工藝。
[0003]很多微生物都可以產(chǎn)生蛋白酶，但生產(chǎn)調(diào)味品用蛋白酶的微生物必須是安全的。因此，食品用蛋白酶生產(chǎn)菌株應(yīng)限于傳統(tǒng)食品加工用微生物和確認(rèn)無害的微生物菌株。米曲霉(dSjOergiDus oiyzae)屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、從梗孢科，是曲霉屬真菌中的一個(gè)常見種。它是一種好氧微生物，能夠自身分泌多種酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶等，其中最主要的是蛋白酶。米曲霉在食品、飼料、醬油、釀酒等食品發(fā)酵行業(yè)廣泛應(yīng)用，已有1000多年的安全生產(chǎn)歷史，已被美國(guó)FDA和WHO認(rèn)定為安全生產(chǎn)菌株(GRAS)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供一株高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉菌株
oryzae HGD12)，保藏編號(hào):CCTCC Ν0:Μ 2016243，保藏時(shí)期:2016年05月03日，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)武漢武昌珞珈山武漢大學(xué)。
[0005]米曲霉菌株HGD12菌落呈圓形，質(zhì)地疏松，菌落生長(zhǎng)初期小、白色、圓形，隨著菌落的逐漸長(zhǎng)大，白色范圍也逐漸擴(kuò)大，菌絲層變厚，菌落的中心開始著生淺黃綠色的孢子，然后淺黃綠色逐步向四周擴(kuò)散;菌落成熟后孢子呈黃綠色，孢子粗壯，菌絲層厚。
[0006]本發(fā)明的目的之二是提供米曲霉菌株HGD12產(chǎn)生的蛋白酶，該蛋白酶生產(chǎn)方法如下:
(1)將斜面上的米曲霉HGD12接種2-3環(huán)到麩皮培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方為:麩皮100份，水100份)中，30°C培養(yǎng)2 d，得到種曲孢子；
(2)將培養(yǎng)好的步驟(I)種曲孢子按照質(zhì)量濃度0.25-1.0%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:麩皮80份，豆柏粉20份，水100份)中，混合均勻，培養(yǎng)溫度300C，培養(yǎng)時(shí)間2_3 d；
(3)按照1:50(w/v)的料液比，將10-30mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0-7.4)加入步驟(2)已發(fā)酵好的培養(yǎng)基內(nèi)，30-40°C浸提1-2 h，攪拌，過濾，得上清液，上清液用質(zhì)量體積濃度40-50%的(NH4)2SO4溶液鹽析，棄上清，用與上述等量的10-30 mmol/L磷酸緩沖液溶解沉淀，制得米曲霉菌株HGD12的蛋白酶粗酶液。
[0007]本發(fā)明的目的之三是將米曲霉菌株HGD12產(chǎn)生的蛋白酶用于酵母抽提物的生產(chǎn)中，具體步驟如下:
(I)配制質(zhì)量體積濃度12-18%%的面包酵母乳，添加體積濃度0.5-1%的促溶劑，促溶劑為乙酸乙酯或食鹽，調(diào)pH到5.0左右，溫度50-60 0C，自溶6-8 h，得酵母自溶液；
(2 )調(diào)節(jié)步驟(I)的酵母自溶液pH為5-8，加入體積濃度1-3%的米曲霉HGD12粗酶液，控制溫度，酶解6-10 h，得酶解液；
(3)按照酵母抽提物常規(guī)生產(chǎn)方法，滅酶，高速離心，濃縮，干燥，得到酵母抽提物產(chǎn)品。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的有益效果:本發(fā)明提供了一株高效米曲霉HGD12菌株，具有較高的蛋白酶酶活，將米曲霉HGD12產(chǎn)蛋白酶用于酵母生產(chǎn)酵母抽提物，可明顯增加酵母抽提物中鮮味氨基酸的含量，改善酵母抽提物的調(diào)味功能，并提高氨基氮含量和酵母抽提物得率。
【附圖說明】
[0009]圖1為米曲霉菌株HGD12的菌落形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于實(shí)施例所述的范圍，凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011]實(shí)施例1:米曲霉HGD12菌落形態(tài)
米曲霉菌株HGD12從農(nóng)家自釀豆醬中，經(jīng)過大量的復(fù)壯、分離、純化獲得。
[0012]米曲霉菌株HGD12菌落呈圓形，質(zhì)地疏松，菌落生長(zhǎng)初期小、白色、圓形，隨著菌落的逐漸長(zhǎng)大，白色范圍也逐漸擴(kuò)大，菌絲層變厚，菌落的中心開始著生淺黃綠色的孢子，然后淺黃綠色逐步向四周擴(kuò)散;菌落成熟后孢子呈黃綠色，孢子粗壯，菌絲層厚，如圖1。
[0013]實(shí)施例2:米曲霉菌株HGD12產(chǎn)蛋白酶制備
(I)將活化好的斜面米曲霉HGD12接種3環(huán)到麩皮培養(yǎng)基(麩皮100份，水100份)中，30°C培養(yǎng)2 d，得到種曲孢子；
(2 )將步驟(I)培養(yǎng)好的種曲孢子按照質(zhì)量濃度0.5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(麩皮80份，豆柏粉20份，水100份)中，混合均勻，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間48 h;
(3)按照發(fā)酵培養(yǎng)基與磷酸緩沖液的重量體積比1:50加入20 mmol/L磷酸緩沖液(PH7.4)到已發(fā)酵好的步驟(2)的培養(yǎng)基內(nèi)，40°C浸提I h，攪拌，過濾，得上清液，上清液用質(zhì)量體積濃度40%的(NH4)2SO4溶液鹽析，棄上清，再用20 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.4)溶解沉淀，得米曲霉菌株HGD12的蛋白酶粗酶液；
(4)采用福林-酚法測(cè)定蛋白酶活力，在pH為3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液體系中測(cè)得米曲霉HGD12菌株酸性蛋白酶活大于1000 U/g(發(fā)酵基質(zhì))；在pH為10.0的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液體系中測(cè)得米曲霉HGDl 2菌株堿性蛋白酶活大于10000 U/g(發(fā)酵基質(zhì))；在pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液體系中測(cè)得米曲霉HGD12菌株中性蛋白酶活大于9000 U/g(發(fā)酵基質(zhì))。
[0014]實(shí)施例3:米曲霉菌株HGDl2產(chǎn)酸性蛋白酶在酵母抽提物生產(chǎn)中的應(yīng)用 (1)配制質(zhì)量體積濃度15%的面包酵母乳，添加體積濃度0.5%的促溶劑，促溶劑為乙酸乙酯，調(diào)PH到5.0，溫度55 °C，自溶8 h，得酵母自溶液；
(2)調(diào)節(jié)步驟(I)的酵母自溶液pH到5.5，加入體積濃度2.0%米曲霉HGD12粗酶液，溫度55°C，酶解10 h，得酶解液；
(3)按照酵母抽提物常規(guī)生產(chǎn)方法，滅酶，高速離心，濃縮，干燥，得到酵母抽提物產(chǎn)品。
[0015](4)品質(zhì)檢測(cè):酵母抽提物得率58%(w/w)，產(chǎn)品中氨基氮含量5.18%(w/w)，其中谷氨酸含量6.4%(w/w)、天冬氨酸含量2.l%(w/w)、丙氨酸含量5.2%(w/w)、甘氨酸含量0.9%(w/
W) O
[0016]實(shí)施例4:米曲霉菌株HGDl 2產(chǎn)堿性蛋白酶在酵母抽提物生產(chǎn)中的應(yīng)用
(1)配制質(zhì)量體積濃度15%的面包酵母乳，添加體積濃度0.5%的促溶劑，促溶劑為乙酸乙酯，調(diào)PH到5.0，溫度55 °C，自溶8 h，得酵母自溶液；
(2)調(diào)節(jié)步驟(I)的酵母自溶液pH到8.0，加入體積濃度1.0 %米曲霉HGD12粗酶液，溫度37°C，酶解8 h，得酶解液；
(3)按照酵母抽提物常規(guī)生產(chǎn)方法，滅酶，高速離心，濃縮，干燥，得到酵母抽提物產(chǎn)品；
(4)品質(zhì)檢測(cè):酵母抽提物得率54%(w/w)，產(chǎn)品中氨基氮含量5.21%(w/w)，其中谷氨酸含量6.5%(w/w)、天冬氨酸含量3.l%(w/w)、丙氨酸含量5.2%(w/w)、甘氨酸含量1.0%(w/w)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一株米曲霉菌株，其特征在于:該菌株為米曲霉Aspergillusoryzae HGD12，已于2016年05月03日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC N0:M2016243，所述的米曲霉AspergiIIus oryzae HGDl2高產(chǎn)蛋白酶，其酸性蛋白酶活大于1000U/g，堿性蛋白酶活大于10000U/g，中性蛋白酶活大于9000U/g。2.—種如權(quán)利要求1所述的一株米曲霉HGD12菌株產(chǎn)生的蛋白酶在酵母抽提物生產(chǎn)中的應(yīng)用，包括如下步驟: (1)將斜面上的米曲霉HGD12接種到麩皮培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)2d，得種曲孢子； (2)將步驟(I)的種曲孢子按照質(zhì)量濃度0.25-1.0%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，混合均勻，培養(yǎng)溫度30 °C，培養(yǎng)時(shí)間2-3d; (3)按照發(fā)酵培養(yǎng)基與磷酸緩沖液的重量體積比1:50將10-3011111101/1磷酸緩沖液加入步驟(2)的培養(yǎng)基內(nèi)，30-40 0C浸提1-2h，攪拌，過濾，得上清液，上清液用質(zhì)量體積濃度40-50%的(NH4)2SO4溶液鹽析，棄上清，再用10-30mmol/L磷酸緩沖液溶解沉淀，制得米曲霉菌株HGDl 2的蛋白酶粗酶液； (4)配制質(zhì)量體積濃度12-18%的酵母乳，添加體積濃度0.5-1 %的促溶劑，促溶劑為乙酸乙酯或食鹽，調(diào)pH到5.0左右，溫度50-60 °C，自溶6-8h，得酵母自溶液； (5)調(diào)節(jié)步驟(4)的酵母自溶液pH為5-8，加入體積濃度1-3%的米曲霉HGD12粗酶液，控制溫度，酶解6-1 Oh，得酶解液； (6)按照酵母抽提物常規(guī)生產(chǎn)方法，滅酶，高速離心，濃縮，干燥，得到酵母抽提物產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】A23L29/00GK105950481SQ201610371279
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月30日
【發(fā)明人】陳雄, 王志, 代俊, 李欣
【申請(qǐng)人】湖北工業(yè)大學(xué)