一種梅毒螺旋體熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及熒光PCR檢測(cè)試劑盒領(lǐng)域，更具體涉及梅毒螺旋體熒光PCR檢測(cè)試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 梅毒螺旋體（Treponema Pallidum，TP)是引起梅毒疾病的一種病原體，其可經(jīng)血 液傳播。近年來(lái)發(fā)病呈逐年遞增趨勢(shì)，根據(jù)其傳播途徑可分為后天獲得性梅毒和先天性梅 毒。根據(jù)其病程和臨床表現(xiàn)又可將后天獲得性梅毒分為包含一期、二期的早期梅毒和三期 晚期梅毒，選擇好的檢測(cè)方法有利于早期梅毒的診斷和治療。對(duì)于早期梅毒的診斷則值得 關(guān)注，因部分病例的臨床癥狀不典型，抗體出現(xiàn)時(shí)間較晚，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的特異性、 靈敏度均低，勢(shì)必會(huì)帶來(lái)一些樣本的漏檢。如何及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷出早期梅毒，對(duì)于梅毒的 防治具有重要意義。
[0003] 目前梅毒螺旋體的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有快速血漿反應(yīng)素試驗(yàn)（RPR)、甲苯胺紅 快速反應(yīng)素試驗(yàn)（TRUST)、梅毒螺旋體ELISA試驗(yàn)（EUSA)、梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)（TPHA)和 梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA)等，RPR和TRUST檢測(cè)非特異性的抗心磷脂抗體，特異性和 靈敏度都比較差；梅毒螺旋體ELISA試驗(yàn)（ELISA)、梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)（TPHA)和梅毒螺 旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA)等雖然在特異性和靈敏度方面具有優(yōu)勢(shì)，但是無(wú)法區(qū)分既往感 染和當(dāng)前感染，不利于臨床的診斷及治療。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)漸漸顯現(xiàn)了其在檢測(cè)上 的優(yōu)勢(shì)，目前認(rèn)為PCR技術(shù)是檢測(cè)TP DNA最佳方法。熒光PCR技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)并 結(jié)合光譜技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的一種更靈敏，更特異，更精確的核酸檢測(cè)技術(shù)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確， 重復(fù)性高，能動(dòng)態(tài)反應(yīng)患者治療前、后病原體動(dòng)態(tài)變化及與臨床的關(guān)系，且整個(gè)過(guò)程中避免 了傳統(tǒng)PCR需后處理的問(wèn)題，減少了污染。大量研宄表明用PCR技術(shù)檢測(cè)TP DNA的陽(yáng)性率 遠(yuǎn)高于其他檢測(cè)技術(shù)，是當(dāng)今用于TP感染診斷最常用的有力工具，且能更好的應(yīng)用于TP致 病機(jī)理的研宄之中。
[0004] 結(jié)合國(guó)內(nèi)情況，在臨床梅毒螺旋體感染的實(shí)驗(yàn)診斷中，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)憑借著 快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)顯示出了其臨床診斷的優(yōu)越性，目前已有多家熒光PCR診斷試劑盒 在臨床TP感染診斷中常規(guī)使用，但是缺乏完善的質(zhì)控體系，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù) 水平，使此類產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確診斷的需要。運(yùn)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)主要涉及到兩個(gè) 方面，核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測(cè)。
[0005] 目前國(guó)內(nèi)臨床上主要采用煮沸法對(duì)梅毒螺旋體的核酸進(jìn)行提?。合葘⒎置谖飿颖?濃縮、洗滌，再加裂解液，煮沸，高速離心，取上清為模板。對(duì)于濃縮這一步，不同廠家的濃縮 效果不一樣，有的可以看到沉淀，有的無(wú)法看到，看得到沉淀的是因?yàn)閷⒉≡w與蛋白都濃 縮了，這樣，導(dǎo)致后面加入裂解液時(shí)很難充分混勻；無(wú)法看到沉淀的，則使操作者無(wú)法確定 吸棄上清時(shí)會(huì)不會(huì)吹打到病原體核酸。
[0006] 臨床上檢測(cè)TP-DNA的方法目前主要是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)及其改進(jìn)，實(shí) 時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置 的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集 檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映 PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn) 結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)（即Ct值） 以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰陽(yáng)性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或 標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值（即定量檢 測(cè)）。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅 基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效 應(yīng)；如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被Taq酶水解切 斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā) 出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈 現(xiàn)線性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可以通過(guò)熒光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽(yáng)性 結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸 取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0007] 國(guó)內(nèi)已有多種基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)TP-DNA的試劑盒應(yīng)用于臨床 檢測(cè)中，這些試劑盒所提供的TP-DNA提取方法主要是煮沸法。因此，其核酸提取過(guò)程較復(fù) 雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)，經(jīng)過(guò)煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本 中的DNA存在損耗，尤其對(duì)于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會(huì)造成DNA的大量丟 失導(dǎo)致樣本定量偏低；同時(shí)由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污 染。此外，這些試劑盒中的熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)TP-DNA的引物、探針序列的選擇同 樣也會(huì)影響最終檢測(cè)的特異性和靈敏度。
[0008] 正因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)中的核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測(cè)步驟的缺陷使得現(xiàn)有技術(shù)中 的TP-DNA檢測(cè)靈敏度不高，約在500?lOOOcopies/ml左右。因此，本領(lǐng)域需要解決現(xiàn)有梅 毒螺旋體熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的缺陷，提供一種操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、 檢測(cè)范圍寬的梅毒螺旋體熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 因此，本發(fā)明提供一種梅毒螺旋體熒光PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核 酸釋放劑和含用于靶核苷酸檢測(cè)的引物、探針序列的PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包括 0.01?0.5臟〇1/1的莎梵婷、50?200臟〇1/1的氯化鉀、質(zhì)量百分含量為0.01%?2%的 十二烷基磺酸鈉和體積百分含量為0. 05%?1%的乙醇。本發(fā)明中，所述核酸釋放劑的溶 劑例如選自TE緩沖液、無(wú)菌水和無(wú)菌生理鹽水。
[0010] 在一種【具體實(shí)施方式】中，所述用于靶核苷酸檢測(cè)的引物序列為，
[0011] 上游引物：5 ' -GACTGACCCAAGCGTTACTAAGATG-3 '，
[0012] 下游引物：5' -CCCTCGACTGCTTCAAACTTAATC-3'。
[0013] 所述用于靶核苷酸檢測(cè)的探針序列為5' -CCCCGTCCTCTCCCAAATCCTGA-3'。
[0014] 本發(fā)明提供的梅毒螺旋體熒光PCR檢測(cè)試劑盒操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度 高、檢測(cè)范圍寬。應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)皮損處滲液、生殖道分泌物等未知樣本中的TP-DNA 進(jìn)行快速檢測(cè)，為診斷TP感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0015] 優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)及在所述PCR反應(yīng)液中還包含有內(nèi)標(biāo)的引物探 針序列，內(nèi)標(biāo)序列為：5' -TAGGCAGTTCCCACGGACCCTTAGACGGCAITTAITTAACGTACGAAGAAACATGT CCCCTTGTGGCTATTATTCAAAGTGGAGAAACAGGGATCGA-3 '，
[0016] 內(nèi)標(biāo)的上游引物序列為：5' -ACCCTTAGACGGCATTTATT-3'，
[0017] 內(nèi)標(biāo)的下游引物序列為：5' -GTTTCTCCACTTTGAATAA-3'，
[0018] 內(nèi)標(biāo)的探針序列為：5' -AACGTACGAAGAAACATGTCCCCTTG-3'。
[0019] 本發(fā)明中的試劑盒設(shè)置了陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照（即內(nèi)標(biāo)），因此有效地監(jiān)控了假陰性。
[0020] 在一種【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中還包括TP定量參考品，所述TP定量參考 品包括A、B、C、D四個(gè)濃度的TP強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒溶液，溶液A中強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒的濃度為1. 00? 5. 00E+07copies/ml，溶液B中強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒的濃度為1. 00?5. 00E+06copies/ml，溶液C中 強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒的濃度為1. 00?5. 00E+05C〇pieS/ml，溶液D中強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒的濃度為1. 00? 5. 00E+04C〇pieS/ml。TP定量參考品的設(shè)置使得本發(fā)明所述梅毒螺旋體熒光PCR檢測(cè)試劑 盒在做定性檢測(cè)的同時(shí)還能做定量檢測(cè)。
[0021] 在另一種【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中還包括預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的酶混合液， 所述酶混合液中包括耐熱DNA聚合酶IU/ μ 1?5U/ μ 1和尿嘧啶DNA糖基化酶0. 05U/ μ 1?0. 2U/ μ 1 ;且在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。酶混合液的設(shè)置使得本發(fā)明的試劑 盒對(duì)梅毒螺旋體的檢測(cè)能更為準(zhǔn)確。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明，但下述實(shí)施例并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 本實(shí)施例提供本發(fā)明所述的一種梅毒螺旋體熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。所述試劑 盒中包括如下獨(dú)立包裝的組分：
[0025] ①核酸釋放劑：莎梵婷（surfactin) 0· 01?0· 5mmol/L，氯化鉀（KCl) 50? 200臟〇1/1，十二烷基磺酸鈉（505)0.01%?2%(質(zhì)量百分含量），乙醇0