于含氨芐青霉素的50mL LB培養(yǎng)基250mL搖瓶中，30°C，200rpm，振蕩培養(yǎng)14h。取過(guò) 夜培養(yǎng)物ImL轉(zhuǎn)接入含氨芐青霉素的50mL LB培養(yǎng)基中，30°C，200rpm，培養(yǎng)至OD 600約為 0. 2左右，加 ImL L-阿拉伯糖使其終濃度為30mM。繼續(xù)30°C 200rpm培養(yǎng)至OD 600約為 0. 5-0. 6。將細(xì)菌培養(yǎng)物至于冰水混合物中驟冷15min，用甘油法制備大腸桿菌LG-02電轉(zhuǎn) 化感受態(tài)細(xì)胞。
[0218] 2)重組片段3電轉(zhuǎn)化大腸桿菌LG-02。將0. 2cm Bio-Rad電擊杯與大腸桿菌LG-02 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞置于冰上。100 μ L感受態(tài)細(xì)胞，加入1. 5 μ L重組片段2,冰上放置5min。 將混合液加入預(yù)冷的電擊杯，冰浴lOmin。使用MicroPulser(Bio-Rad)電穿孔儀，電擊參 數(shù)為2. 5KV，200Q，25uF。電擊后迅速加入ImL 37°C保溫的LB培養(yǎng)基，將混合液吸出，轉(zhuǎn)移 至丨J I. 5mL的離心管中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)3h，去除質(zhì)粒pKD46。將菌液轉(zhuǎn)移至50mL含 10 %蔗糖的無(wú)鹽LB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)18h后，稀釋涂布10 %無(wú)鹽LB固體 培養(yǎng)基，37°C 12h。挑取單菌落，提基因組PCR驗(yàn)證正確（正確的菌落基因組擴(kuò)增片段大小 在3400bp左右）。挑取一個(gè)正確的菌落，將其命名為L(zhǎng)G-MS。
[0219] 驗(yàn)證引物：
[0220] 驗(yàn)證-S :5' -TGAATTTTTCAATATCGCCATAGCT-3'
[0221] 驗(yàn)證-A : 5 ' -GGCTACTTTCTTCATTGTGGTTCTC-3 '
[0222] PCR 反應(yīng)體系：PrimeSTAR.?:: HS (Premix) 25 μ L，驗(yàn)證-S 0· 3 μ L，驗(yàn)證-A 0· 3 μ L， 大腸桿菌LG-MS基因組0. 4 μ L，ddH20 24 μ L。
[0223] PCR 反應(yīng)條件：98°C 10s，60°C 15s，72°C 4min，循環(huán) 30 次；72°C 7min，4°C保溫。
[0224] 實(shí)施例4高密度發(fā)酵實(shí)施利3中的基因工程菌-重組大腸桿菌LG-MS生產(chǎn) meso-2, 3- 丁二醇菌株：大腸桿菌MG1655、大腸桿菌LG-MS ;
[0225] 種子培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨10 ;酵母膏5 ;NaCl 10。
[0226] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖 80、K2HPO4 · 3H20 13. 7、KH2PO4 2. 0、（NH4)2HPO4 3. 3、 (NH4)2S046. 6、MgSO4 · 7H20 0· 25、FeSO4 · 7H20 0· 05、ZnSO4 · 7H20 0· 01、MnSO4 · H2O 0· 01、 CaCl2 0. OUEDTA 0. 05。
[0227] 發(fā)酵條件：
[0228] 種子液的制備：甘油管保藏的菌種轉(zhuǎn)接新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37°C、200rpm活化 16h ;接1環(huán)活化的菌種劃線于具有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12h ;從新鮮平 板上挑取單菌落至裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37°C、200rpm條件下培養(yǎng)12h， 作為一級(jí)種子 ；再將一級(jí)種子液以5%的接種量接至另一5〇1111725〇1^種子培養(yǎng)基，371：、 200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為二級(jí)種子。
[0229] 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：利用5L發(fā)酵罐進(jìn)行批次發(fā)酵時(shí)，以10% (v/v)的接種量將二級(jí) 種子液接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基中。培養(yǎng)時(shí)，5L發(fā)酵罐裝液量為3L，初始pH為7. O ;通氣量和攪 拌轉(zhuǎn)速分別為I. 5vvm、400rpm。發(fā)酵時(shí)間依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)而定，以葡萄糖被耗盡或濃度不再降 低作為發(fā)酵終點(diǎn)。
[0230] 檢測(cè)條件：
[0231] 采用高效液相色譜法（HPLC)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物。日本島津高效液相色 譜儀LC-20A，RID-IOA示差折光檢測(cè)器，Aminex HPX-87H色譜柱，柱溫為65°C，流動(dòng)相為 0· 005M H2SO4,流速為 0· 6mL/min。
[0232] 結(jié)果：
[0233] 采用高效液相色譜法分析測(cè)定大腸桿菌MG1655與重組大腸桿菌LG-R在發(fā)酵罐階 段各產(chǎn)物。原始菌大腸桿菌MG1655中乙酸產(chǎn)量高達(dá)23. 55g/L，而重組大腸桿菌LG-R中的 乙酸含量只有〇. 53g/L，而（meso) -2, 3- 丁二醇含量則達(dá)到26. 5g/L。
[0234] 實(shí)例5 :實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)PHB和（R，R) -2, 3- 丁二醇的基因工程菌的構(gòu)建
[0235] 以質(zhì)粒 pBHR68(記載于文獻(xiàn) Spiekermann P, Rehm B H A, Kalscheuer Rj Baumeister D，SteinbUchel A. A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds[J]. Archives of microbiology, 1999, 171 (2) :73-80.)為模板，用引物 5'-TACGAGCTC(SacI) AAGGAGGATGGCGACCGGCAAACG-3，和引物5'-CGCGGATCC(BamHI)CGGCAGGTCAGCCCATAT-3' 擴(kuò)增出PHB合成操縱子基因 phbCAB，經(jīng)過(guò)SacI和BamHI酶切處理后，插入到質(zhì)粒 pTrcAlperOK購(gòu)買于江蘇天凱生物技術(shù)有限公司）啟動(dòng)子下游多克隆位點(diǎn)間，得到質(zhì)粒 pTrcAlperOl-phbCAB。
[0236] 分別制備大腸桿菌MG1655和大腸桿菌LG-R電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將質(zhì)粒 pTrcAlperOl-phbCAB分別電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MG1655和大腸桿菌LG-R。電轉(zhuǎn)化方法：將 0.2cm Bio-Rad電擊杯與電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞置于冰上。100 μ L感受態(tài)細(xì)胞，加入1.5 μ L質(zhì) 粒pTrcAlperOl-phbCAB,冰上放置5min。將混合液加入預(yù)冷的電擊杯，冰浴lOmin。使用 MicroPulser(Bio-Rad)電穿孔儀，電擊參數(shù)為2. 5KV，200Q，25uF。電擊后迅速加入ImL 37°C保溫的LB培養(yǎng)基，將混合液吸出，轉(zhuǎn)移到I. 5mL的離心管中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng) lh，涂含有氨芐青霉素的LB平板。過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取10個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)接含氨芐青霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基，提質(zhì)粒篩選、測(cè)序驗(yàn)證，phbCAB基因序列如SEQ ID NO: 12所示，得到重組工 程菌大腸桿菌 MG1655/pTrcAlper01_phbCAB 和大腸桿菌 LG-R/pTrcAlperOl-phbCAB。
[0237] 實(shí)施例6高密度發(fā)酵實(shí)施例5中的基因工程菌聯(lián)產(chǎn)PHB和（R，R) -2, 3- 丁二醇
[0238] 菌株：原始菌大腸桿菌MG1655/pTrcAlper01-phbCAB和重組工程菌大腸桿菌 LG-R/pTrcAlper01-phbCAB ：
[0239] 種子培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨10 ;酵母膏5 ;NaCl 10 ;氨節(jié)青霉素50mg/mL ;
[0240] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖 80 ;KH2P04 2. 0 ;Na2HP04 I. 0 ; (NH4)2HPO4 1. 7 ; (NH4)2SO4 4 ;MgS04 · 7H20 0· 25 ;FeS04 · 7H20 0· 05 ;ZnS04 · 7H20 0· 001 ;CoCl2 · 6H20 0· 2 ; H3BO3 0· 3 ;MnS04 · H2O 0· 001 ;CaCl2 0· 01 ;CuS04 · 5H20 0· 01 ;NiCl · 6H20 0· 02 ;氨芐青霉 素50mg/mL。發(fā)酵條件：
[0241] 種子培養(yǎng)：甘油管保藏的菌種轉(zhuǎn)接新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37°C、200rpm活化16h ; 接1環(huán)活化的菌種劃線于具有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12h ;從新鮮平板上 挑取單菌落至裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37°C、200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為 一級(jí)種子；再將一級(jí)種子液以5%的接種量接至另一 50mL/250mL種子培養(yǎng)基，37°C、200rpm 條件下培養(yǎng)12h，作為二級(jí)種子。
[0242] 發(fā)酵培養(yǎng)：
[0243] 原始菌：將二級(jí)種子液以5%的接種量接入300mL/1000mL的種子培養(yǎng)基，37°C、 200rpm條件下培養(yǎng)12h，然后以10 %的接種量轉(zhuǎn)入到裝有2. 7L培養(yǎng)基5L全自動(dòng)發(fā)酵罐 中。培養(yǎng)時(shí)，菌體生長(zhǎng)階段的pH保持在7. 0,用20 %的氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)；菌體積累PHB時(shí)pH 可保持在6. 8,用10M KOH進(jìn)行調(diào)節(jié)。人工監(jiān)測(cè)葡萄糖和硫銨濃度，菌體生長(zhǎng)時(shí)，使葡萄糖濃 度> 1 %，銨濃度>0. 2 %，并在不足時(shí)采用50 %葡萄糖溶液和25 %硫銨溶液調(diào)節(jié)。發(fā)酵培養(yǎng) 72h，每間隔4h取樣。
[0244] 重組工程菌：將二級(jí)種子液以5%的接種量接入3001111710001^的種子培養(yǎng)基， 37°C、200rpm條件下培養(yǎng)12h，然后以10%的接種量轉(zhuǎn)入到裝有2. 7L培養(yǎng)基5L全自動(dòng)發(fā) 酵罐中。培養(yǎng)時(shí)，菌體初始階段的pH控制在7.0,菌體積累PHB時(shí)pH可保持在6. 8。人工 監(jiān)測(cè)葡萄糖和硫銨濃度，菌體生長(zhǎng)時(shí)，使葡萄糖濃度>1 %，銨濃度>0. 2%，并在不足時(shí)采用 50 %葡萄糖溶液和25 %硫銨溶液調(diào)節(jié)。發(fā)酵培養(yǎng)72h，每間隔4h取樣。
[0245] 1.檢測(cè)方法：
[0246] (1)乙酸與（R，R)-2,3-丁二醇檢測(cè)方法：日本島津高效液相色譜儀LC-20A， RID-10A示差折光檢測(cè)器，Aminex HPX-87H色譜柱。柱溫為65°C，流動(dòng)相為0. 005M H2SO4, 流速為 〇. 6mL/min。
[0247] (2)PHB檢測(cè)方法：取發(fā)酵樣品12000rpm離心2min，收集沉淀細(xì)胞用蒸餾水洗滌2 次后，6000rpm離心IOmin收集細(xì)胞，烘干稱其干重。向烘干的菌體中加入150 μ L 98%硫 酸，沸水浴60min后，利用20%氨水調(diào)pH至2. 5,經(jīng)0· 22um的濾膜過(guò)濾，然后利用HPLC (高 效液相色譜）檢測(cè)。本島津高效液相色譜儀LC-20A，檢測(cè)柱（C18，BioRadLabs) ;1%的甲酸 作流動(dòng)相；紫外檢測(cè)器（紫外波長(zhǎng)為210nm)。
[0248] (3)菌體濃度測(cè)定：發(fā)酵液經(jīng)合適倍數(shù)的稀釋后，用紫外分光光度計(jì)在λ = 600nm處測(cè)吸光值，其與稀釋倍數(shù)的乘積即發(fā)酵液的菌體濃度（0D600)。
[0249] (4)細(xì)胞干重（DCW)測(cè)定：取30mL發(fā)酵液，離心收集，棄去上清。菌體于105°C烘 至恒重，測(cè)定即為細(xì)胞干重。
[0250] (5)葡萄糖濃度測(cè)定：取特定階段的發(fā)酵液ImL于1.5mL離心管中，室溫下， 12000rpm離心2min，取100 μ L上清至IOmL容量瓶，用娃哈哈水定容至10mL，然后利用生物 傳感器測(cè)定發(fā)酵液中的葡萄糖濃度，測(cè)得數(shù)值的單位為g/L。
[0251] 2.結(jié)果
[0252] 分別測(cè)定原始菌與重組大腸桿菌工程菌的菌體密度，原始菌的最高菌體密度為 82. 5g/L，重組大腸桿菌工程菌的最高菌體密度達(dá)到116. 7g/L。分別測(cè)定乙酸與PHB在原 始菌與重組大腸桿菌工程菌胞內(nèi)的積累量。在原始菌中乙酸產(chǎn)量高達(dá)20. 95g/L，在重組菌 中乙酸產(chǎn)量只有0. 54g/L ;在原始菌中PHB達(dá)到細(xì)胞干重的34. 5%，在重組菌中PHB達(dá)到 細(xì)胞干重的40. 9%，PHB產(chǎn)量增加了 18. 5%。并且，最終聯(lián)產(chǎn)的（R，R)-2, 3-丁二醇產(chǎn)量達(dá) 27. 5g/L。
[0253] 實(shí)例7實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)類人膠原蛋白和（R，R)-2, 3- 丁二醇的基因工程菌的 構(gòu)建
[0254] 以質(zhì)粒pMDHLC (購(gòu)買于江蘇天凱生物技術(shù)有限公司）為模板，用引物 5'-TACGAGCTC(SacI)ATGCTCCAGGGCACCTGCTCCGTGC-3' 和引物 5 ' -CGCGGATCC(BamHI) TTAAGGGTCTTGCGAGGTCATTCTG-3'擴(kuò)增出類人膠原蛋白合成基因 HLC，其經(jīng)過(guò)SacI和BamHI 酶切處理后，插入到質(zhì)粒pTrcAlperOK購(gòu)買于江蘇天凱生物技術(shù)有限公司）啟動(dòng)子下游多 克隆位點(diǎn)間，得到質(zhì)粒pTrcAlperOl-HLC。
[0255] 分別制備大腸桿菌MG1655和大腸桿菌LG-R電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將質(zhì)粒 PTrcAlperOl-HLC分別電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MG1655和大腸桿菌LG-R。電轉(zhuǎn)化方法：將 0.2cm Bio-Rad電擊杯與電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞置于冰上。IOOyL感受態(tài)細(xì)胞，加入1.5μ L 質(zhì)粒pTrcAlperOl-HLC，冰上放置5min。將混合液加入預(yù)冷的電擊杯，冰浴lOmin。使用 MicroPulser(Bio-Rad)電穿孔儀，電擊參數(shù)為2. 5KV，200Q，25uF。電擊后迅速加入ImL 37°C保溫的LB培養(yǎng)基，將混合液吸出，轉(zhuǎn)移到I. 5mL的離心管中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng) lh，涂含有氨芐青霉素的LB平板。過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取10個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)接含氨芐青霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基，提質(zhì)粒篩選、測(cè)序驗(yàn)證，HLC基因序列如SEQ ID NO: 13所示，得到重組工程 菌大腸桿菌 MG1655/pTrcAlper01-HLC 和大腸桿菌 LG-R/pTrcAlperOl-HLC。
[0256] 實(shí)施例8高密度發(fā)酵實(shí)施例7中的基因工程菌聯(lián)產(chǎn)類人膠原蛋白和（R，R)-2, 3-丁 二醇
[0257] 菌株：原始菌大腸桿菌MG1655/pTrcAlper01-HLC和重組工程菌大腸桿菌LG-R/ pTrcAlper01-HLC〇
[0258] 種子培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨10 ;酵母膏5 ;NaCl 10 ;氨節(jié)青霉素50mg/mL。
[0259] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖 60 ;酵母膏 60 ;K2HP04 · 3Η20 5. 8 ;NaH2P04 3. 6 ; (NH4)2HP043. 3 ； (NH4)2SO4 4. 2 ；MgS04 · 7H20 2. 0 ；FeS04 · 7H20 0. 6 ；ZnS04 · 7H20 0.2； MnSO4 · H2O 0· 2 ;CaCl2 0· 3 ;EDTA 0· 8 ;氨芐青霉素 50mg/mL。
[0260] I.發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)
[0261] 發(fā)酵條件：
[0262] 種子培養(yǎng)：甘油管保藏的菌種轉(zhuǎn)接新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37°C、200rpm活化16h ; 接1環(huán)活化的菌種劃線于具有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12h ;從新鮮平板上 挑取單菌落至裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37°C、200rpm條件下培養(yǎng)12h，作為 一級(jí)種子；再將一級(jí)種子液以5%的接種量接至另一 50mL/250mL種子培養(yǎng)基，37°C、200rpm 條件下培養(yǎng)12h，作為二級(jí)種子。
[0263] 發(fā)酵培養(yǎng)：
[0264] 原始菌：以10% (v/v)的接種量將二級(jí)種子液接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基中。培養(yǎng)時(shí)，5L 發(fā)酵罐裝液量為3L，培養(yǎng)溫度為37°C，pH由25 %的氨水自動(dòng)調(diào)節(jié)在6. 8左右。待罐中葡萄 糖即將耗盡時(shí)，開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，通過(guò)改變攪拌轉(zhuǎn)速、空氣流量以及補(bǔ)糖速率，維持比 生長(zhǎng)速率（μ)在0. 1?0.21^左右，DO為10 %?40 %飽和度。在