一種實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)2,3-丁二醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種實現(xiàn)大腸桿菌高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn) 2, 3- 丁二醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌作為第一個用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株，憑借其結(jié)構(gòu)簡單，遺傳學(xué)背景清晰，容 易培養(yǎng)，生長速度快，目標(biāo)基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強等特點，目前已成為 最為常用的原核表達(dá)系統(tǒng)。隨著代謝工程與發(fā)酵工程領(lǐng)域的研究不斷深入，利用大腸桿菌 發(fā)酵生產(chǎn)多種高附加值的高分子聚合物，如聚羥基烷酸酯和各種功能蛋白，如蛋白酶、胰島 素、類人膠原蛋白等被廣泛應(yīng)用。
[0003] 高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（high cell density cultivation,HCDC)，即高密度發(fā)酵技 術(shù)，具體是指在一定條件和培養(yǎng)體系下，利用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置提高菌體的發(fā)酵密度， 使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高，從而獲得最多的細(xì)胞量，由此更多地或更高效地獲得 目的產(chǎn)物，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率的發(fā)酵工藝。與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝相比，高密度發(fā)酵不僅可 以減少培養(yǎng)體積，強化下游分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資，從而降低生產(chǎn) 成本，提高生產(chǎn)效率，實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004] 隨著基因工程技術(shù)和高密度培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，具有高附加值的高分子聚合物、重 組蛋白的產(chǎn)量和產(chǎn)率大幅度提高，發(fā)酵成本大大降低，這為重組大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn) 提供了更為廣闊的前景。然而在重組工程菌中外源基因的高水平表達(dá)，不僅涉及宿主、載體 和克隆基因三者之間的相互關(guān)系，還與宿主菌所處的環(huán)境條件息息相關(guān)，影響其生長和外 源途徑表達(dá)的因素很多，包括傳氧能力受限，底物抑制，代謝副產(chǎn)物抑制等。其中代謝副產(chǎn) 物乙酸的抑制作用是高密度培養(yǎng)大腸桿菌所面臨的最主要的問題。乙酸的積累不僅限制了 菌體的生長，還會抑制產(chǎn)物的合成，并且乙酸的形成還會造成碳源的流失進(jìn)而降低底物轉(zhuǎn) 化率。過高的乙酸濃度，將破壞胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)定性，使胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生不可逆降解， 從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡。
[0005] 在利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)過程中，乙酸的產(chǎn)生主要由于以下幾個方面。首先，在大 腸桿菌中，糖酵解途徑和TCA循環(huán)均能產(chǎn)生輔因子NADH，在供氧充足的條件下，NADH可以完 全氧化為NAD+。然而，當(dāng)葡萄糖的消耗速率即NADH的形成速率超過了大腸桿菌攝氧上限時， NADH就會開始大量積累。NADH是檸檬酸合成酶的專一性變構(gòu)抑制劑，能夠限制乙酰輔酶A 和草酰乙酸生成檸檬酸；同時，也會抑制TCA循環(huán)中數(shù)個基因的ArcA調(diào)節(jié)系統(tǒng)受胞內(nèi)氧化 還原狀態(tài)的影響，從而使得發(fā)酵過程中乙酸大量積累。其次，在重組大腸桿菌高密度發(fā)酵過 程中，當(dāng)供氧不足或細(xì)胞生長過快時均會產(chǎn)生乙酸。在氧氣供應(yīng)充足的情況下，乙酸的形成 速率與乙酸的產(chǎn)生與細(xì)胞的比生長速率和細(xì)胞攝氧速率相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞生長過程中， 隨著比生長速率的升高，攝氧速率相應(yīng)增大，而當(dāng)比生長速率達(dá)到一定值，細(xì)胞的攝氧能力 達(dá)到上限，即使供氧充分，細(xì)胞的攝氧速率也不會再增大，從而成為生長過程中的限制性因 素，導(dǎo)致乙酸的產(chǎn)生。此外，在高密度發(fā)酵過程中，大腸桿菌快速消耗利用葡萄糖生成的較 多中間體不能及時用于細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)，過量的碳源積聚導(dǎo)致TCA循環(huán)中的乙酰輔酶 A轉(zhuǎn)化成了乙酸。
[0006] 近幾十年來各國學(xué)者針對乙酸抑制的研究顯著推動了發(fā)酵工藝的發(fā)展。在重組大 腸桿菌高密度發(fā)酵過程中，供氧不足或細(xì)胞生長過快時均會產(chǎn)生乙酸；在氧氣供應(yīng)充足的 情況下，乙酸的形成速率與細(xì)胞生長速率直接相關(guān)；同時，培養(yǎng)物的生長速率由限制性底物 的補料速率決定，所以乙酸形成速率還與補料速率直接相關(guān)。早期，人們通過改變培養(yǎng)基組 分、降低比生長速率、透析培養(yǎng)、限制性流加葡萄糖等優(yōu)化發(fā)酵方法來降低乙酸的形成。然 而，培養(yǎng)基組分的的優(yōu)化只能減緩乙酸對目的產(chǎn)物表達(dá)的負(fù)效應(yīng)，無法減少乙酸的積累，并 且組分的改變往往會增加成本，對下游純化過程也會產(chǎn)生不利影響；降低比生長速率雖然 能使乙酸減少，但同時也會延緩細(xì)胞的生長導(dǎo)致發(fā)酵周期延長；透析培養(yǎng)方法治標(biāo)不治本， 無法避免乙酸的形成，在去除乙酸過程中還會損耗部分培養(yǎng)基。
[0007] 隨著基因工程技術(shù)與代謝工程技術(shù)的不斷成熟，利用分子手段在基因水平調(diào)控工 程菌的代謝，從而控制乙酸產(chǎn)量，被廣泛應(yīng)用。控制乙酸生成采用的基因操作策略通?？?分為三種：第一種策略通過控制葡萄糖的消耗來控制乙酸生成，由于葡萄糖消耗速率的大 小與乙酸生成直接相關(guān)，可通過敲除相關(guān)基因簇來控制葡萄糖攝取速率從而直接控制乙酸 生成。第二種策略為切斷碳源流向乙酸生成或者將碳源催化生成毒害較小的物質(zhì)，該策略 主要通過對糖酵解和TCA循環(huán)中導(dǎo)致乙酸生成的代謝路徑關(guān)鍵基因的敲除，來減少乙酸產(chǎn) 生。最后一種策略是減少潛在的導(dǎo)致乙酸生成的代謝路徑，如通過減小細(xì)胞內(nèi)NADH的積 累，來減少乙酸的生成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)2, 3- 丁二醇的基因工程菌， 在利用其以葡萄糖為底物發(fā)酵時，原本流向乙酸途徑的代謝流會被消耗掉而生成毒性極低 的中性產(chǎn)物2, 3- 丁二醇，因而生成的乙酸大大地減小，同時，由于在2, 3- 丁二醇合成過程 中大量的NADH被消耗，再進(jìn)一步降低乙酸的產(chǎn)生，從而極大程度地緩解乙酸抑制對發(fā)酵的 影響，從而可以實現(xiàn)更高生物量的高密度發(fā)酵，同時還聯(lián)產(chǎn)高附加2, 3- 丁二醇。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種構(gòu)建上述實現(xiàn)大腸桿菌高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn) 2, 3- 丁二醇的基因工程菌的方法。
[0010] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述的一種實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)2, 3-丁二醇基因工 程菌，是將2, 3- 丁二醇合成途徑中三個關(guān)鍵酶編碼基因 ：α -乙酰乳酸合成酶編碼基因， α -乙酰乳酸脫羧酶編碼基因和2, 3- 丁二醇脫氫酶編碼基因整合到大腸桿菌染色體上，構(gòu) 建而成的重組菌。
[0011] 所述的2, 3- 丁二醇脫氫酶編碼基因是（R，R)-2, 3- 丁二醇脫氫酶編碼基因或 mes〇-2, 3_ 丁二醇脫氧酶編碼基因。
[0012] 上述基因工程菌的構(gòu)建方法包括具體步驟：
[0013] 1)從肺炎克雷伯氏菌分別擴增α -乙酰乳酸合成酶編碼基因和α -乙酰乳酸脫 羧酶編碼基因，從枯草芽孢桿菌擴增（R，R)-2, 3- 丁二醇脫氫酶編碼基因，再利用重疊延伸 PCR技術(shù)將上述三個基因片段按照α-乙酰乳酸合成酶編碼基因，α-乙酰乳酸脫羧酶編碼 基因，（R，R)-2, 3- 丁二醇脫氫酶編碼基因的順序拼接組裝得到α -乙酰乳酸合成酶編碼基 因 、α -乙酰乳酸脫羧酶編碼基因和（R，R)_2, 3- 丁二醇脫氫酶編碼基因的三基因融合片段 或者直接從肺炎克雷伯氏菌擴增α-乙酰乳酸合成酶編碼基因、α-乙酰乳酸脫羧酶編碼 基因和meso-2, 3- 丁二醇脫氫酶編碼基因的操縱子基因片段。
[0014] 2)通過兩步同源重組方法將步驟1)中α -乙酰乳酸合成酶編碼基因 、α -乙酰乳 酸脫羧編碼酶基因和（R，R)-2, 3-丁二醇脫氫酶編碼基因三基因融合片段或α-乙酰乳酸 合成酶編碼基因 、α -乙酰乳酸脫羧酶編碼基因和meso-2, 3- 丁二醇脫氫酶編碼基因的操 縱子基因片段整合到大腸桿菌染色體組上。
[0015] 其中，對擴增得到的α -乙酰乳酸合成酶編碼基因 ，α -乙酰乳酸脫羧酶編碼基 因，和2, 3-丁二醇脫氫酶編碼基因拼接前，先在α -乙酰乳酸合成酶編碼基因 ，α -乙酰乳 酸脫羧酶編碼基因，（R，R)_2, 3-丁二醇脫氫酶編碼基因上游分別引入核糖體結(jié)合位點；或 者直接在α-乙酰乳酸合成酶編碼基因，α-乙酰乳酸脫羧酶編碼基因和meso-2, 3-丁二 醇脫氫酶編碼基因的操縱子基因片段上游引入核糖體結(jié)合位點。將上述基因上游引入相應(yīng) 的核糖體結(jié)合位點可以提商相應(yīng)基因蛋白翻譯速率，從而提商目的蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而使 得2,3-BD的產(chǎn)量得以增加。
[0016] 所述的兩步同源重組方法具體步驟為：
[0017] 1)先通過重疊延伸PCR的技術(shù)將PCR擴增的大腸桿菌染色體敲入位點上游序列同 源的一段含500-1000個堿基的片段、抗性篩選標(biāo)記基因、蔗糖果聚糖酶基因和大腸桿菌染 色體敲入位點下游序列同源的一段含500-1000個堿基的片段進(jìn)行融合，得到重組片段1， 再使用λ -Red同源重組的方法將重組片段1整合到大腸桿菌基因組的敲入位點上。
[0018] 2)先通過重疊 PCR的方法將PCR擴增的大腸桿菌染色體敲入位點上游序列同源 的一段含500-1000個堿基的片段，α-乙酰乳酸合成酶編碼基因、α-乙酰乳酸脫羧酶編 碼基因和（R，R)-2, 3-丁二醇脫氫酶編碼基因三基因融合片段或α-乙酰乳酸合成酶編碼 基因 、α -乙酰乳酸脫羧酶編碼基因和meso-2, 3- 丁二醇脫氫酶編碼基因的操縱子基因片 段，和大腸桿菌染色體敲入位點下游序列同源的一段含500-1000個堿基的片段進(jìn)行融合， 得到重組片段2或重組片段3,再使用λ -Red同源重組的方法將重組片段2或重組片段3 替換上述步驟1)中重組片段1。
[0019] 所述的抗性篩選標(biāo)記基因是氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、慶大霉素抗性 基因、四環(huán)素抗性基因中的一種。
[0020] 所述大腸桿菌染色體敲入位點為乳酸脫氫酶編碼基因位點或16SrDNA基因位點， 在將2, 3-丁二醇合成途徑相關(guān)的基因整合到大腸桿菌過程中，選擇乳酸脫氫酶編碼基因 位點為大腸桿菌染色體敲入位點，乳酸合成途徑相關(guān)的基因被破壞，因此，構(gòu)建得到的基因 工程菌在發(fā)酵過程中，乙酸抑制得到緩解的同時，副產(chǎn)物乳酸也得到降低。
[0021] 本發(fā)明另一個目的的在于提供一種實現(xiàn)高密度發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)2, 3- 丁二醇的方法。為 解決此技術(shù)問題，本發(fā)明是高密度發(fā)酵培養(yǎng)上述基因工程菌生產(chǎn)2, 3- 丁二醇。
[0022] 其中，高密度發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)基（g/L)組成為：蛋白胨10 ;酵母膏5 ;NaCl 10 ; 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L)組成為葡萄糖 60-100 ;酵母膏 0-40 ;K2HP04 · 3H20 10. 0-15. 0 ;KH2P04 2· 0-6.0; (NH4)2HPO4 2.0-6. 0; (NH4)2SO4 2.0-8. 0;MgS04*7H20 0.1-0. 3 ;FeS04*7H20 0· 01-0. I ;ZnS04 · 7H20 0· 01-0. I ;MnS04 ·Η20 0· 01-0. I ;CaCl2 0· 01-0. I ;EDTA 0· 01-0. 1。
[0023] 在此高密度發(fā)酵培養(yǎng)過程中無需補堿調(diào)控發(fā)酵液pH值，簡化了相應(yīng)補料發(fā)酵策 略。
[0024] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)聚羥基脂肪酸和2, 3- 丁 二醇基因工程菌。為解決此問題，本發(fā)明在上述實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)聚羥基脂肪酸和 2, 3- 丁二醇基因工程菌中引入外源質(zhì)粒，所述外源質(zhì)粒帶有聚羥基脂肪酸合成途徑的相關(guān) 基因。
[0025] 所述的聚羥基脂肪酸為聚羥基丁酸酯或聚羥基丁酸戊酸酯。
[0026] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)聚羥基脂肪酸和2, 3- 丁 二醇方法。為解決此問題，本發(fā)明高密度發(fā)酵實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)聚羥基脂肪酸和 2, 3- 丁二醇基因基因工程菌生產(chǎn)聚羥基脂肪酸和2, 3- 丁二醇。
[0027] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)功能蛋白和2, 3- 丁二 醇基因工程菌。為解決此問題，本發(fā)明在上述的實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)聚羥基脂肪酸和 2, 3-丁二醇基因工程菌中引入外源質(zhì)粒，所述外源質(zhì)粒帶有功能蛋白合成途徑的相關(guān)基 因。
[0028] 所述的功能蛋白為蛋白酶、干擾素、胰島素或類人膠原蛋白。
[0029] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)功能蛋白和2, 3- 丁二醇 方法。為解決此問題，本發(fā)明高密度發(fā)酵實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)功能蛋白和2, 3-丁二醇基 因基因工程菌生產(chǎn)功能蛋白和2, 3- 丁二醇。
[0030] 本發(fā)明的有益效果：
[0031] 1、本發(fā)明提供的基因工程菌，將人工組裝的外源2, 3-丁二醇合成途徑的相關(guān)基 因整合到大腸桿菌染色體上，基因工程菌在合成2, 3-丁二醇過程中，消耗了原本流向乙酸 途徑的代謝流，生成毒性極低的中性產(chǎn)物2, 3- 丁二醇，大大地降低乙酸生成，同時，由于在 2, 3- 丁二醇合成過程中大量的NADH被消耗，從而全方位緩解乙酸抑制在發(fā)酵過程中對大 腸桿菌的影響，實現(xiàn)高密度發(fā)酵，并聯(lián)產(chǎn)高附加值的化合物2, 3-丁二醇。另外由于所述的 基因工程菌實現(xiàn)了高密度發(fā)酵，不僅減少了培養(yǎng)體積，強化下游分離提取，同時還縮短生產(chǎn) 周期、減少設(shè)備投資，從而降低了生產(chǎn)成本，進(jìn)一步提高了生產(chǎn)效率。
[0032] 2、本發(fā)明構(gòu)建的一種實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)其他化合物和2, 3- 丁二醇基因工程 菌，除能高密度發(fā)酵生產(chǎn)2, 3-丁二醇外，還能聯(lián)產(chǎn)聚羥基脂肪酸或功能蛋白，從而實現(xiàn)聚 羥基脂肪酸或功能蛋白，與2, 3-丁二醇低成本、高效率的聯(lián)產(chǎn)，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。 具體實施例
[0033] 根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的內(nèi)容僅限于說明本發(fā)明，而不應(yīng)該也不會限制權(quán)力要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。本發(fā)明中的生物材料來源如下：
[0034] 肺炎克雷伯氏菌CICC10011菌株（縮寫為K. pneumoniae菌株）：購于中國微生物 菌種保藏中心；枯草芽孢桿菌168菌株（縮寫為B. subtilis菌株）：購于中國工業(yè)微生物 囷種保減中心；
[0035] 載體pEASY-Blunt :商業(yè)載體，購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；
[0036] 載體pTrc99a :商業(yè)載體，購于上海北諾生物科技有限公司；
[0037] 載體pKD46 :商業(yè)載體，購于上海北諾生物科技有限公司；
[0038] pkl8mobsacB :商業(yè)載體，購于上海北諾生物科技有限公司；
[0039] 大腸桿菌MG1655菌株（縮寫為E. coli菌株）：購于上海北諾生物科技有限公司；
[0040] 實施例1實現(xiàn)高密度發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)（R，R) - 2, 3- 丁二醇的基因工程菌的構(gòu)建
[0041] 1、α -乙酰乳酸合成酶編碼基因 alsS、α -乙酰乳酸脫羧酶基因編碼基因 budA和 (R，R)-2, 3- 丁二醇脫氫酶編碼基因 bdhA的克隆
[0042] (1) α -乙酰乳酸合成酶編碼基因 alsS的克隆
[0043] 根據(jù)Genebank公布的肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae)中alsS基因序列設(shè)計合 成引物：
[0044] Pl :5' -GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3'
[0045] P2 :5, -GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3，
[0046] 以K. pneumoniae CICC10011的基因組DNA為模板，用引物Pl與P2, Takara高保 真酶PdmeSTAR? HS (Premix) PCR 擴增 alsS 基因。
[0047] PCR 反應(yīng)體系：PrimeSTAR? HS (Premix) 25 μ L，引物 P10. 3 μ L，引物 P20. 3 μ L， K. pneumoniae CICC10011 基因組 0.4 μ L，ddH20 24 μ L。
[0048] PCR 反應(yīng)條件：98°C 10s，62°C 15s，72°C lmin45s，循環(huán) 30 次；72°C 7min，4°C保溫。
[0049] 用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用Takara膠回收試劑盒純化目的 片段，再將純化的片段克隆到載體PEASY-Blu