專利名稱：乙醇反饋控制流加的酵母高密度發(fā)酵方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高密度培養(yǎng)酵母細胞以及生產(chǎn)酵母代謝產(chǎn)物的方法。是通過乙醇濃度反饋控制流加，用于高密度培養(yǎng)酵母細胞以及通過酵母細胞生產(chǎn)目標產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
酵母是生物產(chǎn)品發(fā)酵的主要載體微生物之一，也是重組基因工程產(chǎn)品經(jīng)常采用的宿主細胞。為提高生產(chǎn)過程的經(jīng)濟性和產(chǎn)品的市場競爭力，生物技術(shù)研究者不斷創(chuàng)造更經(jīng)濟、更有效的方法，優(yōu)化生產(chǎn)過程，實現(xiàn)高生產(chǎn)率。酵母細胞的高密度培養(yǎng)是提高酵母表達產(chǎn)品生產(chǎn)水平的重要手段。由于微生物細胞自身生理特性以及設(shè)備、培養(yǎng)條件等因素的限制，細胞的高密度培養(yǎng)并不容易實現(xiàn)，需要對生產(chǎn)過程進行優(yōu)化調(diào)控。在酵母發(fā)酵中，由于Crabtree效應(yīng)以及高濃度基質(zhì)對細胞生長和產(chǎn)物積累的抑制作用，為獲得高的細胞密度，一般采用流加培養(yǎng)技術(shù)，也就是根據(jù)具體發(fā)酵過程的特點，按照一定的加料策略向發(fā)酵罐中不斷補充營養(yǎng)物質(zhì)直至發(fā)酵結(jié)束。
補料策略的優(yōu)化是流加技術(shù)的核心內(nèi)容，也是高密度培養(yǎng)能否實現(xiàn)的關(guān)鍵。流加方式可分為兩大類無反饋控制的流加操作和反饋控制流加操作。無反饋控制的流加，營養(yǎng)物的流加速率按預(yù)定的方式進行，有恒速流加、指數(shù)流加、恒生長速率流加等。這種流加方式較為簡單，對設(shè)備的要求不高，但往往效果欠佳。由于微生物發(fā)酵的復(fù)雜性，采用反饋控制流加操作效果較好，也就是根據(jù)發(fā)酵過程中某些過程參數(shù)的變化來及時調(diào)節(jié)營養(yǎng)物的流加速率，使營養(yǎng)的提供更符合微生物自身的代謝規(guī)律，給微生物提供較優(yōu)的生長和代謝環(huán)境，充分發(fā)揮菌種目的產(chǎn)物的合成潛力，從而有效地提高發(fā)酵水平。
微生物發(fā)酵中通常用于反饋控制的參數(shù)有溶氧(DO)、pH、呼吸熵(RQ)、乙醇濃度、殘?zhí)菨舛鹊龋米鞣答伩刂频膮?shù)必須能夠?qū)崿F(xiàn)在線監(jiān)測。Fan-Chiang Yang等[Bioprocess Engineering 18(1998)79-82]在釀酒酵母的流加培養(yǎng)中以DO為反饋控制參數(shù)，采取恒DO策略，以DO參數(shù)的變化來判斷發(fā)酵罐中是否出現(xiàn)基質(zhì)匱乏，使細胞培養(yǎng)密度達到了110g/L。Takou Yano等[J of Ferment and Bioeng.，1991，71(1)35-39]將指數(shù)流加和控制DO相結(jié)合的方法，應(yīng)用于面包酵母的流加培養(yǎng)過程，將溶氧變化與基質(zhì)的流加速率相關(guān)聯(lián)，使生物量達到60g/L以上。Jana等[Journal of Biotechnology 80(2000)55-62]采用反饋RQ控制流加培養(yǎng)重組酵母細胞，生產(chǎn)可溶性人N-脫糖基重組β-1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶。采用優(yōu)化的RQ值反饋控制流加培養(yǎng)重組酵母，可同時提高生物量及酶產(chǎn)量。但是以RQ為控制參數(shù)，發(fā)酵罐必須配備尾氣分析裝置，在線分析尾氣中的氧和二氧化碳濃度，而且RQ值必須能夠較好地與細胞的生理代謝狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。同樣，以殘?zhí)菨舛葹榉答伩刂茀?shù)的流加發(fā)酵[Mendoza-Vega等，F(xiàn)EMS Microbiol.Rev.15(1994)，369-410]，發(fā)酵罐必須要配備在線葡萄糖分析儀。由于這些儀器價格較貴，致使設(shè)備投資費用增大而難以普及。乙醇是酵母葡萄糖代謝的產(chǎn)物，就酵母發(fā)酵而言，乙醇濃度是一個很重要的參數(shù)，它與酵母的生長、代謝狀態(tài)緊密關(guān)聯(lián)，而且以不同的機制影響著各種代謝產(chǎn)物的積累。在谷胱甘肽發(fā)酵中，Alfafara等[Biotechnology andBioengineering，Vol.41，493-501(1993)]將乙醇傳感器與氣相色譜相連，監(jiān)測排氣中的乙醇濃度，采用模糊邏輯控制器控制乙醇濃度，使細胞在谷胱甘肽合成階段不產(chǎn)乙醇，并結(jié)合控制比生長速率以及適時添加半胱氨酸，以利于谷胱甘肽的積累。該方法不能直接檢測發(fā)酵液中的乙醇濃度，需要經(jīng)過復(fù)雜的數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)處理才能計算出發(fā)酵液中的乙醇濃度。Sakato等[Biotechnology and Bioengineering，Vol.40，904-912(1992)]采用前饋/反饋控制系統(tǒng)以及在線檢測排氣中氧濃度和乙醇濃度，調(diào)節(jié)補糖速度，使酵母同時消耗糖和乙醇，經(jīng)過60小時發(fā)酵，細胞密度達到64g/L。Alfafara和Sakato等監(jiān)測的都是排氣中的乙醇濃度，而且最終細胞密度都低于100g/L。用乙醇濃度監(jiān)測儀在線監(jiān)測發(fā)酵液中的乙醇濃度，應(yīng)用于酵母細胞的高密度發(fā)酵，尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提出了在線監(jiān)測發(fā)酵液中的乙醇濃度，反饋控制流加的酵母高密度發(fā)酵方法。該方法是通過在線監(jiān)測發(fā)酵液中的乙醇濃度，將發(fā)酵液乙醇濃度范圍控制在最佳控制濃度來實現(xiàn)的。
通常，乙醇濃度反饋控制流加的酵母高密度發(fā)酵方法，是采用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，以乙醇濃度為反饋控制參數(shù)，向發(fā)酵罐中流加營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖水溶液，通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物的流加速率，生產(chǎn)酵母細胞以及酵母代謝產(chǎn)物，本發(fā)明的技術(shù)特征在于(1)乙醇濃度監(jiān)測儀在線監(jiān)測發(fā)酵液中的乙醇濃度，將發(fā)酵液乙醇濃度范圍控制在最佳控制濃度；(2)酵母為釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母或熱帶假絲酵母；(3)優(yōu)化的培養(yǎng)基組成中包括葡萄糖、酵母粉、麥汁、磷酸氫二銨、硫酸鎂、蛋白胨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、Zn2+、Fe2+、Cu2+和Mn2+。
本發(fā)明的方法應(yīng)用于產(chǎn)朊假絲酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)酵母細胞，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為5～7g/L；葡萄糖水溶液濃度為650g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖60g/L、酵母粉15g/L、麥汁40g/L、磷酸氫二銨10g/L、硫酸鎂5g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氫二鉀20g/L、磷酸二氫鉀12g/L、Zn2+10ppm、Fe2+6ppm、Cu2+6ppm和Mn2+6ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到135g/L(干重)。
本發(fā)明的方法應(yīng)用于高密度培養(yǎng)熱帶假絲酵母生產(chǎn)酵母細胞，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為7～9g/L；葡萄糖水溶液濃度為650g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖73g/L、酵母粉9g/L、麥汁28g/L、磷酸氫二銨9g/L、硫酸鎂6g/L、蛋白胨8g/L、磷酸氫二鉀16g/L、磷酸二氫鉀18g/L、Zn2+13ppm、Fe2+4ppm、Cu2+4ppm、Mn2+4ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到126g/L(干重)。
本發(fā)明的方法應(yīng)用于高密度培養(yǎng)釀酒酵母細胞，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為5～7g/L；葡萄糖水溶液濃度為650g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖80g/L、酵母粉18g/L、麥汁40g/L、磷酸氫二銨9g/L、硫酸鎂3g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氫二鉀12g/L、磷酸二氫鉀12g/L、Zn2+10ppm、Fe2+6ppm、Cu2+6ppm、Mn2+6ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到143g/L(干重)。
本發(fā)明的方法應(yīng)用于高密度培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為20～23g/L；葡萄糖水溶液濃度為600g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖40g/L、酵母粉7g/L、麥汁16g/L、磷酸氫二銨6g/L、硫酸鎂3g/L、蛋白胨5g/L、磷酸氫二鉀7g/L、磷酸二氫鉀7g/L、Zn2+7ppm、Fe2+2ppm、Cu2+2ppm、Mn2+2ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到104g/L(干重)，谷胱甘肽總量為1680mg/L。
本發(fā)明的方法應(yīng)用于高密度培養(yǎng)熱帶假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為22～25g/L；葡萄糖水溶液濃度為700g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖60g/L、酵母粉13g/L、麥汁30g/L、磷酸氫二銨9g/L、硫酸鎂4g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氫二鉀12g/L、磷酸二氫鉀12g/L、Zn2+12ppm、Fe2+4ppm、Cu2+4ppm、Mn2+4ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到123g/L(干重)，谷胱甘肽總量為1830mg/L。
本發(fā)明的方法應(yīng)用于高密度培養(yǎng)釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為18～20g/L；葡萄糖水溶液濃度為600g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖50g/L、酵母粉20g/L、麥汁10g/L、磷酸氫二銨7g/L、硫酸鎂6g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氫二鉀10g/L、磷酸二氫鉀20g/L、Zn2+15ppm、Fe2+2ppm、Cu2+2ppm、Mn2+2ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到137g/L(干重)，谷胱甘肽總量為1872mg/L。
本發(fā)明的方法應(yīng)用于高密度培養(yǎng)釀酒酵母生產(chǎn)麥角固醇，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為15～17g/L；葡萄糖水溶液濃度為650g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖40g/L、酵母粉20g/L、麥汁14g/L、磷酸氫二銨6g/L、硫酸鎂6g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氫二鉀20g/L、磷酸二氫鉀20g/L、Zn2+7ppm、Fe2+2ppm、Cu2+2ppm、Mn2+2ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到93g/L(干重)，總麥角固醇量為1302mg/L。
眾所周知，酵母可以碳水化合物(如多種單糖及寡糖)和非碳水化合物等作為碳源和能源，能以無機氮源(主要是硫酸銨及磷酸銨)、尿素、各種氨基酸為營養(yǎng)物質(zhì)。除碳源和氮源外，酵母生長還需要磷、鎂、硫、及微量的鋅、銅、鐵等，需要生物素、泛酸等維生素。根據(jù)酵母細胞的營養(yǎng)需求，本發(fā)明所用的酵母發(fā)酵培養(yǎng)基從常用的微生物培養(yǎng)基組成物質(zhì)中選擇以下物質(zhì)組成，葡萄糖、酵母粉、麥汁、磷酸氫二銨、硫酸鎂、蛋白胨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、Zn2+、Fe2+、Cu2+和Mn2+，然后通過均勻試驗設(shè)計、正交試驗設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)基中各組份的配比，得到適用于細胞高密度培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基配方。發(fā)酵結(jié)束，酵母細胞密度達到93～143g/L(干重)，說明優(yōu)化培養(yǎng)基中碳、氮、磷的比例合理，無機離子的濃度適宜，而且酵母粉、麥汁和蛋白胨中含有豐富的維生素、氨基酸以及生長因子，有利于酵母生長和產(chǎn)物積累，充分發(fā)揮菌種的代謝潛力。優(yōu)化的培養(yǎng)基是實現(xiàn)高密度培養(yǎng)的第一步。適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基是細胞生長和合成目的產(chǎn)物的保證。
本發(fā)明采用乙醇濃度監(jiān)測儀對發(fā)酵液中的乙醇濃度進行在線監(jiān)測。乙醇監(jiān)測探頭安裝在發(fā)酵罐內(nèi)，插入發(fā)酵液中，能夠準確快速地監(jiān)測發(fā)酵罐中乙醇濃度的變化情況。本發(fā)明直接檢測發(fā)酵液中的乙醇濃度，因此更能準確反映實際的發(fā)酵狀況，有利于提高控制效果。
酵母發(fā)酵過程中必然會產(chǎn)生乙醇，乙醇的過量產(chǎn)生會降低基質(zhì)的得率系數(shù)，減少生物量，抑制目的產(chǎn)物的生成。要根據(jù)代謝過程的具體特點合理調(diào)控乙醇的產(chǎn)生，控制發(fā)酵液中的乙醇維持在一個適宜濃度是達到細胞高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵。本發(fā)明的方法采用乙醇濃度監(jiān)測儀，在線監(jiān)測發(fā)酵液中的乙醇濃度，以乙醇濃度為反饋控制參數(shù)，通過合理控制發(fā)酵液中的乙醇濃度，及時調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的流加速率。在發(fā)酵進行到某時刻，當乙醇濃度下降至最佳控制濃度時，調(diào)節(jié)葡萄糖的流加速率，當乙醇濃度上升時，減小流加速率，當乙醇濃度下降時，增大流加速率，維持發(fā)酵液中的乙醇濃度在最佳控制濃度，發(fā)酵結(jié)束時，酵母細胞密度最高可達143g/L(干重)。本發(fā)明實現(xiàn)酵母細胞的高密度培養(yǎng)，將此酵母高密度培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于谷胱甘肽以及麥角固醇等的生產(chǎn)，可以大幅提高產(chǎn)物的生產(chǎn)水平。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、直接監(jiān)測發(fā)酵液中的乙醇濃度，較之監(jiān)測排氣中乙醇濃度的方法，該法更準確、直接、簡便；2、針對不同的發(fā)酵體系，將發(fā)酵液中的乙醇控制在一個適宜的濃度，即乙醇的最佳控制濃度。乙醇濃度是反映細胞生理狀態(tài)的一個重要參數(shù)，以此為反饋控制參數(shù)效果較好。
3、應(yīng)用于釀酒酵母高密度培養(yǎng)，細胞密度達到93～143g/L(干重)；應(yīng)用于產(chǎn)朊假絲酵母高密度培養(yǎng)，細胞密度達到104～135g/L(干重)；應(yīng)用于熱帶假絲酵母高密度培養(yǎng)，細胞密度達到123～136g/L(干重)本發(fā)明用通用式發(fā)酵罐培養(yǎng)酵母，操作步驟如下1、發(fā)酵罐上安裝各種傳感電極(pH電極、溶氧電極、溫度電極、消泡電極)和乙醇濃度監(jiān)測儀(例如，美國Yellow Spring的YSI2730監(jiān)測和控制系統(tǒng)或國產(chǎn)的FC2002乙醇濃度監(jiān)測儀)，乙醇監(jiān)測探頭插入發(fā)酵液中；2、按照優(yōu)化培養(yǎng)基配方在所用的發(fā)酵罐中配制一定量的培養(yǎng)基，在120℃下30分鐘實罐滅菌；3、在補料罐中配制一定濃度的流加葡萄糖水溶液，在120℃下30分鐘實罐滅菌；4、制備種子以發(fā)酵配方配制種子培養(yǎng)基，分裝搖瓶，在120℃下30分鐘滅菌；斜面接種，待種子生長到對數(shù)中后期準備接種；5、按10％的接種量接入發(fā)酵罐，攪拌轉(zhuǎn)速在200～500轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)比為1.0～1.5VVM，30℃下開始發(fā)酵；6、在線監(jiān)測發(fā)酵液中的乙醇濃度，并以此為反饋控制參數(shù)，通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物的流加速率，控制乙醇濃度在最佳控制濃度；7、待產(chǎn)量達到預(yù)定指標時停止發(fā)酵。
具體實施方式
實施例1高密度培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)酵母細胞使用30L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制9L發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方葡萄糖60g/L，酵母粉15g/L，麥汁40g/L，磷酸氫二銨10g/L，硫酸鎂5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氫二鉀20g/L，磷酸二氫鉀12g/L，Zn2+10ppm，F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各6ppm)，實罐滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后接種，調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.2VVM，攪拌轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/分，開始發(fā)酵。從11.5小時開始流加濃度為650g/L的葡萄糖水溶液，發(fā)酵進行至15.4小時，乙醇濃度降至6g/L，此時根據(jù)乙醇濃度調(diào)節(jié)流加速率，當乙醇濃度上升時，減小流加速率，當乙醇濃度下降時，增大流加速率，發(fā)酵液中的乙醇濃度維持在5～7g/L。經(jīng)過33小時發(fā)酵，生物量達到135g/L(干重)。
實施例2高密度培養(yǎng)熱帶假絲酵母生產(chǎn)酵母細胞使用50L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制18L發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方葡萄糖73g/L，酵母粉9g/L，麥汁28g/L，磷酸氫二銨9g/L，硫酸鎂6g/L，蛋白胨8g/L，磷酸氫二鉀16g/L，磷酸二氫鉀18g/L，Zn2+13ppm，F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各4ppm)，實罐滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后接種，調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.2VVM，攪拌轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分，開始發(fā)酵。從12小時開始流加濃度為650g/L的葡萄糖水溶液，發(fā)酵進行至17.1小時，乙醇濃度降至8g/L，此時根據(jù)乙醇濃度調(diào)節(jié)流加速率，當乙醇濃度上升時，減小流加速率，當乙醇濃度下降時，增大流加速率，發(fā)酵液中的乙醇濃度維持在7～9g/L。經(jīng)過36小時發(fā)酵，生物量達到126g/L(干重)。
實施例3高密度培養(yǎng)釀酒酵母細胞使用150L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制50L發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方葡萄糖80g/L，酵母粉18g/L，麥汁40g/L，磷酸氫二銨9g/L，硫酸鎂3g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氫二鉀12g/L，磷酸二氫鉀12g/L，Zn2+10ppm，F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各6ppm)，實罐滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后接種，調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.1VVM，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，開始發(fā)酵。從13小時開始流加濃度為650g/L的葡萄糖水溶液，發(fā)酵進行至18小時，乙醇濃度降至6g/L，此時根據(jù)乙醇濃度調(diào)節(jié)流加速率，當乙醇濃度上升時，減小流加速率，當乙醇濃度下降時，增大流加速率，發(fā)酵液中的乙醇濃度維持在5～7g/L。經(jīng)過42小時發(fā)酵，生物量達到143g/L(干重)。
實施例4高密度培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽使用5L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制1.6L發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方葡萄糖40g/L，酵母粉7g/L，麥汁16g/L，磷酸氫二銨6g/L，硫酸鎂3g/L，蛋白胨5g/L，磷酸氫二鉀7g/L，磷酸二氫鉀7g/L，Zn2+7ppm，F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各2ppm)，實罐滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后接種，調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.5VVM，攪拌轉(zhuǎn)速為500轉(zhuǎn)/分，開始發(fā)酵。發(fā)酵液中的乙醇濃度開始逐步上升，達最高點后逐步下降，11小時降至21g/L，此時開始流加濃度為600g/L的葡萄糖水溶液，根據(jù)乙醇濃度的變化情況改變流加速率，當乙醇濃度上升時，減小流加速率，當乙醇濃度下降時，增大流加速率，維持發(fā)酵液中的乙醇濃度在20～23g/L，發(fā)酵38小時，生物量達到104g/L(干重)，谷胱甘肽總量為1680mg/L。
實施例5高密度培養(yǎng)熱帶假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽使用30L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制10L發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方葡萄糖60g/L，酵母粉13g/L，麥汁30g/L，磷酸氫二銨9g/L，硫酸鎂4g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氫二鉀12g/L，磷酸二氫鉀12g/L，Zn2+12ppm，F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各4ppm)實罐滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后接種，調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.3VVM，攪拌轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/分，開始發(fā)酵。發(fā)酵12.3小時，此時發(fā)酵液中的乙醇濃度為降至24g/L，開始流加濃度為700g/L的葡萄糖水溶液，調(diào)節(jié)流加速率，維持發(fā)酵液中的乙醇濃度在22～25g/L，發(fā)酵41小時，生物量達到123g/L(干重)，谷胱甘肽總量為1830mg/L。
實施例6高密度培養(yǎng)釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽使用100L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制30L發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方葡萄糖50g/L，酵母粉20g/L，麥汁10g/L，磷酸氫二銨7g/L，硫酸鎂6g/L，蛋白胨3g/L，磷酸氫二鉀10g/L，磷酸二氫鉀20g/L，Zn2+15ppm，F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各2ppm)實罐滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后接種，調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.0VVM，攪拌轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分，開始發(fā)酵。發(fā)酵13小時，此時發(fā)酵液中的乙醇濃度為降至19g/L，開始流加濃度為600g/L的葡萄糖水溶液，調(diào)節(jié)流加速率，維持發(fā)酵液中的乙醇濃度在18～20g/L，發(fā)酵46小時，生物量達到137g/L(干重)，谷胱甘肽總量為1872mg/L。
實施例7高密度培養(yǎng)釀酒酵母生產(chǎn)麥角固醇使用20L通用式發(fā)酵罐發(fā)酵。配制6L發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方葡萄糖40g/L，酵母粉20g/L，麥汁14g/L，磷酸氫二銨6g/L，硫酸鎂6g/L，蛋白胨3g/L，磷酸氫二鉀20g/L，磷酸二氫鉀20g/L，Zn2+7ppm，F(xiàn)e2+、Cu2+、Mn2+各2ppm)實罐滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至30℃后接種，調(diào)節(jié)通風(fēng)比為1.5VVM，攪拌轉(zhuǎn)速為400轉(zhuǎn)/分，開始發(fā)酵。從10小時開始流加濃度為650g/L的葡萄糖水溶液，發(fā)酵進行至13.2小時，乙醇濃度降至16g/L，此時根據(jù)乙醇濃度調(diào)節(jié)流加速率，當乙醇濃度上升時，減小流加速率，當乙醇濃度下降時，增大流加速率，發(fā)酵液中的乙醇濃度維持在15～17g/L。經(jīng)過42小時發(fā)酵，生物量達到93g/L(干重)，總麥角固醇量為1302mg/L。
權(quán)利要求
1.一種乙醇濃度反饋控制流加的酵母高密度發(fā)酵方法，是采用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，以乙醇濃度為反饋控制參數(shù)，向發(fā)酵罐中流加營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖水溶液，通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物的流加速率，生產(chǎn)酵母細胞以及酵母代謝產(chǎn)物，其特征在于(1)用乙醇濃度監(jiān)測儀在線監(jiān)測發(fā)酵液中的乙醇濃度，將發(fā)酵液乙醇濃度范圍控制在最佳控制濃度；(2)酵母為釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母或熱帶假絲酵母；(3)優(yōu)化的培養(yǎng)基組成中包括葡萄糖、酵母粉、麥汁、磷酸氫二銨、硫酸鎂、蛋白胨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、Zn2+、Fe2+、Cu2+和Mn2+。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，應(yīng)用于產(chǎn)朊假絲酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)酵母細胞，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為5～7g/L；葡萄糖水溶液濃度為650g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖60g/L、酵母粉15g/L、麥汁40g/L、磷酸氫二銨10g/L、硫酸鎂5g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氫二鉀20g/L、磷酸二氫鉀12g/L、Zn2+10ppm、Fe2+6ppm、Cu2+6ppm和Mn2+6ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到135g/L(干重)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，應(yīng)用于高密度培養(yǎng)熱帶假絲酵母生產(chǎn)酵母細胞，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為7～9g/L；葡萄糖水溶液濃度為650g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖73g/L、酵母粉9g/L、麥汁28g/L、磷酸氫二銨9g/L、硫酸鎂6g/L、蛋白胨8g/L、磷酸氫二鉀16g/L、磷酸二氫鉀18g/L、Zn2+13ppm、Fe2+4ppm、Cu2+4ppm、Mn2+4ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到126g/L(干重)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，應(yīng)用于高密度培養(yǎng)釀酒酵母細胞，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為5～7g/L；葡萄糖水溶液濃度為650g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖80g/L、酵母粉18g/L、麥汁40g/L、磷酸氫二銨9g/L、硫酸鎂3g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氫二鉀12g/L、磷酸二氫鉀12g/L、Zn2+10ppm、Fe2+6ppm、Cu2+6ppm、Mn2+6ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到143g/L(干重)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，應(yīng)用于高密度培養(yǎng)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為20～23g/L；葡萄糖水溶液濃度為600g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖40g/L、酵母粉7g/L、麥汁16g/L、磷酸氫二銨6g/L、硫酸鎂3g/L、蛋白胨5g/L、磷酸氫二鉀7g/L、磷酸二氫鉀7g/L、Zn2+7ppm、Fe2+2ppm、Cu2+2ppm、Mn2+2ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到104g/L(干重)，谷胱甘肽總量為1680mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，應(yīng)用于高密度培養(yǎng)熱帶假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為22～25g/L；葡萄糖水溶液濃度為700g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖60g/L、酵母粉13g/L、麥汁30g/L、磷酸氫二銨9g/L、硫酸鎂4g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氫二鉀12g/L、磷酸二氫鉀12g/L、Zn2+12ppm、Fe2+4ppm、Cu2+4ppm、Mn2+4ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到123g/L(干重)，谷胱甘肽總量為1830mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，應(yīng)用于高密度培養(yǎng)釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為18～20g/L；葡萄糖水溶液濃度為600g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖50g/L、酵母粉20g/L、麥汁10g/L、磷酸氫二銨7g/L、硫酸鎂6g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氫二鉀10g/L、磷酸二氫鉀20g/L、Zn2+15ppm、Fe2+2ppm、Cu2+2ppm、Mn2+2ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到137g/L(干重)，谷胱甘肽總量為1872mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，應(yīng)用于高密度培養(yǎng)釀酒酵母生產(chǎn)麥角固醇，發(fā)酵液乙醇最佳控制濃度為15～17g/L；葡萄糖水溶液濃度為650g/L；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成葡萄糖40g/L、酵母粉20g/L、麥汁14g/L、磷酸氫二銨6g/L、硫酸鎂6g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氫二鉀20g/L、磷酸二氫鉀20g/L、Zn2+7ppm、Fe2+2ppm、Cu2+2ppm、Mn2+2ppm；發(fā)酵結(jié)束時細胞密度達到93g/L(干重)，總麥角固醇量為1302mg/L。
全文摘要
本發(fā)明乙醇反饋控制流加的酵母高密度發(fā)酵方法及其應(yīng)用，涉及一種高密度培養(yǎng)酵母細胞以及生產(chǎn)酵母代謝產(chǎn)物的方法。用乙醇濃度監(jiān)測儀在線監(jiān)測發(fā)酵液中的乙醇濃度，將發(fā)酵液乙醇濃度范圍控制在最佳控制濃度；所用酵母為釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母或熱帶假絲酵母；優(yōu)化的培養(yǎng)基組成為葡萄糖、酵母粉、麥汁、磷酸氫二銨、硫酸鎂、蛋白胨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、Zn
文檔編號C12N1/16GK1621512SQ20031011683
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者譚天偉, 溫少紅, 王崢, 尚飛 申請人:北京化工大學(xué)