一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)順式-3-l-羥脯氨酸的方法
【技術領域】
[0001] 一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)順式-3-L-羥脯氨酸的方法，屬于微生物基因工 程領域。
【背景技術】
[0002] 順式-3-L-羥脯氨酸（C3HP)作為一種稀有的環(huán)狀β -羥基-α氨基酸，不僅是骨 膠原的組成成分，而且還是許多次級代謝物，如放線菌素、宜他霉素、遠霉素等的組成成分。 因此，C3HP成為合成這些抗生素必不可少的基本單元。在醫(yī)藥方面，C3HP不僅可以直接作 為腫瘤和膠原蛋白疾病的藥物，而且是合成許多藥物的重要手性合成子。同時它還能用于 合成選擇性雄性受體調(diào)節(jié)劑BMS-564929、碳氫霉烯類抗生素、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑、解 痙攣制劑等。此外它還能用于合成DNA促旋酶抑制劑，如：cyclothialidine、plusbacin和 tripropeptins。在化學合成領域，C3HP作為重要的手性分子用于合成倒千里光裂堿、流涎 胺等。在不對稱合成領域，它還被直接用做有機金屬催化劑。而其他的C3HP衍生物，如卡 泊芬凈和Pneumocandin B0,能做為抗真菌藥物使用。
[0003] 目前，生產(chǎn)C3HP的方法主要是化學合成法。但是化學合成法存在：（1)生產(chǎn)成本 高；（2)合成步驟較多；（3)分離精制工序復雜；(4)生產(chǎn)效率低等缺點。所以，有必要尋求 一種新型合成方法進行化學替代，以便實現(xiàn)C3HP大規(guī)模工業(yè)制造。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種用微生物酶法生產(chǎn)C3HP的方法。
[0005] 與本發(fā)明有關的順式-3-脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)基因（P3H)編碼順式-3-脯氨酸羥化 酶，該酶能夠在2-酮戊二酸和2價鐵離子存在下，使游離的L-脯氨酸羥基化生成C3HP。
[0006] 本發(fā)明通過將P3H與高效啟動子組合，實現(xiàn)在宿主菌中大量表達該羥化酶。通過 提供所需的碳源、氮源、微量元素等，將L-脯氨酸羥基化生成C3HP。
[0007] 下面，詳細地說明本發(fā)明生產(chǎn)C3HP的方法。
[0008] 本發(fā)明所述的重組微生物的構(gòu)建方法是合成P3H，然后用限制酶類處理合成的 P3H，做成合適的DNA片段，插入到表達載體中啟動子的下游，構(gòu)建可大量表達順式-3-脯 氨酸羥化酶的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導入到合適的宿主微生物中，得到產(chǎn)C3HP的重組微生 物。載體中的啟動子只要是能在宿主菌中表達的即可，可以是載體自帶的啟動子，如T7啟 動子或者Lac Z啟動子，以及大腸桿菌或噬菌體等的啟動子。也可以是外源的啟動子，經(jīng)過 一定處理連接到表達載體上，如色氨酸串聯(lián)啟動子Ptrp2。
[0009] 作為表達載體可以使用任何能在宿主菌中獨立進行復制或者可與宿主染色體發(fā) 生重組的載體。例如有pET系列質(zhì)粒、pUC19質(zhì)粒、PES質(zhì)粒、pAMP質(zhì)粒、pkl8mobsacB質(zhì)粒 等。作為宿主，可以表達目的基因的都可以使用，例如除了大腸桿菌屬，棒狀桿菌屬等屬的 微生物菌株外，還可以使用酵母菌株等。
[0010] 順式-3-脯氨酸羥化酶結(jié)構(gòu)基因只要是編碼順式-3-脯氨酸羥化酶的基因都可以 作為目的基因使用。例如來源于鏈霉菌THl (Str印tomyces sp. TH1)的編碼順式-3-脯氨 酸羥化酶的基因等。為了使P3H在宿主中表達，在基因合成前首先要經(jīng)過基因優(yōu)化，使其更 適于在宿主中表達。以大腸桿菌為宿主，通過一些在線工具，如JCAT，優(yōu)化了 P3H，然后通過 同義替換等方法消除一些在大腸桿菌中使用頻率低的密碼子，優(yōu)化mRNA的二級結(jié)構(gòu)，使得 核糖體能夠順利地沿著起始密碼子向后翻譯。
[0011] 對于如上所述構(gòu)建的重組微生物，進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基只要是含有宿主可以利用的 物質(zhì)，并能有效對宿主進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，無論是天然培養(yǎng)基或者合成培養(yǎng)基皆可。例如對 于用大腸桿菌作為宿主的微生物，只要培養(yǎng)基中含有可以利用的碳源、氮源、無機鹽等，可 以表達有活性的順式-3-脯氨酸羥化酶的培養(yǎng)基都可以。
[0012] 作為碳源，只要是微生物可以利用的均可以，如常見的淀粉、淀粉水解中間物、蔗 糖、葡萄糖和半乳糖等，也可有機酸（如醋酸、丙酸）和醇類（如乙醇、甘油）。作為氮源，可 以使用各種有機酸或者無機酸的銨鹽及任何含氮化合物。作為無機鹽，可以使用磷酸鹽、硫 酸鎂和鉀鹽等。必要時可以添加一定的微量元素。
[0013] 微生物的培養(yǎng)只要氧氣量、溫度、pH等條件適宜即可。大部分微生物需要在震蕩 或者通氣攪拌等好氧條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度最好在15~40°C、pH維持在3. 0~9. 0,此外， 培養(yǎng)時間為12~100小時。根據(jù)需要，還可向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素、卡那霉素等抗生 素。
[0014] 將培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物、菌體或者它們的處理物作為酶源，在2-酮戊二酸和亞鐵離 子存在下，于水性介質(zhì)中使L-脯氨酸羥基化為C3HP，再從該水性介質(zhì)中檢測生成的C3HP。 或者直接往微生物培養(yǎng)基中加入L-脯氨酸、2-酮戊二酸和亞鐵離子，從培養(yǎng)液中檢測生成 的 C3HP。
[0015] 檢測時只要能定量測定C3HP的方法即可。例如采用2, 4-二硝基氟苯（DNFB)柱前 衍生法將C3HP衍生化處理后，通過HPLC系統(tǒng)于360nm紫外檢測波長下測定C3HP的濃度。 或者采用比色法對C3HP進行定量，檢測前同樣要經(jīng)過一定的衍生化處理，然后在分光光度 計中于560nm檢測波長下進行測定。
【附圖說明】
[0016] 圖1.重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)，C3HP的代謝途徑。
[0017] 圖2.重組質(zhì)粒PES-Ptrp2-P3H圖譜
[0018] 圖 3.重組質(zhì)粒 pET21a-ptrp2-P3H 圖譜
[0019] 圖4.高效液相色譜結(jié)果圖，空白對照
[0020] 圖5.高效液相色譜結(jié)果圖，P3H液相色譜圖
[0021] 圖6.高效液相色譜結(jié)果圖，L-脯氨酸液相色譜圖
【具體實施方式】
[0022] 一般性說明：實施例所涉及的酶均購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒與瓊脂糖凝 膠回收試劑盒購自上海生物工程有限公司，操作完全按照相應說明進行。全基因合成由上 海旭冠公司完成。
[0023] LB培養(yǎng)基（％) :1 %胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，I % NaCl，ρΗ7·0。
[0024] Amp抗性平板：1%胰蛋白胨，0.5 %酵母提取物，1 % NaCl，氨芐青霉素 50 μ g/ml， I. 5%瓊脂粉。
[0025] 5XKCM(大腸桿菌轉(zhuǎn)化緩沖液）：0· 5M KC1，0. 15M CaCl2,0. 25M MgCL2。
[0026] 實施例1 :脯氨酸-3-羥化酶基因序列的設計
[0027] 對編碼脯氨酸-3-羥化酶的基因 P3H進行全基因合成。該合成的DNA序列來自鏈 霉菌THl (Str印tomyces sp. TH1)，但在該堿基序列中，對P3H基因?qū)嵤┝嘶騼?yōu)化處理。具 體優(yōu)化步驟如下：根據(jù)大腸桿菌的密碼子使用頻率來優(yōu)化P3H密碼子，消除低頻密碼子，同 時利用同義替換方法消除EcoR I和Xmn I酶切位點，并將終止子改為強終止子TAAT。為便 于將脯氨酸-3-羥化酶基因連接到其他質(zhì)粒載體上，分別在脯氨酸-3-羥化酶基因的5'端 設計了 EcoR I、Hind III，3'端設計了 BamH I酶切位點。
[0028] 在蛋白的表達過程中，基因序列5'末端的二級結(jié)構(gòu)會對蛋白的翻譯產(chǎn)生影響，因 此需對其mRNA的二級結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，保證起始密碼子ATG及其后的數(shù)個堿基組成的密碼子 呈開環(huán)狀態(tài)，降低核糖體結(jié)合到mRNA上的能勢，使得核糖體能夠順利地沿著起始密碼子向 后翻譯。
[0029] 本實施方式中脯氨酸-3-羥化酶基因序列的原始序列，見GenBank:AF003371. 1。 本實施方式中優(yōu)化的脯氨酸-3-羥化酶基因序列提交給上海旭冠公司進行全基因合成；優(yōu) 化后的脯氨酸-3-羥化酶結(jié)構(gòu)基因 P3H序列見序列表。
[0030] 實施例2 :脯氨酸-3-羥化酶基因表達載體及重組大腸桿菌的構(gòu)建
[0031] 合成的P3H用限制性內(nèi)切酶EcoR I (GAATTC)和Hind III (AAGCTT)處理，使用含 有限制性內(nèi)切酶 Eco