一種強(qiáng)化畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種強(qiáng)化畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，屬于發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用甘露醇混合流加、兩步式甲醇流加等策略高密度發(fā)酵不同葡萄糖氧化酶畢赤酵母工程菌株，建立了一種能夠有效提高葡萄糖氧化酶生產(chǎn)的方法。使用該策略，重組菌株P(guān)P-G-GCN4在甘露醇與甲醇混合比例為1：20、兩階段甲醇控制量1.8-1.2％時，在3L發(fā)酵罐上酶活1634.7U/mL。這為葡萄糖氧化酶的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專利說明】-種強(qiáng)化畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種強(qiáng)化畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，屬于發(fā)酵技術(shù) 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖氧化酶是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一。自1967年化dike和Hicks將 GOD固定在Clark氧電極表面，將其應(yīng)用于血糖測定W來，GOD被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī) 藥等許多相關(guān)領(lǐng)域。
[0003] 在食品工業(yè)中，由于氧的存在，引起許多不利于產(chǎn)品質(zhì)量的化學(xué)反應(yīng)，并為許多微 生物生長創(chuàng)造了條件。目前，許多國家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種 食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化 氨、形成葡萄糖酸四個方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速 準(zhǔn)確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量，指導(dǎo)生產(chǎn)。
[0004] 在醫(yī)藥工業(yè)中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清（漿）、尿液及腦脊液中葡萄糖 的體外定量分析；GOD制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和離齒的形成防止口 腔疾病和牙病的發(fā)生。此外，由于可W催化生成肥02,還可用于對肥02敏感的淋己瘤的導(dǎo) 向目標(biāo)的治療。
[0005] GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環(huán)境，調(diào)節(jié)飼糧消化，促進(jìn) 動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預(yù)防牲畜 胃腸道感染、腹瀉，并有促進(jìn)動物生長作用。
[0006] 從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細(xì)菌GOD產(chǎn)酶量少； 一般采用黑曲霉（具有GRAS資格）和青霉屬菌株作為GOD生產(chǎn)菌。我國及美國均采 用點(diǎn)青霉及產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)G0D，日本常用尼崎青霉，俄羅斯用生機(jī)青霉，近年報道膠霉屬 (Clioctadium)、擬青霉屬（Paecilomyces)和靑霉屬（Scopulariopsis)也能生產(chǎn) GOD。
[0007] 產(chǎn)量低、酶活低、檢測方法復(fù)雜是GOD產(chǎn)業(yè)化的限制性因素，國內(nèi)外為此做了大量 工作并取得了明顯進(jìn)展。目前國外生產(chǎn)的GOD廠家主要是德國的Boe虹inger和日本的 T0Y0B0。規(guī)?；a(chǎn)高活性的GOD還有困難。發(fā)酵生產(chǎn)GOD的同時產(chǎn)生大量雜蛋白，分離 提取復(fù)雜，成本高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明采用兩步式甲醇流加結(jié)合甘露醇混合流加策略強(qiáng)化畢赤酵母工程菌株高 密度發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶，建立了一種能夠有效提高葡萄糖氧化酶生產(chǎn)的方法。
[0009] 本發(fā)明提供了一種強(qiáng)化畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，W醇氧化酶 (AO幻啟動子誘導(dǎo)GOD表達(dá)，在誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段分時段控制不同甲醇濃度，當(dāng)菌體濃度達(dá)到 90-100. Og/l，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶，誘導(dǎo)期前期，醇氧化酶活性升高趨于平穩(wěn)，控 制發(fā)酵體系中殘余甲醇濃度17. 0-18. Og/l，誘導(dǎo)期中后期，醇氧化酶開始活性下降，控制發(fā) 酵體系中殘余甲醇濃度n. 0-12. Og/L。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，W醇氧化酶（AO幻啟動子誘導(dǎo)GOD表達(dá)，在誘導(dǎo)產(chǎn)酶 階段分時段控制不同甲醇濃度，當(dāng)菌體濃度達(dá)到90-100. Og/l，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn) 酶，誘導(dǎo)期0-60h時，控制發(fā)酵體系中殘余甲醇濃度17. 0-18. Og/l，誘導(dǎo)6化后將發(fā)酵體系 中的甲醇濃度降至11. 0-12. Og/L。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，當(dāng)菌體濃度培養(yǎng)達(dá)到100. Og/u開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng) 基誘導(dǎo)產(chǎn)酶，誘導(dǎo)期0-6化時，控制發(fā)酵體系中殘余甲醇濃度18. Og/L，誘導(dǎo)60h后將發(fā)酵體 系中的甲醇濃度降至12. Og/L。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，基本發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基（IL):膜蛋白腺 2〇g，酵母抽提物lOg，甘油IOmL, YNB 13. 4g，IOOmM磯酸緩沖液（P冊.0)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 BMMY培養(yǎng)基（IL);膜蛋白腺20g，酵母抽提物lOg，甲醇8血，YNB 13. 4g，IOOmM磯酸緩沖液 (抑6. 0)。
[0013] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，在誘導(dǎo)產(chǎn)酶期分時段控制甲醇誘導(dǎo)濃度的同時， 流加甘露醇，甘露醇；甲醇為1:10?40 (w/w)。
[0014] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，甘露醇：甲醇為1:20 (w/w)。
[001引在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還添加了 12mL/L的PTMi。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述畢赤酵母工程菌株除了表達(dá)黑曲霉葡萄糖氧化 酶基因G0D，還共表達(dá)了畢赤酵母GCN4基因。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建，是將GOD基因連接 載體PPIC9K，轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GSl 15,得到工程菌株P(guān)P-GOD ;將畢赤酵母中GCN4基因 克隆連接到去除了 a -mating信號膚的pGAPZ a A(pGAPZ)，轉(zhuǎn)化入工程菌株P(guān)P-G0D，與GOD 共表達(dá)，得到工程菌株P(guān)P-G-GCN4。所述黑曲霉葡萄糖氧化酶基因GOD來源于黑曲霉CCTCC NO ;M2011291，GCN4基因的核巧酸序列如Gene 10:8197788所示。
[0018] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將培養(yǎng)好的重組菌菌液W接種量為10%無菌操作接 入化全自動發(fā)酵罐（LiFlus GM BioTR0N，Korea)中。初始條件為；裝液量800-1000血， 初始攬拌轉(zhuǎn)速為5(K)r/min，通氣量2. 5vvm，W 30 %的磯酸溶液和25 %的濃氨水控制抑為 5. 5,生長期的培養(yǎng)溫度為3(TC，采用攬拌關(guān)聯(lián)的DO-Stat控制，維持DO在30 %，攬拌轉(zhuǎn)速 最高值設(shè)置為95化/min。當(dāng)甘油耗盡（DO迅速上升）時，D0〉60%時，開始指數(shù)流加50%的 甘油培養(yǎng)基，當(dāng)菌濃接近l〇〇g/U99g/L)，停止流加，待甘油耗盡，DO再次反彈，當(dāng)D0〉60%， 開始誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)溫度降低至22C，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基甲醇濃度迅速達(dá)到目標(biāo) 濃度，通過FC2002型甲醇檢測流加控制器控制甲醇?xì)埩魸舛取?br> [0019] 本發(fā)明的有益效果；重組菌株P(guān)P-G-GCN4在化發(fā)酵罐上酶活1634. 7U/mL。該為 葡萄糖氧化酶的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1不同甘露醇量誘導(dǎo)培養(yǎng)基流加對產(chǎn)GOD的影響；A，甘露醇/甲醇0 ;B，甘露醇 /甲醇1:40 ;C，甘露醇/甲醇1:20 ;D，甘露醇/甲醇1:10 ; 細(xì)胞干重，O甲醇濃度，▲ GOD 活性，?甘露醇濃度。
[0021] 圖2兩階段甲醇流加對產(chǎn)GOD的影響；□對照，▲ 1. 8-2. 4%，? 1. 8-1. 2%
[002引 圖3混合策略對產(chǎn)GOD的影響；A, GOD活性；B，GOD比酶活；C，AOX活性；□ I. 8 % 甲醇，▼ 1:20甘露醇/甲醇，? 1.8-1. 2%甲醇，O混合策略
[0023] 圖4PP-G-GCN4菌株使用混合策略后產(chǎn)GOD的能力；A，GOD活性；B，GOD比酶活；C， AOX 活性；D，SDA-PAGE ;□ PP-G孤 1. 8% 甲醇，? PP-G-GCN41. 8% 甲醇，O PP-G孤混合策略， ? PP-G-GCN4混合策略。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 表1本發(fā)明構(gòu)建菌株與質(zhì)粒
[00 巧]

【權(quán)利要求】
1. 一種強(qiáng)化畢赤酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，以甲醇誘導(dǎo)的 醇氧化酶啟動子啟動GOD表達(dá)，在誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段分時段控制不同甲醇濃度，當(dāng)菌體濃度達(dá) 到90-100. Og/L，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶，誘導(dǎo)期前期，醇氧化酶活性升高并趨于平 穩(wěn)，控制發(fā)酵體系中殘余甲醇濃度17. 0-18. Og/L，誘導(dǎo)期中后期，醇氧化酶開始活性下降， 控制發(fā)酵體系中殘余甲醇濃度11. 0-12. Og/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)菌體濃度達(dá)到90-100. Og/L，開始流加 誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶，誘導(dǎo)期〇_6〇h時，控制發(fā)酵體系中殘余甲醇濃度17. 0-18. 0g/L，誘導(dǎo) 60h后將發(fā)酵體系中的甲醇濃度降至11. 0-12. 0g/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，當(dāng)菌體濃度培養(yǎng)達(dá)到100. 0g/L，開始 流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)酶，誘導(dǎo)期0_60h時，控制發(fā)酵體系中殘余甲醇濃度18. 0g/L，誘導(dǎo) 60h后將發(fā)酵體系中的甲醇濃度降至12. 0g/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，基本發(fā)酵培養(yǎng)基每1L含有：胰蛋白 胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13. 4g，lOOmM pH6. 0的磷酸緩沖液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)培養(yǎng)基每1L含有：胰蛋白胨20g， 酵母抽提物l〇g，甲醇8mL，YNB13. 4g，100mMpH6. 0的磷酸緩沖液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在誘導(dǎo)產(chǎn)酶期分時段控制甲醇誘導(dǎo)濃度 的同時，流加甘露醇，甘露醇：甲醇的質(zhì)量比為1:10?40。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，甘露醇：甲醇的質(zhì)量比為1:20。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述畢赤酵母還共表達(dá)了畢赤酵母GCN4 基因。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將黑曲霉GOD基因連接載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化 Pichia pastoris GS115,得到工程菌株P(guān)P-G0D;將畢赤酵母中GCN4基因克隆連接到去除 了 pGAPZ a A的a -mating信號肽的載體pGAPZ，轉(zhuǎn)化入工程菌株P(guān)P-G0D，與GOD共表達(dá)，得 到工程菌株P(guān)P-G-GCN4,用于高密度發(fā)酵產(chǎn)GOD。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將種子菌液接入3L全自動發(fā)酵罐中，裝 液量800-10001^，初始攪拌轉(zhuǎn)速為5001'/1^11，通氣量2.5^111，以30%的磷酸溶液和25%的 濃氨水控制pH為5. 5,生長期的培養(yǎng)溫度為30°C，采用攪拌關(guān)聯(lián)的DO-stat控制，維持DO在 30(%，攪拌轉(zhuǎn)速最高值設(shè)置為9501'/1^11;當(dāng)甘油耗盡時，00>60 (%時，開始指數(shù)流加50(%的 甘油培養(yǎng)基，待菌濃接近l〇〇g/L，停止流加，待甘油耗盡，DO再次反彈，當(dāng)D0>60%，開始誘 導(dǎo)，將誘導(dǎo)溫度降低至22°C，開始流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使發(fā)酵體系中甲醇濃度達(dá)到目標(biāo)濃度。
【文檔編號】C12N9/04GK104357417SQ201410606913
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】張娟, 陳堅, 顧磊, 堵國成, 沈伊娜 申請人:江南大學(xué)