L， 融合蛋白40 μ L，重組牛腸激酶0. 5U，CldH2O 4. 5 μ L，總反應(yīng)體系為50 μ L，25 °C溫浴反應(yīng) 12h 和 16h 后，Tricine-SDS-PAGE
[0027] 觀察酶切效果。
[0028] 本發(fā)明的有益效果是，抗菌肽VIP類似肽的生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，抑菌能力 強(qiáng)且抗菌譜廣，極具市場(chǎng)前景。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1是本發(fā)明的重疊 PCR產(chǎn)物電泳圖；
[0030] 圖2是本發(fā)明的pET32-VIP2在BL21 (DE3)中的表達(dá)圖；
[0031] 圖3是本發(fā)明的BL21-pET32-EK-VIP2表達(dá)及純化的融合蛋白的電泳圖；
[0032] 圖4是本發(fā)明的腸激酶酶切融合蛋白的電泳圖；
[0033] 圖5是本發(fā)明的抗菌肽VIP類似肽對(duì)大腸桿菌ATCC 25922的抑菌活性；
[0034] 圖6是本發(fā)明構(gòu)建的抗菌肽VIP類似肽的重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜。
[0035] 在圖2中，M.蛋白marker，1.誘導(dǎo)前全菌蛋白，2.誘導(dǎo)4h后全菌蛋白，3.超聲上 清中的蛋白，4.超生沉淀中的蛋白；
[0036] 在圖3中，M.蛋白marker，1.誘導(dǎo)4h后全菌蛋白，2.超聲上清中蛋白，3.純化后 的目的蛋白；
[0037] 在圖4中，M.蛋白marker，1和2. EK切割前的融合蛋白，3和4. EK切割后的融合 蛋白；
[0038] 在圖5中，1.化學(xué)合成抗菌肽VIP類似肽，濃度為32 μ g/mL，2.重組表達(dá)抗菌肽 VIP類似肽，腸激酶酶切融合蛋白后的溶液50 μ L。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0040] 本發(fā)明提供了一種抗菌肽VIP類似肽為如下氨基酸序列： HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN 〇
[0041] 實(shí)施例1 :抗菌肽VIP類似肽的制備方法：
[0042] (1)抗菌肽VIP類似肽基因的合成：
[0043] 天然動(dòng)物源性抗菌肽是一種神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)肽，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單明確，具有多種生物學(xué)活 性，而且作用濃度小，具有開發(fā)潛力；但是其抗菌活性相對(duì)較低，針對(duì)此，通過(guò)分子，在保留 其安全性的基礎(chǔ)上提高到期抗菌活性，并通過(guò)基因工程的方法進(jìn)行制備，以提高其應(yīng)用性。
[0044] 根據(jù)GeneBank中抗菌肽VIP的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)，將D3、D8替換 為K3、K8,對(duì)其進(jìn)行改良。改良前后的氨基酸序列如下：
[0045] 改良前：HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN
[0046] 改良后：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN
[0047] 為避免本發(fā)明抗菌肽VIP類似肽對(duì)大腸桿菌宿主菌的毒性，將TrxA與改良抗菌肽 VIP進(jìn)行融合表達(dá)，在抗菌肽VIP類似肽的核苷酸序列3'端添加終止密碼子TAA，5'端添加 了腸激酶（Enterokinase，EK)識(shí)別序列DDDDK，以便融合蛋白被EK切割，釋放出具有N端無(wú) 額外氨基酸的VIP ;使用XhoI和KpnI限制性內(nèi)切酶構(gòu)建重組質(zhì)粒，在基因兩端分別設(shè)計(jì)了 與pET32a(+)Xh〇I和KpnI位點(diǎn)相同的序列，便于雙酶切；新的核苷酸序列為119bp :GGGGTA CCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACACTCGTCTGCGTAAGCAGATGGCTGTCAAG AAGTACCTGAACTCCATCCTGAACTAACTCGAGCGG
[0048] 上述序列中：方框顯示分別為XhoI和KpnI酶切位點(diǎn)；下劃線標(biāo)識(shí)為EK識(shí)別序列； 藍(lán)色顯示為終止密碼子；黑體傾斜部分為VIP類似肽的基因序列。
[0049] 為了獲得上述目的基因，由此，設(shè)計(jì)合成了 3條引物P1、P2和P3,引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為 119bp，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見下述說(shuō)。其PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果如附圖1所 示，進(jìn)一步經(jīng)測(cè)序鑒定，說(shuō)明已成功合成該抗菌肽基因；
[0050] Pl:
[0051] 5'-GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACAC-3' ；
[0052] P2:5'-CCGCTCGAGTTAGTTCAGGATGGAGTTCAGGTACTTCTTGACAGCCATCTG-3' ；
[0053] P3:
[0054] 5' 一CTTCTTGACAGCCATCTGCTTACGCAGACGAGTGTAGTTCTTAGTGAAG-3' ；
[0055] 上述序列Pl和P2中的方框分別表示XhoI和KpnI酶切位點(diǎn)。
[0056] 該抗菌肽VIP類似肽基因的PCR反應(yīng)體系為！IOXBuffer含Mg2+5yL，dNTP 2. 5mM 4μ?，3|#)Ρ15μΜ10μ?，3|#)Ρ25μΜ0·5μ?，3|#)Ρ35μΜ10μ?，ρ?·ιι0·5μΙ^Ρα??^ 條件如下：94°C預(yù)變性 5min ;94°C 30s，60°C40s，72°C Imin 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min ; 25°C保存，使用I. 5 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。
[0057] (2)抗菌肽VIP類似肽的重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定：
[0058] 對(duì)重疊延伸PCR法（SOE-PCR)擴(kuò)增獲得的基因和pET32a(+)分別同時(shí)進(jìn)行雙酶 切，然后進(jìn)行連接，以將目的基因構(gòu)建到到表達(dá)載體上，獲得的重組質(zhì)?？删幋aTrxA-VIP2 融合蛋白。使用雙酶切連接法構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，按外源基因與質(zhì)粒摩爾數(shù)比為3 :1的比例 進(jìn)行混合，反應(yīng)體系為10uL，16°C過(guò)夜，同樣轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法如下：從-80°C 冰箱中取出制備好的DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰水浴中；將上述IOuL連接 體系加入到感受態(tài)中，冰浴30min ;42°C水浴脈沖60s，快速移至冰水浴中放置2min，加入 500uLLB，37°C 180rpm搖床培養(yǎng)Ih ;取部分菌液涂布于LB平板（含100ug/mL氨芐青霉素）； 37°C倒置培養(yǎng)12?16h，有單菌落長(zhǎng)出，進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明測(cè)定結(jié)果與設(shè) 計(jì)的基因序列完全一致，說(shuō)明抗菌肽VIP類似肽的表達(dá)載體構(gòu)建成功，圖6是本發(fā)明構(gòu)建的 抗菌肽VIP類似肽的重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜。
[0059] (3)抗菌肽VIP類似肽對(duì)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)：
[0060] 將融合表達(dá)質(zhì)粒pET32-VIP2轉(zhuǎn)化E. coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到 pET32-VIP2/BL21(DE3)重組菌。重組菌接種至15mL LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，以BL21(DE3) 和pET32a (+)為對(duì)照，按1 %接種量分別接種于30mL新鮮培養(yǎng)基中，吸光度A_達(dá)0. 6左右 時(shí)用IPTG誘導(dǎo)（終濃度0. 3mmol/L)，誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后4h分別測(cè)定A_，分別取適量的菌體 量進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如附圖2所示，說(shuō)明該抗菌肽VIP類似肽已經(jīng)在大腸桿菌中得到了高 效表達(dá)。
[0061] (4)融合蛋白的純化：
[0062] 培養(yǎng) pET32-VIP2/BL21 (DE3)，誘導(dǎo)表達(dá) 4h 后收集菌體，用 A 液（20mmol/L PBS+0. 5mol/L NaCl, ρΗ8· 0)清洗，8000r/min 離心 5min，重復(fù)清洗 1 次，再以 1:10 的比例 (V :〇D)的比例將菌體重懸于A液，超聲破碎后，4°C 15000r/min離心15min，收集上清液，經(jīng) BeaverBeadsTM金屬離子螯合磁珠進(jìn)行純化，以含500mmol/L咪挫的洗脫液洗脫，可得到純 化后的融合蛋白TrxA-VIP2,結(jié)果如附圖3所示，說(shuō)明通過(guò)該純化方法，可以較為有效的除 去雜蛋白。
[0063] (5)抗菌肽VIP類似肽的釋放：
[0064] 為獲得抗菌肽VIP類似肽，需用人工引入的腸激酶切割位點(diǎn)切割融合蛋白 TrxA_VIP2,去除擔(dān)體蛋白，釋放目標(biāo)抗菌肽；將純化后的融合蛋白經(jīng)Sephadex G-25柱脫 鹽和超濾管濃縮后進(jìn)行腸激酶切割；腸激酶酶切反應(yīng)體系如下：1〇Χ重組牛腸激酶反應(yīng)緩 沖液5 μ L，融合蛋白40 μ L，重組牛腸激酶0. 5U，CldH2O 4. 5 μ L，總反應(yīng)體