一種油菜抗菌肽BnCRP1及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種油菜抗菌肽BnCRPl及其應 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 病原菌可引起包括人類，牲畜，作物和其他生物的嚴重病害，造成嚴重的經(jīng) 濟損失。植物病原真菌是植物的重要病原菌，可引起80%以上的植物病害（張福麗， 王占斌，王志英.幾丁質(zhì)酶在植物抗真菌病害中的作用.林業(yè)科技.2006,31 (3): 24-27)，造成世界糧食作物減產(chǎn)約 20 % (Knight S.C·，Anthony V.M·，Brady A.M.，et al. Rationale and perspectives on the developmentof fungicides. Annu Rev Phytopathol，1997,35:349-372)。許多重要植物病害都是真菌造成的，如馬鈴薯晚疫病、 稻瘟病、小麥白粉病、玉米大小斑病菌、大豆灰斑病、油菜菌核病等，每年都造成非常巨大 的經(jīng)濟損失。另一方面，真菌在侵染植物的過程中，釋放出來的代謝產(chǎn)物一一真菌毒素 (mycotoxin)，對農(nóng)作物以及人類的健康也造成極大的危害，如黃曲霉毒素（aflatoxin) 等。
[0003] 核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum)屬于子囊菌亞門、盤菌綱、柔膜菌目、核盤 菌科、核盤菌屬。是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。核盤菌可以廣 泛地侵染很多單子葉和雙子葉植物。核盤菌引起的菌核病是一種類似于灰霉的腐生營 養(yǎng)型真菌，這種破壞性病源侵染超過400種植物，分布廣泛。目前對菌核病的防治主要 依靠化學農(nóng)藥，然而化學防治不僅成本高、污染環(huán)境，而且防效也不理想；同時，食品的安 全性也受到嚴重影響。油菜是世界上重要的油料作物之一，菌核病造成油菜的根，莖和角 果的腐爛，導致了巨大的產(chǎn)量損失。盡管菌核病嚴重威脅了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，植物對核盤菌的 寄主抗性的分子機制，我們依然知之甚少。暨今為止還沒有發(fā)現(xiàn)完全免疫或者高抗的油 菜栽培品種（Liu, S.，Wang, H.，Zhang, J.，F(xiàn)itt, B. D.，Xu, Z.，Evans, N.，Liu, Y.，Yang, W. ,and Guo, X. 2005. In vitro mutation and selection of doubled-hapIoid Brassica napus lines with improved resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Plant Cell Rep. 24:133-144)，因此，探宄植物對這種病源的抗性機制，發(fā)現(xiàn)新的抗性基因具有深遠意 義。
[0004]目前常用的病害防治措施，主要依靠化學農(nóng)藥，然而化學防治不僅成本高、污染環(huán) 境，而且防效也不理想；同時，食品的安全性也會受到嚴重影響。隨著社會的進步，人們越來 越深刻地認識到長期大量使用化學農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境和人類健康的危害。生物防治可以有效 地克服這些弊端，因而生物農(nóng)藥越來越受到人們的重視。
[0005] 抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs)是一類具有抗菌活性的天然小分子 蛋白，廣泛存在于生物界，是機體非特異性免疫的重要組成部分，在體內(nèi)體外均具有抗菌 活性(Gordon YJ, Romanowski EG, A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Drugs. Curr Eye Res. 2005, 30(7):505 - 515)?？咕牡膹V泛的生物學活性，對細菌真菌、原生動物、病毒和腫瘤等有很強的抑制作 用，具有高效、環(huán)保、不使病原菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點使它在生物防治和醫(yī)學上具有良好的應 用前景（Gordon YJ, Romanowski EG, A Review of Antimicrobial Peptides and Their Therapeutic Potential as Anti-Infective Drugs. Curr Eye Res.2005, 30(7):505 -515)。近年來已經(jīng)成為植物抗病基因工程、養(yǎng)殖飼料添加劑，食品防腐劑、新興醫(yī)藥等領(lǐng)域的 研宄熱點，在疾病防治領(lǐng)域中是抗生素的理想替代品（Boman HG，Peptide antibiotics and their role in innateimmunity. Annu Rev Immunol. 1995,13 :61-92) 〇 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程 中，用抗菌肽進行植保工作可以避免農(nóng)用抗生素通過食物鏈的傳遞對人體產(chǎn)生的威脅。
[0006] 按照氨基酸序列及二級結(jié)構(gòu)，已發(fā)現(xiàn)的植物抗菌肽可以分為植物防御素 (plant defens ins)、車專月旨蛋白(lipidtransfer proteins，LTPs)，硫素（thionins)，蛻 皮素（snakins)，橡膠蛋白類（hevein-like)，打結(jié)素類（knottin-like peptides)，鳳 仙花素（IbAMP)，和新近發(fā)現(xiàn)的養(yǎng)菜素（shepherdins)、環(huán)肽（cyclotides)等（Hancock REff, Chappie DS，Peptide Antibiotics. Antimicrob Agent Chemother, 1999,43 (6)： 1317-1323)?？咕幕旧隙季哂幸恍┕残?，如：小分子量（〈lOKDa)，陽離子表面、正電荷 以及兩親性，這些特性使得抗菌肽能夠和細胞膜綁定并能夠插入到細胞內(nèi)部，大部分抗菌 肽是通過破壞細胞膜從而使目標細胞死亡而達到殺菌目的。而另一些抗菌肽卻能夠通過細 胞膜上的離子通道進入到細胞內(nèi)部破壞細胞而不破壞細胞膜（Vogel PMHaHJ:Structure-function relationships of antimicrobial peptides. Biochem Cell Biol 1998, 76:235-246.)。大多數(shù)類型的植物源抗菌肽對動物和植物細胞都沒有毒性（Murad AM. Pelegrini PB. Neto SM. Novel Findings of Defensins and their Utilization in Construction of Transgenic Plants. Transgenic Plant Journal 2001 (I):39-48)〇 與 動物源抗菌肽相比，植物源抗菌肽更易于在作物中表達和調(diào)控，不容易被細胞內(nèi)的蛋白酶 降解。與其他殺菌劑相比，植物來源的抗菌肽對環(huán)境的影響更小，更友好，更具開發(fā)成為抗 真菌生物制劑的潛力（Hancock REW, Chappie DS，Peptide Antibiotics. Antimicrob Agent Chemother，1999,43 (6) :1317-1323)。如將Rs-AFPs等植物抗菌肽基因?qū)胛⑸镏羞M行 發(fā)酵，更容易克服對宿主的毒性作用而進行大量生產(chǎn)。
[0007] 抗菌肽是一類對細菌、真菌等微生物有抑制或殺滅作用的小分子肽，它能被細 菌、真菌或物理的、化學的刺激所誘導，甚至有些抗菌肽在植物體內(nèi)能形成組成性的表達。 它不僅能抗多種細菌，而且可以抑殺真菌、病毒等，可用于轉(zhuǎn)化農(nóng)作物、培養(yǎng)抗病品種，因 而在植物育種基因工程領(lǐng)域中具有廣闊的應用前景。首先在模式植物煙草與馬鈴薯抗青枯 病研宄中獲得成功，隨后在水稻白葉枯病菌和細條病菌蘋果的梨火疫病，菊花、辣椒、茄子 等作物的細菌、真菌病研宄中均取得了一定效果。將蘿卜抗菌肽基因（AFP)轉(zhuǎn)基因到馬鈴 薯中可獲得晚疫病抗性等（任玉霞，陳凌娜，陳繼峰，陳正華，馬鈴薯轉(zhuǎn)蘿卜抗菌肽基因 植株的獲得及抗晚疫病的初步鑒定，中國蔬菜2012 ￠) :68-73)。
[0008] 植物源抗菌肽都有廣譜抗真菌或細菌活性，在一種植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽可以有效 的應用到其他多種植物中，如蘿卜中來源的抗菌肽能夠通過轉(zhuǎn)基因的方法轉(zhuǎn)到野罌粟、馬 鈴薯和小麥中分別達到抗馬鈴薯晚疫病和小麥鐮刀菌的效果（魏玉杰，張梅秀，常瑛， 雒淑珍，陳凌娜，野罌粟花粉介導法轉(zhuǎn)蘿卜抗菌肽基因方法研宄，甘肅農(nóng)業(yè)科技2009(11): 6-9;任玉霞，陳凌娜，陳繼峰，陳正華，馬鈴薯轉(zhuǎn)蘿卜抗菌肽基因植株的獲得及抗晚疫病的 初步鑒定，中國蔬菜 2012(6) :68-73 ;Zhao Li，Miaoping Zhou，Zengyan，ZhangLi，juan Ren，LipuDu，Boqiao Zhang，Huijun Xu，Zhiyong Xin，Expression of a radish defensin in transgenic wheat confers increased resistance to Fusarium graminearum and Rhizoctonia cerealis Funct Integr Genomics 2011，11:63 - 70) D 抗菌肽作為新興抗病 基因資源，對改良水稻、大豆、棉花、油菜等作物對真菌病害的抗性有著重要意義。
[0009] 抗菌肽因其獨特的抗菌機理，廣譜的抗菌性以及不易產(chǎn)生耐藥性等特點，在各行 各業(yè)中都有良好的應用前景，因此也已經(jīng)受到越來多的關(guān)注，成為前沿領(lǐng)域的研究熱點 (Hancock REWj Chappie DS，Peptide Antibiotics. Antimicrob Agent Chemother，1999， 43(6) :1317-1323)。但是，目前植物來源的抗菌肽還很難真正應用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中。主 要是因為目前鑒定的有功能的植物來源抗菌肽數(shù)量很少，從而在很大程度上限制了植物抗 菌肽的應用?？咕臄?shù)據(jù)庫中經(jīng)過驗證的抗菌肽基因目前達到1600多個，而植物抗菌肽僅 有不到300個（http://ercbinfol. ucd. ie/APFDb/)。被鑒定的植物來源抗菌肽基因數(shù)量少 的主要原因如下：1、抗菌肽基因相對比較小，容易降解，且含量低，難以檢測和鑒定；2、抗 菌肽分子量小，分離純化困難，提取步驟煩瑣、得率低；3、體外表達純化困難，導致難以開展 體外抑菌活性檢測來驗證功能；4、缺乏高效的預測篩選方法；5、抗菌肽化學合成成本高， 價格昂貴。如何高效的預測具有功能的新植物抗菌肽，實現(xiàn)其水平表達并降低成本成為目 前抗菌肽研究與應用的瓶頸。
[0010]由本發(fā)明申請人中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所負責、中國農(nóng)科院蔬菜 所、深圳華大基因研究院、華中農(nóng)業(yè)大學、湖南大學、西南農(nóng)業(yè)大學、江蘇農(nóng)科院、四 川農(nóng)科院、青海大學，并吸收英、澳、美、法等國相關(guān)研究機構(gòu)科研人員合作完成了甘 藍和油菜的全基因組測序和分析，甘藍和油菜基因組部分結(jié)果論文已發(fā)表（Shengyi Liu j Yumei Liuj Xinhua Yang, Chaobo Tong, David Edwards, Isobel A. P. Parkin, Meixia Zhao,Jianxin Ma，Jingyin Yu，Shunmou Huang, Xiyin Wang, Junyi Wang, Kun Lu, Zhiyuan Fang,Ian Bancroft, Tae-Jin Yang, Qiong Huj XinfaWangj Zhen Yue，Haojie Li, Linfeng Yang,Jian Wuj Qing Zhou,Wanxin Wang, Graham J.King,J.Chris Piresj Changxin Lu, ZhangyanWuj Perumal Sampathj ZhuoWangj Hui Guo,Shengkai Pan, Limei Yang, Jiumeng Min，Dong Zhang, Dianchuan Jinj Wanshun Li,Harry Belcramj Jinxing Tuj Mei Guanj Cunkou Qil8,Dezhi Dulj Jiana Li, Liangcai Jiang, Jacqueline Batleyj Andrew G.Sharpe,Beom-Seok Park, Pradeep Ruperaoj Feng Cheng, Nomar Espinosa Waminal Yin Huang,Caihua Dong, LiWangj Jingping Li, Zhiyong Huj Mu Zhuangj Yi Huang, Junyan Huang, Jiaqin Shi，Desheng Meij Jing Liuj Tae-Ho Lee, Jinpeng Wang, Huizhe Jinj Zaiyun Li, Xun Li, Jiefu Zhang, Lu Xiao, Yongming Zhou, Zhongsong Liu，Xuequn Liuj Rui QinjXu TangjWenbin LiujYupengWangjYangyong ZhangjJonghoon LeejHyun Hee Kim，F(xiàn)rance Denoeudj Xun Xu，Xinming Liang, Wei Huaj Xiaowu Wang, Jun Wang, Boulos Chalhoub&Andrew H.Paterson. The Brassica oleracea genome reveals the as