一種抗菌肽vip類似肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗菌肽VIP類似肽及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 和諧畜牧業(yè)是我國(guó)當(dāng)前畜牧業(yè)發(fā)展的主題，其重要內(nèi)容之一就是動(dòng)物-人-自然 的和諧，而動(dòng)物健康直接關(guān)系到動(dòng)物源性食品品質(zhì)與安全以及環(huán)境。然而，抗生素的大量使 用甚至濫用導(dǎo)致病原菌耐藥性菌株甚至超級(jí)細(xì)菌產(chǎn)生、抗生素在畜禽產(chǎn)品中殘留以及隨動(dòng) 物糞尿排出污染環(huán)境等一系列嚴(yán)峻問(wèn)題，嚴(yán)重影響了畜產(chǎn)品品質(zhì)和人類健康。因此，研制安 全、高效、環(huán)保型防病保健促生長(zhǎng)添加劑來(lái)替代抗生素已顯得極為迫切。抗菌肽因其具有廣 譜抗菌、耐熱、無(wú)毒無(wú)藥殘、不易產(chǎn)生耐藥菌株等眾多的優(yōu)點(diǎn)，其研宄開(kāi)發(fā)已成為世界上研 宄抗生素新產(chǎn)品的前沿性課題，被認(rèn)為是新型抗生素研宄的新資源和重要途徑?？咕腣IP 具有開(kāi)發(fā)為防病保健飼料添加劑的優(yōu)勢(shì)和潛力：（1)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單明確：由28個(gè)氨基酸殘基組 成的直鏈肽；（2)具有多種生物學(xué)活性，而且活性較強(qiáng)：免疫調(diào)節(jié)、抗炎，對(duì)大腸桿菌、金黃 色葡萄球菌等具有較強(qiáng)的抑殺作用；（3)作用濃度小：由于VIP屬于內(nèi)源性的胃腸道激素類 抗菌肽（腦腸肽），因此，以較小的作用濃度（nmoL級(jí)）就能發(fā)揮較強(qiáng)的生物活性。VIP本身 具有的特性使它具有開(kāi)發(fā)為高效、安全的防病保健飼料添加劑的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 然而，由于抗菌肽天然資源有限，化學(xué)合成肽類成本高，而基因工程方法大量表達(dá) 抗菌肽使之成為新興飼料和飼料添加劑的途徑更為現(xiàn)實(shí)，并顯示出良好前景。隨著對(duì)抗菌 肽構(gòu)效關(guān)系、作用機(jī)制及其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深化，設(shè)計(jì)高效、有利于人類健康 的抗菌肽作為抗生素替代品是完全可行的。利用基因工程方法獲得抗菌肽的嘗試已在原核 和真核體系獲得成功，但異源高效表達(dá)抗菌肽仍面臨多種困難，一是抗菌肽的編碼基因轉(zhuǎn) 錄后的mRNA較小，一般只有100?200bp，同時(shí)其表達(dá)的抗菌肽在表達(dá)細(xì)胞中也容易被降 解，很難實(shí)現(xiàn)抗菌肽的大量表達(dá)；二是抗菌肽具有抗菌作用，表達(dá)宿主，如細(xì)菌或酵母細(xì)胞 表達(dá)的抗菌肽會(huì)反饋性抑制宿主細(xì)胞活性，影響抗菌肽的進(jìn)一步表達(dá)。由此可見(jiàn)，如何進(jìn)一 步提高表達(dá)水平，在高表達(dá)的同時(shí)充分保持抗菌肽的生物學(xué)活性，提高基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn) 定性，設(shè)計(jì)并表達(dá)抗菌活性更強(qiáng)、抗菌譜更廣的抗菌肽等都是值得深入探宄的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種抗菌肽VIP類似肽及其制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在 的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、抗菌活力不足和抗菌譜不廣的局限性。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種抗菌肽VIP類似肽，抗菌肽VIP類似肽為如下氨 基酸序列：
[0006] HSKAVFTKNYTRLRKGjMAVKKYLNS ILN。
[0007] 本發(fā)明所采用的另一種技術(shù)方案是，一種抗菌肽VIP類似肽的制備方法，按照以 下步驟實(shí)施：
[0008] 步驟1、抗菌肽VIP類似肽基因的合成：
[0009] 根據(jù)GeneBank中抗菌肽VIP的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)，將D3、D8替換 為K3、K8,對(duì)其進(jìn)行改良；改良后的氨基酸序列為：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN ;
[0010] 將TrxA與改良抗菌肽VIP進(jìn)行融合表達(dá)，在抗菌肽VIP類似肽的核苷酸序列3' 端添加終止密碼子ΤΑΑ，5'端添加了腸激酶（EnterokinaSe，EK)識(shí)別序列DDDDK，以便融合 蛋白被EK切割，釋放出具有N端無(wú)額外氨基酸的VIP類似肽；使用XhoI和KpnI限制性內(nèi) 切酶構(gòu)建重組質(zhì)粒，在基因兩端分別設(shè)計(jì)了與pET32a(+)XhoI和KpnI位點(diǎn)相同的序列，便 于雙酶切；
[0011] 改良后的核苷酸序列為 119bp ：GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTC ACTAAGAACTACACTCGTCTGCGTAAGCAGATGGCTGTCAAGAAGTACCTGAACTCCATCCTGAACTAACTCGAGC GG，
[0012] 上述序列中：方框顯示分別為XhoI和KpnI酶切位點(diǎn)；下劃線標(biāo)識(shí)為EK識(shí)別序列； TAA為終止密碼子；黑體傾斜部分為VIP類似肽基因序列；
[0013] 為了獲得上述目的基因，由此設(shè)計(jì)合成了 3條引物PU P2和P3,引物擴(kuò)增長(zhǎng)度為 119bp，經(jīng)測(cè)序鑒定說(shuō)明已成功合成該抗菌肽基因；Pl: 5' -GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAG CAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACAC-3' ；
[0014] P2:5'-CCGCTCGAGTTAGTTCAGGATGGAGTTCAGGTACTTCTTGACAGCCATCTG-3' ；
[0015] P3:5' 一CTTCTTGACAGCCATCTGCTTACGCAGACGAGTGTAGTTCTTAGTGAAG-3' ；
[0016] 上述序列Pl和P2中的方框分別表示XhoI和KpnI酶切位點(diǎn)；
[0017] 步驟2、抗菌肽VIP類似肽重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定：
[0018] 對(duì)重疊延伸PCR法（SOE-PCR)擴(kuò)增獲得的基因和pET32a(+)分別同時(shí)進(jìn)行雙酶 切，然后進(jìn)行連接，以將目的基因構(gòu)建到到表達(dá)載體上，獲得的重組質(zhì)?？删幋aTrxA-VIP2 融合蛋白。使用雙酶切連接法構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，按外源基因與質(zhì)粒摩爾數(shù)比為3 :1的比例 進(jìn)行混合，反應(yīng)體系為10uL，16°C過(guò)夜，同樣轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序進(jìn)行鑒定，說(shuō)明 抗菌肽VIP類似肽的表達(dá)載體構(gòu)建成功；
[0019] 步驟3、抗菌肽VIP類似肽對(duì)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)：將融合表達(dá) 質(zhì)粒 PET32-VIP2 轉(zhuǎn)化 E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到 pET32-VIP2/BL21(DE3)重組菌； 重組菌接種至15mL LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，以BL21 (DE3)和pET32a(+)為對(duì)照，按1%接種 量分別接種于30mL新鮮培養(yǎng)基中，吸光度A_達(dá)0. 6左右時(shí)用IPTG誘導(dǎo)（終濃度0. 3mmol/ L)，誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后4h分別測(cè)定A_，分別取適量的菌體量進(jìn)行SDS-PAGE ;
[0020] 步驟4、融合蛋白的純化：
[0021] 培養(yǎng) pET32-VIP2/BL21 (DE3)，誘導(dǎo)表達(dá) 4h 后收集菌體，用 A 液（20mmol/L PBS+0. 5mol/L NaCl, ρΗ8· 0)清洗，8000r/min 離心 5min，重復(fù)清洗 1 次，再以 1:10 的比例 (V :〇D)的比例將菌體重懸于A液，超聲破碎后，4°C 15000r/min離心15min，收集上清液，經(jīng) BeaverBeads?金屬離子螯合磁珠進(jìn)行純化，以含500mmol/L咪挫的洗脫液洗脫，可得到純 化后的融合蛋白TrxA-VIP2 ;
[0022] 步驟5、抗菌肽VIP類似肽的釋放：
[0023] 為獲得改良抗菌肽VIP，需用人工引入的腸激酶切割位點(diǎn)切割融合蛋白 TrxA_VIP2,去除擔(dān)體蛋白，釋放目標(biāo)抗菌肽；將純化后的融合蛋白經(jīng)Sephadex G-25柱脫 鹽和超濾管濃縮后進(jìn)行腸激酶切割，成功釋放重組表達(dá)抗菌肽VIP類似肽。
[0024] 進(jìn)一步的，步驟1中的抗菌肽VIP類似肽基因的PCR反應(yīng)體系為：10XBuffer含 Mg2+5 μ L，dNTP 2. 5mM 4 μ L，引物 P15 μ M 10 μ L，引物 P25 μ M 0· 5 μ L，引物 P35 μ M 10 μ L， pfu 0· 5 yL ;PCR 反應(yīng)條件為：94°C 預(yù)變性 5min ;94°C 30s，60°C 40s，72°C Imin 進(jìn)行 30 個(gè) 循環(huán)；72°C延伸5min ;25°C保存，使用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。
[0025] 進(jìn)一步的，步驟2中轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞的方法如下：從_80°C冰箱中取出 制備好的DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰水浴中；將上述IOuL連接體系加入到 感受態(tài)中，冰浴30min ;42°C水浴脈沖60s，快速移至冰水浴中放置2min，加入500uLLB， 37°C 180rpm搖床培養(yǎng)Ih ;取部分菌液涂布于LB平板（含100ug/mL氨芐青霉素）；37°C倒 置培養(yǎng)12?16h，有單菌落長(zhǎng)出。
[0026] 進(jìn)一步的，步驟5中腸激酶酶切反應(yīng)體系為：10 X重組牛腸激酶反應(yīng)緩沖液5 μ