專利名稱:利用負(fù)股核糖核酸引起植物體細(xì)胞的變化的制作方法
本發(fā)明涉及把重組DNA技術(shù)應(yīng)用于高等植物的遺傳轉(zhuǎn)化或基因工程。特別是,涉及通過(guò)采用負(fù)RNA股引起高等植物體細(xì)胞的變化,以便控制植物的基因表達(dá)或者獲得其他有用的體細(xì)胞效應(yīng),例如抗病性的方法。
目前人們已經(jīng)能夠在體外組建遺傳物質(zhì),即DNA的片段,并將這些片段轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中的質(zhì)粒中。同時(shí)也能夠利用克隆了的片段,或在細(xì)菌質(zhì)粒中克隆完整基因,而質(zhì)粒作為載體可把這些片段或者基因攜入其他細(xì)胞。已經(jīng)獲得合適的載體可用于遺傳上轉(zhuǎn)化各個(gè)植物細(xì)胞,從這些細(xì)胞可以再生出完整未損的植物。有文件表明外源的基因可以穩(wěn)定地插入植物細(xì)胞的基因組內(nèi),從而使完整未損,體細(xì)胞正常并且具有繁殖能力的植物得以重建。K.A.Barton.等。含有基因工程方法獲得的T-DNA的全長(zhǎng)考貝的完整煙草植物的更新,以便將T-DNA傳遞到R1子代,32細(xì)胞1033(1983年4日)。研宄者們報(bào)導(dǎo)他們已經(jīng)能夠?qū)⑼耆耐庠椿蛞胫参锛?xì)胞并在這些植物細(xì)胞中獲得基因的表達(dá),同時(shí)知道并且期望這些細(xì)胞能夠被再生為完整未損的植物中。歐洲專利申請(qǐng)S.N.84302582.2號(hào),1984年4月16日申請(qǐng)(Kemp);PCT申請(qǐng)?zhí)朩O84/02920/和W084/02913,兩者都于1984年1月16日申請(qǐng)(Fraley)。一般地說(shuō),插入的基因只有構(gòu)成位于植物系統(tǒng)的合適的基因控制區(qū)域時(shí)才能在植物中起作用。
目前絕大多數(shù)的用于改變植物的基因工程的方法都包括在細(xì)胞水平上利用天然植物轉(zhuǎn)化因素Agrobacterium tumefaciens,對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行飾變的過(guò)程,而該轉(zhuǎn)化因素具有感染雙子葉植物,并將A.tumefaciens的某一部分DNA(稱為T-DNA)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中去的天然能力。已經(jīng)提出其他的方法,不采用A.tumefaciens,同時(shí)用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物及單子葉植物的個(gè)別細(xì)胞,尤其是原生質(zhì)體。目前許多植物種的基因工程技術(shù)上的主要障礙是,不能順利地從愈傷組織培養(yǎng)物或者原主質(zhì)再生成許多植物種。對(duì)于用目前的技術(shù)可以再生的那些植物種而言,培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化的可導(dǎo)致在完整未損或其他正常植物中完全外源基因的表達(dá)。對(duì)于用目前技術(shù)還不能使之再生的植物種而言,一旦這些技術(shù)被改進(jìn)后,便可實(shí)現(xiàn)對(duì)于這些完整植物種的有規(guī)則的遺傳轉(zhuǎn)化。
一旦能夠用基因工程方法創(chuàng)造一種植物種,接下來(lái)的問(wèn)題便是使植物獲得什么樣的合理的遺傳轉(zhuǎn)化以便使植物按照人們意愿變得更加適于農(nóng)業(yè)或園林應(yīng)用。應(yīng)用于植物的基因工程的一個(gè)共同的方法是把外源性的蛋白基因?qū)胫参?,以使該基因在植物中表達(dá)蛋白質(zhì),該蛋白可以有一種或者多種的用途,例如抗病性,抗昆蟲性,酶促活性,或可用作食物配料等等。
在此敘述的發(fā)明提供一種基因工程技術(shù)在植物方面的應(yīng)用的替代方法,以便使植物獲得體細(xì)胞的有益的變化,該方法不涉及任何外源蛋白表達(dá),取而代之,該方法涉及對(duì)于內(nèi)源蛋白表達(dá)的控制或者對(duì)于某一蛋白基因或其他DNA或RNA因子的操縱,該DNA或RNA因子是通過(guò)外界因素,如疾病因素或感染因素自然導(dǎo)入植物細(xì)胞的。
以前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到人工組建的負(fù)股RNA將在體內(nèi)與互補(bǔ)的RNA雜交。這一現(xiàn)象已用于研宄在大腸桿菌中基因表達(dá)的有規(guī)律的機(jī)制。Mizuno等,在大腸桿菌K-12中小的RNA轉(zhuǎn)錄本(micRNA)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,10 Proc.Japan Acad.59.Ser.B,pp.335-338(1983),Mizuno等,調(diào)節(jié)基因表達(dá)的獨(dú)特機(jī)制由互補(bǔ)RNA轉(zhuǎn)錄本(micRNA)引起的轉(zhuǎn)錄抑制作用,81 Proc.Natl,Acad.Sci.USA,pp.1966-1970(1984)。
本發(fā)明涉及到對(duì)植物進(jìn)行有用的遺傳轉(zhuǎn)化的方法,該方法使植物本身獲得有用的體細(xì)胞變化,而不特別涉及外源蛋白的表達(dá)。該方法包括把為負(fù)股RNA的轉(zhuǎn)錄而構(gòu)成的DNA順序?qū)胫参锘蚪M,這種負(fù)股RNA基本上是內(nèi)源的或天然引入的RNA股的目標(biāo)的互補(bǔ),其功能需要加以抑制以便防止內(nèi)源蛋白基因的表達(dá)或者防止自然導(dǎo)入的RNA或DNA的作用,如通過(guò)某些類型寄生蟲或疾病感染所發(fā)生的那樣。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用基因工程創(chuàng)造不需要引起外源蛋白的表達(dá)而具有有用的體細(xì)胞特性的植物的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種總的控制植物中的內(nèi)源基因表達(dá)的方法。
本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點(diǎn)由下面的詳細(xì)說(shuō)明來(lái)表明。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1表示用于作為本發(fā)明例子之一的起始材料的質(zhì)粒POM5 H2的限制內(nèi)切酶圖。
圖2為煙草花葉病毒的RNA的圖解。
圖3為表示由下面的例1詳述的質(zhì)粒的處理過(guò)程的圖解。
圖4為表示由下面的例1詳述的另一個(gè)對(duì)質(zhì)粒的處理過(guò)程的圖解。
圖5為表明例2詳述的對(duì)質(zhì)粒的處理過(guò)程的圖解。
概要地說(shuō),本發(fā)明描述了通過(guò)采用將DNA順序插入植物基因組以引起特定的負(fù)RNA股的轉(zhuǎn)錄而使高等植物發(fā)生體細(xì)胞變化的總的方法,其中負(fù)RNA股將與選擇的靶RNA股雜交以選擇性地抑制RNA順序的轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄或者靶RNA順序的操縱或功能的發(fā)揮,從而最終引起高等植物體細(xì)胞有用的變化。如果靶RNA股是植物細(xì)胞中正常表達(dá)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本,那么負(fù)RNA股與靶RNA的雜交作用可被直接用于控制(即抑制)內(nèi)源基因的表達(dá)。本發(fā)明也可用于抑制某些發(fā)病過(guò)程,如RNA病毒順序的逆轉(zhuǎn)錄翻譯,或復(fù)制。本發(fā)明提供的負(fù)股RNA已證明可用作調(diào)節(jié)子基因與RNA鏈雜交,否則這些RNA股將在RNA處理中與啟動(dòng)區(qū)或抑制基因作用,或者與其他的調(diào)節(jié)子作用以控制基因的表達(dá)。
在體內(nèi)正常的核條件下,DNA是雙股的,并且DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA是不對(duì)稱的。不對(duì)稱性是指轉(zhuǎn)錄起動(dòng)位于DNA編碼順序的一端,因此有一股,并且只有一股DNA鏈被轉(zhuǎn)錄。據(jù)推測(cè),這樣正常轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的RNA對(duì)有機(jī)體有用的,而被稱為正股RNA。與正股RNA的堿基對(duì)互補(bǔ)的RNA順序被稱為負(fù)股RNA。負(fù)股RNA可以通過(guò)對(duì)被正常轉(zhuǎn)錄的DNA股相對(duì)的那條DNA股進(jìn)行轉(zhuǎn)錄而獲得。由于啟動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)錄起始是不對(duì)稱的,在自然情況下是不會(huì)發(fā)生相對(duì)的DNA股的轉(zhuǎn)錄。因此負(fù)股RNA的創(chuàng)造包括了在雙股DNA順序上以相反或逆方向創(chuàng)造一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(hào)的嵌合基因。
負(fù)股RNA一詞在此處是指被專門組建的DNA順序編碼的一條特定的RNA股,它對(duì)預(yù)先選定的靶RNA具有重要的互補(bǔ)性。負(fù)RNA股的互補(bǔ)部分須足夠的長(zhǎng),以便能在正常的細(xì)胞質(zhì)條件下與所選靶RNA順序發(fā)生順序識(shí)別。順序識(shí)別通常是以正負(fù)股RNA的雜交從而去除正股RNA活性的形式發(fā)生,但也可能包括其他的RNA與RNA的互相作用,這種相互作用起著干擾正股RNA活性的作用。
由于這里所用的負(fù)RNADNA順序是特別組建的嵌合DNA順序,適合于植物轉(zhuǎn)錄載體使植物轉(zhuǎn)化引起植物轉(zhuǎn)錄一條預(yù)先的負(fù)RNA股。負(fù)RNADNA順序需要一個(gè)啟動(dòng)區(qū)以啟動(dòng)負(fù)RNA順序的轉(zhuǎn)錄。盡管轉(zhuǎn)錄是發(fā)生在與通常相對(duì)的DNA股上,轉(zhuǎn)錄本身是正常的。負(fù)RNADNA順序可以包括也可以不可括多聚腺苷酸化成核糖體結(jié)合順序。如果逆向RNA順序是植物細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)的組成,那么多聚腺苷酸化或一些其他型式的3′末端處理或者終端信號(hào)可能是合適的。
本發(fā)明所用的靶RNA是指一段內(nèi)源性的或者天然產(chǎn)生的RNA順序mRNA順序從典型上講是在植物基因組所含有的內(nèi)源基因或組建的基因的表達(dá)過(guò)程所建造的mRNA順序。其他內(nèi)源性RNA順序包括snRNA、scRNA、rRNAt RNA等等。在此所用術(shù)語(yǔ)天然產(chǎn)生的靶RNA順序是指通過(guò)天然生物過(guò)程(如,寄生或疾病)導(dǎo)入植物細(xì)胞的RNA順序。這方面的例子包括病毒RNA及由細(xì)菌原DNA產(chǎn)生的RNA。
在此詳述的本發(fā)明的實(shí)施例是專門涉及到植物及適用于雙子葉植物中表達(dá)的載體。煙草之所以被選為這些例子中的代表系統(tǒng),主要是因?yàn)槟壳澳軌虿捎米鳛楝F(xiàn)有技術(shù)方式之一的,從轉(zhuǎn)化個(gè)別細(xì)胞來(lái)再生植物的方法來(lái)再生煙草植物。用于這里的表達(dá)載體,對(duì)于許多雙子葉植物無(wú)論是在組織培養(yǎng)物或是整株植物中均可使用。因而在此公開的發(fā)明適用于能夠由轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織再生的雙子葉植物,通過(guò)轉(zhuǎn)化個(gè)體細(xì)胞獲得完整未損的雙子葉植物。對(duì)于那些目前還不能再生的植物種類,只要當(dāng)再生技術(shù)有了進(jìn)步,也完全可以應(yīng)用本發(fā)明。此外,文獻(xiàn)中記載,實(shí)際操作表明嵌合表達(dá)載體,適用于某些單子葉植物細(xì)胞,尤其是玉米及谷類,至少適用于它們的組織培養(yǎng)物。因而我們完全有理由預(yù)期,當(dāng)這些植物的再生技術(shù)得以解決后,這些載體也同樣地適用于整株單子葉植物。因而本發(fā)明適用于雙子葉植物,也適用于單子葉植物。本發(fā)明的目的是利用負(fù)RNA股的活性使再生的整株植物及其子代發(fā)生體細(xì)胞的變化。這種體細(xì)胞變化可以是形態(tài)學(xué)方面的,例如當(dāng)一個(gè)內(nèi)源性基因的表達(dá)被抑制時(shí)表現(xiàn)出來(lái)的,體細(xì)胞的變化也可以僅當(dāng)植物受到例如疾病、干旱或其他不利情況的挑戰(zhàn)時(shí)才表現(xiàn)出來(lái)。
參閱以下的例子可以更好地理解本發(fā)明,這些實(shí)例旨在舉例,并不限于這些例子。
例1抗病性煙草花葉病毒RNA本例針對(duì)由煙草花葉病毒侵入而引起的細(xì)胞的疾病過(guò)程的抑制作用。煙草花葉病毒(TMV)是一種植物正股RNA病毒,其RNA在感染細(xì)胞的發(fā)病過(guò)程的某階段被翻譯及復(fù)制。TMW的正股RNA被注射至受感染的植物細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)。然后,正股RNA上的兩個(gè)基因被翻譯而產(chǎn)生兩種蛋白質(zhì)產(chǎn)物,這兩種蛋白產(chǎn)物反過(guò)來(lái)觸發(fā)產(chǎn)生TMVRNA的負(fù)股補(bǔ)體?;パa(bǔ)股作為正鏈復(fù)制的模板,于此同時(shí),兩個(gè)以上的亞染色體正股RNA被翻譯為其他一些蛋白質(zhì),外殼蛋白質(zhì)是其之一。復(fù)制的正股RNA被外殼蛋白色裹而形成新的TWV病毒。
本例的方法是轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞,使之轉(zhuǎn)錄負(fù)RNA股,并與靶RNA雜交,在此例中,靶細(xì)胞即為TMVRNA本身(正股)。通過(guò)雜交而有效地中和靶TMVRNA,因而該靶TMVRNA不會(huì)被TMV宿主復(fù)制或者翻譯。通過(guò)這樣的方式,增強(qiáng)植物對(duì)煙草花葉病毒感染的抵抗力,并且誘發(fā)植物產(chǎn)生相似的各種抵抗力,如抗病毒感染或任何疾病,包括在植物宿主細(xì)胞中的病原體核酸的影響。
本發(fā)明已描述的質(zhì)粒,包含有一段從煙草花葉病毒RNA上的一大部分上反向轉(zhuǎn)錄的cDNA順序。該質(zhì)粒稱為POM5 H2(Meshietal,Virolgy,118∶64-65(1982))。圖1表示了POM5 H2質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶圖。圖2表示了POM5 H2cDNA順序與整個(gè)TMVRNA的關(guān)系。cDNA片段長(zhǎng)度大約為二干堿基,從完整病毒順序的3′末端開始,大約占完整病毒順序的1/3c.cDNA順序包括3′非編碼區(qū),據(jù)報(bào)導(dǎo)該區(qū)域在其他獨(dú)特的相似病毒中具有專一的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,而這些特征對(duì)于感染細(xì)胞中的病毒復(fù)制是必不可少的(Ahlquist et al.,Plant Mol.Biol.3∶37-44(1984)),很明顯,用限制性核酸內(nèi)切酶PstⅠ,可以從由質(zhì)粒組建方法確定的質(zhì)粒POM5 H2的限制性位點(diǎn),及從TMV順序的其他cDNA克隆得到的TMV順序,水解得到完全的cDNA插入片段,由此,該插入片段被完整地從質(zhì)粒上切下來(lái)。另外,用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ水解質(zhì)??梢缘玫綆讉€(gè)片段。HinfⅠ水解片段中的一段被稱為HinfⅠB片段(如圖1如末),代表煙草花葉病毒基因組的第5698核苷酸至6365核苷酸的順序,該順序含有外殼蛋白質(zhì)編碼區(qū)域,11個(gè)核苷酸的5′末端的非編碼區(qū)及位于編碼區(qū)3′端的非編碼的重要順序的一部分(203堿基對(duì)中的174堿基對(duì))。因而可以采用兩種可供選擇的技術(shù)從載體pOM5 H2中得到負(fù)RNA股,用于抑制TMV病毒對(duì)宿主植物細(xì)胞的侵害。技術(shù)之一是引起PstⅠ碎片的負(fù)轉(zhuǎn)錄本的重建,該負(fù)轉(zhuǎn)錄本是二千堿基的負(fù)股,該負(fù)股與細(xì)胞中的病毒RNA的三分之一相雜交。另一技術(shù)采用Hinf ⅠB碎片引起外殼蛋白質(zhì)編碼區(qū)的負(fù)轉(zhuǎn)錄本的重組,并與病毒RNA的外殼蛋白部份或與蛋白合成過(guò)程中外殼蛋白的mRNA雜交。下向?qū)?duì)這兩種技術(shù)進(jìn)行描述。
外殼蛋白質(zhì)負(fù)RNA股由HinfⅠ水解POM5 H2得到的Hinf ⅠB碎片可以通過(guò)電泳HinfⅠ水解物質(zhì)而分離。碎片再用T4DNA聚合酶處理,以產(chǎn)生一種鈍端的碎片。產(chǎn)生的片段通過(guò)其上的鈍端與預(yù)先用Hinc Ⅱ水解的質(zhì)粒PUC12連接在一起。該鈍端連結(jié)的產(chǎn)物為一個(gè)包含POM5 H2 Hinf ⅠB碎片的,其側(cè)面具有若干獨(dú)特的限制性位點(diǎn)的質(zhì)粒PCMC1050。圖3概要地說(shuō)明這一過(guò)程。
重組體質(zhì)粒PCMC1050隨后用限制性內(nèi)切酶PstⅠ及BamHⅠ水解產(chǎn)生兩個(gè)片段,選擇并分離出其中較少的片段,并與PCMC66相連結(jié)。質(zhì)粒PCMC66是一個(gè)中間表達(dá)載體,含有啟動(dòng)區(qū)順序及取自A.tumefaciens的藍(lán)曙紅(nopaline)合酶的聚腺苷酸順序,該載體可用于植物,插入在啟動(dòng)區(qū)的聚腺苷酸順序鄰近位子有一些有用的獨(dú)特的限制性位點(diǎn)的載體。載體PCMC66預(yù)先用PstⅠ及BglⅡ水解。質(zhì)粒連結(jié)后稱為PCMC1054,通過(guò)連接將TMVHinf ⅠB片段攜入,并位于藍(lán)曙紅(nopaline)合酶啟動(dòng)區(qū)及聚腺苷酸順序的閱讀方向相關(guān)的相反定向上。PCMC1054中的Hinf ⅠB片段的定向是受位于片段左端的限制性部點(diǎn)的支配,該限制位點(diǎn)只允許以需要的反向定位與預(yù)先水解的PCMC66進(jìn)行連接。相反地,也就是說(shuō),正常的TMV片段的閱讀方向與正常的宿主載體的啟動(dòng)區(qū)及聚腺苷酸順序的轉(zhuǎn)錄方向的定位是相反的。質(zhì)粒PCMC1054為中間的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)組建而能轉(zhuǎn)錄負(fù)RNA股,與TMV基因組外殼蛋白質(zhì)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄的靶RNA互補(bǔ)。此外該載體轉(zhuǎn)錄的負(fù)RNA股也含有一段與TMV基因組的3′非編碼區(qū)互補(bǔ)的區(qū)域。為了制備中間表達(dá)載體PCMC1054,以轉(zhuǎn)入植物基因組,該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SalⅠ水解,轉(zhuǎn)移載體PCMC92也同樣用SalⅠ水解。該轉(zhuǎn)移載體PCMC92含有A.tumefaciens的Ti一質(zhì)粒中的T-DNA邊緣區(qū),還包含一個(gè)卡那霉素抗性編碼基因(APH3′Ⅱ),該基因可在植物及植物細(xì)胞中起作用能夠選擇具有卡那霉素抗性的植物細(xì)胞,轉(zhuǎn)化DNA吸收入植物細(xì)胞,并且能夠進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)。T-DNA邊緣區(qū)在圖3-5中用箭頭表示。圖中還指明RB(右一邊緣)及LB(左一邊緣)。質(zhì)粒PCMC92在APH3′Ⅱ基因上游還包括一系列的限制性位點(diǎn)(SstⅠ,SmaⅠ/XmaⅠ,BamHⅠ,XbaⅠ,SalⅠ)。PCMC92的APH3′Ⅱ基因包括一個(gè)合適的啟動(dòng)區(qū)(藍(lán)曙紅(nopaline合酶)及終止順序(也為藍(lán)曙紅(nopaline)合酶)。此兩片段連接在一起形成植物表達(dá)載體,稱為PCMC1060,如圖3下部所示。表達(dá)載體PCMC1060包含一個(gè)抗生素抗性基因(APH3′Ⅱ)及一個(gè)組成藍(lán)曙紅(nopaline)合酶(Nos)啟動(dòng)區(qū)和聚腺苷酸順序的表達(dá)盒(cassette),位于TMV順序,包括外殼蛋白編碼區(qū)的逆向定位。此外,該載體當(dāng)然含有Ti質(zhì)粒T-DNA的A.tumefaciens邊緣區(qū)。
確定了PCMC1060的結(jié)構(gòu)之后,將含有質(zhì)粒的大腸桿菌與A.tumefaciens菌株LBA4404連接,優(yōu)先選擇A.tumefaciens結(jié)合體,因?yàn)槠渲泻蠵CMC1060質(zhì)粒。然后,將A.tumefaciens菌株通過(guò)現(xiàn)有的莖桿接種技術(shù)轉(zhuǎn)化的Havana425種的煙草組織。經(jīng)莖桿接種轉(zhuǎn)化煙草植物細(xì)胞選用組織培養(yǎng),選擇卡那霉素抗性的細(xì)胞。接著對(duì)得到的培養(yǎng)物進(jìn)行測(cè)定,證明表達(dá)了抗生素抗性標(biāo)記物(氨基糖苷3′磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ)表示的基因。培養(yǎng)物可成功地測(cè)定上述的轉(zhuǎn)化標(biāo)記蛋白,并且利用規(guī)范技術(shù)這些轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞的愈傷組織培養(yǎng)物可以再生為完整的植株。
按上述的方法,PCMC1060轉(zhuǎn)化而得到再生煙草植物中的十株,用煙草花葉病毒進(jìn)行試驗(yàn)。采用常規(guī)方案,用普通的TMV品系對(duì)這些煙草植物進(jìn)行接種。病毒混入緩沖溶液。細(xì)小的剛玉作為研磨劑與病毒相混和。將紗布浸入這種研磨剖/病毒混合物中,然后用紗布揩煙草植物的半片葉子。用實(shí)驗(yàn)的方法調(diào)節(jié)緩沖液病毒含量密度,直到它處于這樣的水平,即在對(duì)照的非轉(zhuǎn)化的Hewana425煙草中各片葉子產(chǎn)生大約100個(gè)病斑。這一病毒密度大約相當(dāng)于可以目視的密度。每株植物上接種幾片葉子。TMV病毒一般使Havanna煙草植物宿主產(chǎn)生局部損傷,表明TMV感染導(dǎo)致了局部的損傷。因而用TMV接種后,查清產(chǎn)生的病斑的總數(shù)目及大小,以此衡量植物對(duì)TMV的抗性。對(duì)于24株再生的轉(zhuǎn)化植物,用上述方法接種,大多數(shù)的損傷數(shù)與對(duì)照植物差不多,即每片葉子大約有100個(gè)損傷??梢灶A(yù)期轉(zhuǎn)化植物中的嵌合基因的表達(dá)的有效性是由于嵌合基因插入植物基因組的隨機(jī)性而有很大的變化。其中8株對(duì)于接種的反應(yīng)非同一般,表明對(duì)病毒感染的抵抗水平相當(dāng)高。這8株煙草植物的病斑數(shù)目平均為對(duì)照植物的十分之一(即大約為10個(gè)病斑),這就表明了此8株再生植物有對(duì)TMV的抵抗力。經(jīng)過(guò)繁殖,目前正在對(duì)這些再生植物進(jìn)行繁殖以驗(yàn)證一特性是否可以遺傳。
TMV的另一負(fù)股RNA一個(gè)類似的方法也用于處理POMC5 H2的PstⅠ片段。質(zhì)粒POM5 H2用PstⅠ水解,得到的較小的那個(gè)片段被連接到預(yù)先也用PstⅠ水解的表達(dá)質(zhì)粒PCMC66上。通過(guò)這一方法,所獲得的兩個(gè)質(zhì)粒,僅僅是在與PCMC66宿主部分有關(guān)的TMV片段的空位方向上有所不同。這兩個(gè)質(zhì)粒稱為PCMC1052及PCMC1053。對(duì)兩個(gè)質(zhì)粒都作了限制性圖,并證明PCMC1052攜入的TMV片段位于(nopaline)藍(lán)曙紅合酶啟動(dòng)區(qū)及聚腺苷酸順序有關(guān)的相反空位上。換而言之,啟動(dòng)區(qū)是在與基因的正常閱讀方面的相反空位上,因此基因轉(zhuǎn)錄時(shí)能產(chǎn)生天然病毒RNA股互補(bǔ)的負(fù)股RNA。
一旦獲得PCMC1052,對(duì)其的操作方法與上述的用于PCMC1050的是一樣的。用PCMC1052及其子代代替了PCMC1050及其子代。所獲得的轉(zhuǎn)化植物再生后,用類似于上述的用于PCMC1060轉(zhuǎn)化植物的方法來(lái)進(jìn)行分析。
例2內(nèi)源基因表達(dá)的抑制作用一藍(lán)曙紅(nopaline)合酶為了顯示抑制內(nèi)源性基因表達(dá)的能力,煙草病毒經(jīng)選擇使其攜帶藍(lán)曙紅(nopaline)合酶(Nos)的內(nèi)源性基因。此基因在正常情況下不存在于煙草植物中,為了獲得能夠通過(guò)一般的基因遺傳方式將完整的藍(lán)曙紅(nopaline)合酶基因傳遞給子代的,機(jī)體正常的具有繁殖能力的,穩(wěn)定的煙草植物,再將此基因通過(guò)基因操作方法導(dǎo)入煙草植物。(Barton et al.,Cell 32∶1033-1043(1983))因而,為了說(shuō)明這樣一個(gè)原理,不妨認(rèn)為該基因及其表達(dá)是內(nèi)源性的。為顯示對(duì)此代表性的內(nèi)源性基因表型表達(dá)的抑制,組建了一條嵌合基因,該嵌合基因合成的負(fù)RNA股與位于藍(lán)曙紅合酶信使RNA(mRNA)中部的一大段互補(bǔ)。該嵌合基因組建后,導(dǎo)入取自被稱為HADH植物品系的細(xì)胞的基因組中。
組建嵌合入基因及質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至上述基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的過(guò)程示于圖5。藍(lán)曙紅合酶基因片段,通過(guò)使用claⅠ及SphⅠ共同水解質(zhì)粒PCMCⅠ而獲得。通過(guò)電泳將此片段從其他基因片段中分離出后,連結(jié)到預(yù)先已用AccⅠ及SphⅠ水解過(guò)的質(zhì)粒pUC18上。連結(jié)后的產(chǎn)物稱為pUCNos,位于幾個(gè)有用的質(zhì)粒獨(dú)特的限制位點(diǎn)旁側(cè),含有藍(lán)曙紅合酶基因片段。位于質(zhì)粒上的藍(lán)曙紅合酶基因?yàn)槠淇傞L(zhǎng)度的一半以上。
然后用HindⅢ和SmaⅠ水解質(zhì)粒pUCNos得到兩個(gè)片段,選用其中較小的片段。該片段以特殊的取向方式連接到預(yù)先經(jīng)HindⅢ及SmaⅠ水解的表達(dá)載體PCMC60相連結(jié),從而獲得與Nosm RNA互補(bǔ)的負(fù)股RNA的中間表達(dá)盒(cassette),稱為PCMC60Nos質(zhì)粒PCMC60Nos用XhoⅠ水解以獲得轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體。獲得的片段連接到兩個(gè)載體,PCMC91及pCMC92上,而這兩個(gè)載體預(yù)先都已用SalⅠ水解過(guò)。因?yàn)閷?duì)這兩個(gè)載體的每一個(gè),Nos基因都可以有兩個(gè)不同的插入方向,因而產(chǎn)生了四個(gè)轉(zhuǎn)移載體,分別稱為91Nos RA,91Nos RB,92Nos RA,92Nos RB,其中91及92是指用于組建的轉(zhuǎn)移載體。符號(hào)A及B是指與顯性的選擇標(biāo)記物(卡那霉素抗性基因-APH3′Ⅱ)有關(guān)的表達(dá)盒(cassette)產(chǎn)生的Nos負(fù)RNA股的兩種可能的定向。
在HADH品種的煙草植物莖干上進(jìn)行接種,選擇使轉(zhuǎn)化株具有卡那霉素抗性,如上的例1所述。獲得了轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)物,并且確證了通過(guò)插入偏碼Nos基因的負(fù)RNA股的基因而使之轉(zhuǎn)化的推斷。對(duì)所有這些培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)有藍(lán)曙紅產(chǎn)物。
按照以專利手續(xù)及管理為目的的國(guó)際公認(rèn)的微生物存放的布達(dá)佩斯條約,下例的質(zhì)粒存放于美國(guó),MD,Rockville,American Type Culture Collection(ATCC),按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)保存這些質(zhì)粒,并且可以提供之。但是根據(jù)各國(guó)的專利法,可以提供并不意味著可以實(shí)施本發(fā)明及侵犯已授與的權(quán)力。
對(duì)于存放的質(zhì)粒,給于ATCC有存放號(hào)。上述質(zhì)粒也由美國(guó)加利福尼亞州,埃默里維爾市Cetus公司的Master Culture Colletion(CMCC)存放,并且給于CMCC存放號(hào)。
質(zhì)粒 CMCC存放號(hào) ATCC存放號(hào)PCMC1in E.Coli MM294 1985 39641PCMC92in E.Coli 2306 53093PCMC91in E.Coli 2307 53094PCMC1060in E.Coli 2401 53243PCMC1061in E.Coli 2400 53242上面所列的存放著的質(zhì)粒PCMC1060及PCMC1061,除用于發(fā)明人在此所舉的實(shí)施例外,也可以針對(duì)其他的靶RNA股,在實(shí)施本發(fā)明公開的方法時(shí)用作載體。例如,最簡(jiǎn)單地,可以用SalⅠ水解質(zhì)粒PCMC1061得到兩個(gè)小的質(zhì)粒,PCMC1052及PCMC92,以實(shí)現(xiàn)與圖4最后一步的相反步驟??梢酝ㄟ^(guò)用PstⅠ水解PCMC1052可回收質(zhì)粒PCMC66,然后PCMC66及PCMC92兩個(gè)質(zhì)??捎糜谌魏尉幋a靶RNA的DNA順序,所編碼的靶RNA關(guān)系到組建一個(gè)在植物細(xì)胞中引起所需負(fù)股RNA的轉(zhuǎn)錄的表達(dá)及轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
權(quán)利要求
1.一種引起高等植物體細(xì)胞變化的方法,本發(fā)明的特征在于所述的方法包括下述步驟;將一段能導(dǎo)致與靶RNA充分互補(bǔ)的負(fù)股RNA的轉(zhuǎn)錄的DNA順序?qū)胫参?,以使?fù)股RNA有效地結(jié)合到靶RNA股以抑制體內(nèi)靶RNA股的活性。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法,其特征在于所述的靶RNA股為信使RNA,內(nèi)源性蛋白的表達(dá)活性被抑制。
3.如權(quán)利要求
1所述的方法,其特征在于所述的靶RNA股至少是病原體RNA的一部分。
4.如權(quán)利要求
3所述的方法,其特征在于所述的靶RNA股是煙草花葉病毒的RNA。
5.如權(quán)利要求
1所述的方法,其特征在于所述的將DNA順序?qū)胫参锏牟襟E包括下述步驟;在細(xì)菌中組建一個(gè)表達(dá)載體質(zhì)粒,包括一個(gè)通常能用于植物細(xì)胞的啟動(dòng)區(qū)及一段至少部分編碼位于啟動(dòng)區(qū)3′的靶DNA的DNA順序,DNA順序的取向與啟動(dòng)區(qū)的正常閱讀方向相反;用來(lái)自表達(dá)載體質(zhì)粒的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的植物細(xì)胞,使得轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄負(fù)RNA股,并且使轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生,形成整株植物。
6.如權(quán)利要求
5所述的方法,其特征在于所述的轉(zhuǎn)化步驟包括下述步驟用表達(dá)載體宿主與A.tumefaciens結(jié)合;選擇A.tumefaciens轉(zhuǎn)結(jié)合體;并用選擇的A.tumefaciens感染植物細(xì)胞。
7.一種正常形態(tài)的植物,特征在于所述的植物的細(xì)胞的基因組含有一段嵌合DNA順序,該嵌合DNA順序可導(dǎo)致與靶RNA股充分互補(bǔ)的負(fù)RNA股的轉(zhuǎn)錄,因而負(fù)RNA股將專門與靶RNA股聯(lián)合從而抑制植物細(xì)胞中靶RNA股的活性。
8.如權(quán)利要求
7所述的植物,其特征在于所述的靶RNA股為一段信使RNA,并且抑制的是植物細(xì)胞中內(nèi)源性基因的表達(dá)活性。
9.如權(quán)利要求
7所述的植物,其特征在于所述的靶RNA股至少為病毒RNA的一部分。
10.如權(quán)利要求
7所述的植物,其特征在于所述的植物細(xì)胞中的嵌合DNA順序包括一個(gè)通常可用于植物細(xì)胞的啟動(dòng)區(qū);及一段位于啟動(dòng)區(qū)的3′處的DNA編碼順序,至少為靶DNA股的一部分編碼DNA順序,其定位與啟動(dòng)區(qū)正常閱讀方向相反。
11.如權(quán)利要求
10所述的植物,特征在于所述的嵌合DNA順序還包括一段可用于植物的、位于轉(zhuǎn)錄順序3′處的聚腺苷酸順序。
12.權(quán)利要求
7所述一種植物所產(chǎn)生的種子。
13.權(quán)利要求
8所述的植物所產(chǎn)生的種子。
14.權(quán)利要求
9所述的植物所產(chǎn)生的種子。
15.一個(gè)可用于植物的嵌合基因的組建過(guò)程,其特征在于,所述的組建過(guò)程包括一般可用于植物細(xì)胞的啟動(dòng)區(qū)順序;及一段位于啟動(dòng)區(qū)3′處的DNA編碼順序,至少為植物細(xì)胞中有正常活性的靶RNA股的一部分編碼,DNA編碼順序的取向與啟動(dòng)區(qū)正常轉(zhuǎn)錄方向相反,而使嵌合基因致導(dǎo)至少與靶RNA鏈部分互補(bǔ)的負(fù)股RNA的轉(zhuǎn)錄,從而抑制植物體內(nèi)靶RNA股的活性。
16.如權(quán)利要求
15所述的嵌合基因,其特征在于所述的嵌合基因還包括一段一般可用于植物的位于DNA編碼順序的3′處的聚腺苷酸順序。
專利摘要
公開一種方法,該方法通過(guò)在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄與靶RNA股充分互補(bǔ)的負(fù)RNA股,使植物體細(xì)胞發(fā)生有益的變化。靶RNA股可以是基因表達(dá)中轉(zhuǎn)錄的mRNA、病毒RNA或是植物細(xì)胞中存在的其他RNA。負(fù)RNA股至少與靶RNA股部分互補(bǔ),從而抑制其在植物體內(nèi)的活性。
文檔編號(hào)A01H5/00GK86107039SQ86107039
公開日1987年4月15日 申請(qǐng)日期1986年10月16日
發(fā)明者弗朗西斯·麥克科米科, 肯尼思·A·巴頓, 威廉·F·史惠恩 申請(qǐng)人:阿格拉塞特斯導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan